蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

要約

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明その場でハイブリダイゼーション（FISH）。

要約

in situハイブリダイゼーション（FISH）法における蛍光は1つが、ネイティブの細胞環境中の核酸を検出することができます。ここでは、単一の酵母細胞内のmRNAの数を定量化するためにFISHを使用するためのプロトコルを提供する。細胞は、関心のある任意の条件で増殖させ、次いで固定し、透過性にすることができる。その後、蛍光色素に結合した複数の一本鎖のデオキシオリゴヌクレオチドは、mRNAをラベルし、可視化するために使用されています。単一のmRNA分子からの回折限界の蛍光は細胞あたりのmRNAの数を識別し、カウントするスポット検出アルゴリズムを使用して定量した。ノーザンブロット、RT-PCRおよび遺伝子発現マイクロアレイのより標準的な定量法は、バルク集団における平均のmRNAの情報を提供しながら、魚は単一分子分解能で単一細胞内の計数およびこれらのmRNAの局在の両方を容易にします。

概要

バルク測定技術を用いて、単一の細胞内アッセイ転写物又は転写活性の数を¹に不可能である。ある程度まで、この問題に対処することができる遺伝子発現の記者として関心のあるプロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を使用したが、折り蛍光タンパク質に要する時間が早いダイナミクスを不明瞭。長命の蛍光タンパク質はまた、mRNAの寿命を報告することはできません。 FISH法は単一分子分解能で、核内の転写開始から単一細胞内の後続の成熟および減衰に、その完全なライフサイクルの間に測定mRNAに使用することができる。

核酸を可視化するための現場実験の元は、DNAの要素を調べるために放射性標識RNAプローブを使用していました。これらはカエルアフリカツメガエル²及びマウス組織³でサテライトDNAの卵巣でリボソームDNAを可視化が含まれています。 現場 exper における第1の蛍光imentは、特定のDNA配列^4を調べるために蛍光体が付いているRNA分子を使用していました。 in situで RNAを可視化するための蛍光プローブの最初のアプリケーションは、ニワトリ筋肉組織培養⁵におけるアクチン遺伝子発現の可視化であった。最近では、出芽酵母において、FISHは、酵母代謝サイクル^6、細胞周期の進行^7、および有糸分裂の間に⁸ mRNA転写物の空間的局在の間のmRNAの減衰の間に転写振動を調査するために使用されている。 FISHは、すべての酵母遺伝子の半分以上を構成する構成的に転写された遺伝子で無相関変動は、無相関転写開始⁹から生じることを示すために、酵母において使用されている。非酵母種において、FISHは、マウスの腸¹⁰における幹細胞のマーカーを同定し、細胞運命の不完全な浸透度を決定するために使用されているC.における確率遺伝子発現の変動に起因することができ虫の胚^11。

ここで説明したFISH法は、メッセージをmRNAに色素標識、一本鎖DNAプローブをハイブリダイズすることによって動作する。細胞は、画像化され、mRNAはスポット検出アルゴリズムを使用してカウントされます。一本鎖プローブはDNA合成機を用いて生成した後、ラベル（歌手プローブとしてここと呼ばれる）またはプレ標識プローブ（ステラリスプローブ^）12,13として商業的に発注することができる。シンガーとステラリスプローブ間の主な違いは、ステラリスプローブようラジらによって記載プローブごとに1つだけのラベルを持つ（〜20 bpの）短いながら歌手プローブが長い（〜50塩基対）とマルチラベルが付いていますということです^14。さらに、ステラリスアプローチはシンガー（それぞれ1遺伝子あたり〜30対5プローブ）のそれよりも遺伝子あたりより多くのプローブを使用しています。以下では、プローブのいずれかのタイプの使用について説明プロトコルを提供する。第2節では、アミノアリルチミジン含有プローブワット標識するためのプロトコルを提供選択したCyの染料i番目。単一のmRNAスポットを識別するために必要な計算ステップの概要は、セクション7に設けられている。

プロトコル

図1および図2は、FISHの実験手順とFISH像を定量化するために用いられる画像解析パイプラインの概略図である。

1。準備するためのソリューション

以下*ソリューションは歌手プローブで使用するためのものです。ステラリスプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄バッファーの両方で、 "10％ホルムアミド"と "40％ホルムアミド"を交換してください。ステラリスプローブを用いたハイブリダイゼーションバッファーに追加の変更（1）1グラムデキストラン硫酸を追加している、（2）10mgを一本鎖DNAを含んでいません。

バッファーB

8ミリリットル1 M KH ₂ PO ₄
41.5ミリリットル1M K ₂ HPO ₄
ソルビトール109.3グラム

Spheroplastingバッファ

890μlのBuffer B
100μlのVRC
10μlの25,000 U / mlのリチカーゼ
2μlのβ-メルカプトエタノール

のハイブリダイゼーション緩衝液（10ミリリットル、最終容量）

10 mgのE.大腸菌のtRNA
10mgを一本鎖DNA *
100μlの200mMのVRCの株式
50 mg / mlのBSA40μlの
1ミリリットル20X SSC
4ミリリットル40％ホルムアミド*
ヌクレアーゼフリー水（10mlの最終体積まで）
1グラムデキストラン硫酸*

*ハイブリダイゼーション緩衝液は、便宜上-20℃で0.5ミリリットルのアリコートに維持することができる。

（50ミリリットル、最終容量）バッファを洗う

5ミリリットル20X SSC
20ミリリットル40％ホルムアミド*
ヌクレアーゼフリー水（50mL最終容量）

ラベルバッファ

1.06グラムの炭酸ナトリウム
100ミリリットルDEPC水
pHが9

2。プローブ標識（歌手プローブのみ）

私たちは、ABIのオリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内の合成によってこれらのプローブを得る。 Typic同盟国は、4-5〜50塩基対のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも10 8、+ BP離隔いくつチミジン用アミノアリルチミジンを代入し、目的の遺伝子と相同であることを合成される。 CY染料を使用している場合があるためオゾンに対する感受性のため、私たちは、オゾンフリーの施設で働いています。

1. 〜5プローブを取得し、100μlの水に懸濁し - ナノドロップのチェック濃度。
2. どのように多くのプローブ/遺伝子に応じて、10μgのオリゴヌクレオチド/遺伝子（ 例えば 5プローブ/遺伝子を持っている場合は、2μgの/プローブしたい）との合計配合しています。
3. QIAクイックヌクレオチド除去キットプロトコルに従ってプローブを精製するQIAクイック列を使用します。
4. 複合プローブとミックスの総容積に10倍量のバッファーPNを追加します。
5. QIAクイックカラムにサンプルを適用 - 総容積は、2回のスピンでボリュームの半分を使用してスピンダウンし、750μlのよりも大きい場合
6. 1分間放置。
7. 6,000 rpmで1分間遠心します。
8. 750μlのBuffer PEで洗浄。
9. 遠心6,000 rpmで1分。
10. 乾燥するために13,000 rpmで1分間フロースルーと再スピンカラムを廃棄してください。
11. H ₂ OのpHは7.0〜8.5の範囲内であると、膜上に直接配置されていることを確認します-新しいマイクロチューブ及び50μlのH ₂ Oで溶出したDNAに置きQIAクイック列。
12. 1分間放置。
13. DNAを溶出するために13,000 rpmで1分間遠心します。
14. 45℃でDNAを凍結乾燥
15. 10μlのラベルバッファ内のペレットを再懸濁しと染料に触れることなく、染料のチューブに加える。
16. 別の10μlのラベルバッファーで繰り返します。
17. ボルテックスと色素とDNAのチューブをスピンダウン。
18. アルミホイルでチューブをカバーし、ラベルにRT O / N暗所で保管してください。
19. QIAクイックヌクレオチド除去キットプロトコルを繰り返します。 2つの違いを実行します。
    - プローブに200μlのPNバッファを追加して、2倍のカラムを通して標識プローブを置く。
    - 溶出前にアタッチされていない染料を洗い流すために、バッファPEで3回洗浄を行います。
20. AFター溶出光度計を経由して濃度を得る。標識効率は、典型的には一本鎖DNAの約0.25ピコモル/ NGである。

3。カバースリップの準備

1. プラズマpreen、修復真空室（内スライドの上に置いてカバースリップhttp://www.plasmapreen.com/ ）（良い中心に近い）。
2. 電子レンジで真空チャンバーを入れて、それが密閉されていることを確認します。
3. ポンプの電源をオンには、まず、ポンプが起動され、一度だけ真空をオンにします。
4. 電子レンジの電源をオンにして、プラズマが表示されている後5秒停止。
5. その後、ポンプを真空の電源をオフにします。
6. 真空チャンバーを引き出し、鉗子（再び洗浄する必要が下落しているもの）でカバースリップを削除します。
7. 場所カバースリップは、12ウェルプレートで側をクリーンアップ。

4。固定手順

1. 最少培地に0.1〜0.2程度のOD ₆₀₀に酵母を育てる。細胞の10mlを十分にFOを生成R〜10別ハイブリダイゼーション。
2. 増殖培地（培養10mlの+ 1ミリリットル37％ホルムアルデヒド）に直接1/10の容積37％ホルムアルデヒドを追加し、45分間放置します。
3. マイクロ遠心チューブ（1分間13,000 rpmで回転することができます）で、1mlの氷冷緩衝液Bで2倍洗う。
4. spheroplasting緩衝液1mlを加える。
5. 15分間37℃でインキュベートする。ほとんどの細胞（ すなわち位相明るくない）黒になるまで細胞を顕微鏡下で数分ごとにチェックしてください。
6. 低速（〜3,500 rpm）で回転し、氷冷緩衝液Bで2倍洗う。
7. 、70％エタノール1 mlを加え穏やかに再懸濁します（-20℃で無期限に保存することができます）4℃で一晩おきます。

5。ハイブリダイゼーションの手順

1. ハイブリダイゼーション溶液を準備します。ハイブリダイゼーション緩衝液を100μlに、プローブの1-3μlを添加し、その後ボルテックスと遠心。歌手プローブはプローブセット当たり8-10 ngの合計（ つまり当たり遺伝子）を使用します。我々は3 DIFと同時に3遺伝子にまでイメージしていますferent標識プローブセット。

それを開く前に室温にハイブリダイゼーション溶液を温めるようにしてください。

ステラリスプローブの場合、それは1が最適であるかを確認するためのプローブの希釈作業1:10 1:20 1:50 1:1001μlのそれぞれを追加することで、4つの別々のハイブリダイゼーション反応を開始することをお勧めします。ステラプローブの作業希釈物をハイブリダイゼーション緩衝液中で調製される。

2. 遠心分離機（後続のすべてのステップのために、3,500 rpmで、5分）で固定した細胞（ 例えば 200μl）を、エタノールを取り除く吸引。
3. 穏やかにハイブリダイゼーション緩衝液と同じ割合ホルムアミドを含有する、1mlの洗浄緩衝液中で再懸濁する。 2-5分間放置。
4. サンプルを遠心分離し、洗浄緩衝液を吸引し、ハイブリダイゼーション溶液を追加します。穏やかに振盪し、37℃でO / N°Cで、暗所でインキュベート

注：次の手順では、カバーガラス上の細胞を適用/イメージングのためのものです。のw代替の活性酸素種のスカベンジャー溶液が見含む96ウェルプレートに細胞をアッシング/イメージングhttp://www.biosearchtech.com/stellarisprotocolsた。

5. 翌日、 又は予め 、クリーン（手順を参照）と5分間、150μlの0.01％ポリ-L-リシンでカバースリップを扱う。吸引、のdH ₂ Oで3回洗浄し、乾燥させ、乾燥させます。
6. 午前中は、サンプルに洗浄緩衝液1mlを加え軽く懸濁し、遠心分離や吸引、その後30分間37℃で洗浄バッファーとインキュベートの別1mlに再懸濁します。
7. シェーカー上でRT 15分で2X SSC + 0.1％トリトンX-100で洗浄する。
8. それをマウントする前にRTに考え出すことができるように冷凍庫の封入剤を取り出します。
9. シェーカー上でRT 15分で1X SSCで洗浄する。
10. 150μlのPBSにDAPI（最終は0.1μg/ ml）を再懸濁し、細胞を希釈する。
11. 洗浄/ポリのLys-トリートメントルーム、ドラッグプレースソリューション12ウェルプレートでのテッドカバースリップ、邪魔されずに少なくとも30分間。
12. 溶液を除去します（バックアップとして予備のカバースリップの上に置くことがあります）し、1ml 1X PBSで3回洗浄する。
13. スライド上にゴールドマウンティング培地を延長の代わりに3液（インビトロジェンP36934）。あなたはメディアをマウントするの乾燥を避けるため、複数のカバースリップを持っている場合に、随時、このいずれかを実行します。
14. ピンセットで保持しながら、12ウェルプレートにカバースリップに〜0.5ミリリットルのエタノールを加え、乾燥したカバースリップと空気を除去する。
15. メディアをマウントするにスリップ細胞側を下にカバーし、暗闇の中で硬化する数時間またはO / Nを聞かせて置きます。
16. マニキュアとの縁をシールし、イメージングに進みます。

6。オリンパスIX-81倒立顕微鏡の概要を有する細胞のイメージング

1. 画像取得のために我々はSlidebook（インテリジェントimaging.com）ソフトウェアや100X、1.45 NA、TIRFM油目標を利用しています。クロマフィルターセット（試薬を参照）：シリアルGFP、DAPI、Cy3で、Cy3.5およびCy5イメージングのため。
2. DAPIフィルタを使用細胞を見つけ、集中する。
3. 基準点としてこれを設定してください。
4. 総距離は0.2μMサイズ（25面）で5μMである基準点の周りの画像のzスタックを取る。各色素チャネル（ すなわち 、各プローブセット）について、この手順を繰り返します。
5. 画像解析のための16ビットのTIFFとしてエクスポートします。

7。画像解析の概要（歌手プローブ）

以下我々はMATLABでFISH画像を分析するために使う計算手法の概要を提供します。使用され、関連するMATLAB関数は右側に囲まれている。アルゴリズムとしきい値は現在シンガースタイルのプローブからのデータのために調整されています。ステラリススタイルのプローブを使用すると、特に最後のフィルタリングステップ（7.8）にはいくつかの調整が必要となります。

セル識別¹⁵

1. DAPIの画像¹⁶上のグローバルしきい値を使用してバックグラウンドから別々のセル[graythresh]。
2. 拡張された最大値関数[IMを使って核を識別extendedmax]。
3. 流域アルゴリズムシードとして核を使用してセグメント細胞[分水嶺]。

各蛍光チャネルでスポットを検索

4. 背景を正規化し、信号対雑音比を向上させるためにトップハット変換を実行する[bwmorph]。
5. 各スポットのために合焦層（z平面上の）を識別するための最大値を見つける[imregionalmax]。
6. 放射状グラデーションの線形近似モデルを用いて、潜在的なスポットをフィルタリングします。

スポット強度とフィルタシングル対複数のプローブ信号を測定

7. 以前に同定された合焦層と推定強度¹⁷のスポットに2Dガウシアンプロファイルを合わせる。
8. しきい値（ヒストグラムに基づいて）を使用して、弱点を除外。歌手型プローブでは、これは重要ですが、ステラのプローブに少ないそうです。
9. 各セル内のスポットを数える。

結果

図3は、FISH画像から計算され、単一細胞中に存在するmRNAの数を決定するために使用される典型的なヒストグラムを示している。顕微鏡ベースのRNA定量の重要な利点は、一つは転写産物の局在に関する情報を得ることができるということです。例えば、私たちは誘導CBF1対立遺伝子（ 図4）を用いて、単一細胞内のmRNAを同定するためにFISHを使用していました。多くのmRNA分子は、転写部位に存在するため、我々は核内で転写部位の存在および位置を識別することができる。

異なる遺伝子のmRNAを標識するために異なる色素を利用することによって、人は、同じセル内の複数のmRNA種を定量化することができる。これを示すために、酵母細胞を、α-因子及びソルビトールの存在下でインキュベートした。 FUS1転写（Quasar670色素、赤）α-因子によって誘導される。 STL1転写（570クエーサー染料、緑色）は、細胞外浸透圧の増加により誘導される（ 図5） 図4は、歌手プローブによるFISHの一例です。 図5のStellarisプローブによるFISHの一例です。

図1。 FISH実験手順の概略は 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。画像解析パイプラインの概略図 。最終的なスポットは、右端の図に決定されます。

図3。歌手プローブを使用して特定の遺伝子のスポット強度のヒストグラム 。プローブ強度は、内側（赤）と外側（青）セルの両方が計算される。低強度のスポットは、ノイズまたは単一プローブのいずれかです。実数のmRNAメッセージは、複数のプローブで標識される。ステラリスプローブを使用する場合は、1つのプローブは、しきい値とフィルタリングがそれに応じて調整しなければならないので、より少ない検出可能とされています。

図4。歌手FISH手順の代表的な結果 。この実験では、CBF1転写が誘導性プロモーター¹⁸で活性化される。核はDAPI、青色染色する。CBF1のmRNAをCy3標識プローブでタグ付けされています。白矢印は核内CBF1転写部位の存在を強調する。単一のmRNA転写産物は、細胞質に表示されます。

図5。ステラリスFISH手順の代表的な結果 。マタ酵母細胞は、同時に30 ngの/ mlのα-因子で10分間、ソルビトール113 Mにさらされ、同時にFUS1（670クエーサー、赤）とSTL1（570クエーサー、緑）転写産物をプローブした。ハイライトボックスで、私たちは、一つのセルがフェロモンだけに応答する（FUS1開始部位、赤）と別の主（緑、STL1開始部位）ソルビトールへの対応を見ることができます。

ディスカッション

現在までに、魚は主に低スループット方法であった。 Cy3での使用、Cy3.5、およびCy5色素は1つが一度に3への単一細胞で調べることができた遺伝子の数を制限します。いくつかの追加のプローブが開発された（ステラリス）は区別プローブの数は、ほとんど7にまだあるされています。この制限を回避するために、複数の蛍光色素を用いたコンビナトリアル標識戦略は、異なるmRNA種^19,20のバーコードを作成するために使用されてきた。最近では、リューベックとカイは、単一の酵母細胞¹⁹の魚と同時に32の異なる種を定量化するために、光とスペクトルバーコーディングを使用していました。この最近のコンビナトリアル手法の一つの制限は、それが超解像顕微鏡法を使用する必要がある。バーコードプローブを区別するために必要な分析も非常に複雑である。

我々は、Cy3標識およびCy3.5がFISH実験のCy5のに好適であることを見出した。 Cy5の色素の制限の1つは、その感度である退色する。しかし、ステラリスは最近、退色に対してより耐性としてアドバタイズされCy5の亜種を開発し、この技術的な問題を軽減することがあります。市販のプローブの価格が将来的に減少するべきであるが、プローブセットにつき$ 1,000 - それはまた、その魚を注目に値する実装するための高価な方法であり、シンガーとステラリス両プローブは通常、700 $の費用がかかること。試薬および効率的なラベルの温存と、価格の低い範囲まで歌手プローブをもたらします。

主要な技術課題の一つは、洗練されたスポットを決定するアルゴリズムの実装を必要とする単一対複数のプローブスポットの分離である。これは、具体的な実験のセットアップのための画像解析パラメータを調整するために大規模なマニュアルの見直しを取ることができます。関連するMATLAB関数との計算パイプラインの概要をプロトコルのセクション7で提供されています。この問題は多少しかないステラプローブによって軽減されるプローブごとにラベル。したがって、複数のプローブの局在が信号を参照する必要があります。

FISHは、固定細胞を必要とするので、時間をかけて個々の細胞を追跡を容易にしない。先に、我々は^、6個々の代謝サイクル酵母集団における遺伝子発現の動態を再構築するためにFISHのスナップショットデータを用いる。代謝サイクルは、プレ飢え、連続培養物に​​おいて観察されており、酸素消費の人口集団全体の振動によって特徴付けられる。これらの振動は、酸素消費量の異なる段階において、すべての酵母遺伝子の半分を発生する転写物のゲノムワイドな振動と関連している。我々は代謝サイクリング非同期連続酵母培養中に存在していたかどうかを判断しようとした。存在する場合、同期集団で反相関している転写産物はまた、非同期単一細胞、および相関転写産物のためにその逆に反相関されるべきである。

耳鼻咽喉科 ">即座にmRNAの生産の動態を再構築するためには、観測されたスナップショットデータは基礎となる行動のモデルから期待されるものと比較しなければならない。そのようなときに理論的な制限があり、"遺伝子発現データのスナップショット "を決定するために用いることができる基礎となる遺伝子発現動態かつモデルの種類^21を区別することができる。代謝周期データではなく、直接的に時間的な振動の存在を示すために、統計測定は、バルクマイクロアレイと一致して細胞自律的振動プログラムが実際に存在することを実証するために実施された測定。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vanadyl Ribonucleoside Complex	NEB	S1402S
Lyticase	Sigma	L5263
E. coli tRNA	Roche	1010954001
BSA (RNase free)	Ambion
Beta-mercapt–thanol	Fisher	03446l
DAPI, dilactate	Sigma	D9564
PBS 10X (RNase free)	Ambion	AM9624
Triton X-100	Shelton Scientific
Dextran sulfate	Sigma	D6001	Or equivalent
Saline-sodium citrate (SSC) 20X	VWR	82021-484
Formamide (deionized)	Ambion	AM9342
Nuclease-free water	Ambion	AM9932
Alpha-D-glucose	Sigma	158968	For GLOX solution
1 M Tris-HCl, pH 8.0	Ambion	AM9855G
100% Ethanol
Glucose oxidase	Sigma	G0543	For GLOX solution
Catalase	Sigma	C3155	For GLOX solution
Concanavalin A	MP Biomedicals	150710
Polylysine (0.01%)	Sigma	P8920
Coverslips	Warner Instruments	Cs-18R15
Prolong Gold Mounting Medium	Invitrogen	P36934
QIAquick Nucleotide Removal Kit	QIAGEN	28304
FISH Probes	Biosearch Technologies		Custom order for your desired mRNA sequence
Glass bottom 96-well plates	Nunc	265300	Alternative to coverslips
12-well plates	BD Falcon	351143
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes	GE Healthcare		monofunctional NHS-ester
EQUIPMENT
Plasma-Preen I Cleaner	Terra Universal	9505-00	Controller (Cat #9505-17 optional)
Vacuum Pump	Alcatel	205SDMLAM	For operating Plasma-Preen
Widefield Fluorescence Microscope	Olympus	IX81	Or equivalent
100X objective	Olympus	1-UB617R
Light Source	X-Cite	XCT 10-A	Or equivalent
Filter Sets	Chroma	U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.
Cooled CCD or EMCCD Camera	Hamamatsu	C4742-98-24ER