マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

要約

私たちは、ミクロンスケールのくびれのシーケンスを通過する細胞のためのタイムスケールを測定するためのマイクロ流体ベースのアッセイを実証する。

要約

ここでは、詳細設計、製作、及び効率的な方法で個別の多数の細胞の変形能を評価するためのマイクロ流体デバイスの使用。典型的には、約10 ²細胞についてのデータは、1時間の実験内で取得することができる。自動画像解析プログラムは、数時間以内に完了することが処理を可能にする、画像データを効率的に後の実験分析を可能にする。細胞は、それによってアッセイされるべき個体の細胞の初期変形及び時間依存性弛緩を可能にする、ミクロンスケールのくびれ一連の変形しなければならないという点で、私たちのデバイス形状が独特である。人間の前骨髄球性白血病（HL-60）細胞へのこの方法の適用が実証されている。圧力駆動流を用いたミクロンスケールのくびれを通って変形するようにセルを駆動する、私たちは人間の前骨髄球（HL-60）細胞が瞬間的に、その後の収縮によって、より迅速に継代する前に、9.3ミリ秒の時間の中央値の最初のくびれを塞ぐことを観察くびれあたり4.0ミリ秒の中央値は走行時間を有するイオン。これとは対照的に、オールトランスレチノイン酸処理（好中球型）HL-60細胞は、3.3ミリ秒の中央値は走行時間とその後のくびれを通して継代前にだけ4.3ミリの最初のくびれを塞ぐ。この方法は、細胞の粘弾性的性質への洞察を提供し、最終的には、この動作の分子の起源を明らかにすることができます。

概要

細胞形状の変化は、多くの生物学的状況において重要である。例えば、赤血球および白血球は、独自の¹直径よりも小さい毛細血管を変形させる。転移では、癌細胞は、セカンダリサイト²でシードする狭い間質ギャップだけでなく、曲がりくねった血管系とリンパのネットワークを介して変形させる必要があります。個別のセルの物理的挙動を調査するために、マイクロ流体デバイスは、狭い隙間³を通って移動し、受動的にミクロンスケールのくびれ^3-9を通じて変形させる能力を含む、細胞挙動の範囲を研究するためにカスタマイズすることができる理想的なプラットフォームを提示します。ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスは、光学顕微鏡を用いて可視化し、基本的な画像処理ツールを用いて分析されるべき細胞の変形を可能にする、光学的に透明である。また、くびれのアレイを正確に同時に複数の細胞の分析を可能にする、定義することができ多くの既存の技術^10,11を超えるスループット。

ここでは、「セルフォーマ」PDMSマイクロ流体デバイスを用いて細胞変形能をプロービングするための詳細な実験プロトコルを提示する。デバイスが設計され、順次くびれを通して細胞は継代するように。このジオメトリは、肺毛細血管床¹²のような生理学的文脈で一般的です。細胞変形能を測定するために、通過時間は容易に単収縮^4,6を介して通過する個別の細胞に必要な時間として測定される便利なメトリックを提供する。細胞通過中のくびれチャネルにわたる圧力降下を一定に保つために、圧力駆動流を使用する。私たちのプロトコルは、細胞がくびれ一連の変形させるまでの時間を測定するためのデバイス設計および製造、圧力駆動流によるデバイス動作、細胞の調製およびイメージングだけでなく、画像処理の詳細な手順が含まれています。私たちは、デバイス設計と補助ファイルなどの視覚データ処理コードの両方。データの代表的なサンプルとして、継代くびれの数の関数として収縮一連のセル通過時間を示している。トランジットへの細胞のためのタイムスケールの分析は、マイクロ流体デバイスの狭いくびれ細胞型^4,5,13の多様な変形能の違いを明らかにすることができるけれども。ここで実証したデバイスは、一意にミクロンスケールのくびれ一連の細胞輸送を調査。この設計は、細胞が循環中に体験し、また、そのような緩和時間などの細胞の追加の物理的特性をプロービング可能に曲がりくねった経路をエミュレートします。

プロトコル

1マイクロ流体デバイス設計

NOTE：入口ポート、セルフィルタ、狭窄アレイ、及び出口ポート（ 図1）：デバイスの設計は、4つの基本的な機能領域を有している。全体的な設計は、寸法の微調整を、細胞型の広い配列に適用することができる。プライマリおよび不死化細胞の選択のために有効なデバイスパラメータと一緒にいくつかの基本的な設計上の推奨事項は、ここで提供される。

1. 平均気泡径の約30〜50％であることがくびれアレイチャネルの幅（ 図1B）を選択し;この有意な細胞変形が、最小の目詰まりの狭窄と細胞のサイズ比をもたらす。以前にテストされていない細胞型を考えると、最適な幅を見つけるために〜30〜50％の細胞直径を収縮幅の範囲を設計することが賢明である。マイクロ流体デバイスの多くのタイプと同様に、120以上のデバイスのマスターモールドは、罪にパターニングすることができる異なるデバイス設計の配列を可能にするGLE 4インチシリコンウェハは、単一の製造プロセスで製造される。
2. 細胞直径の少なくとも50％であることが流路高さを選択し;これは、セルが2次元的に閉じ込められるようにします。デバイス全体：接合時のチャネルの崩壊を防止するために、チャネルのアスペクト比1:10（幅、高さ）以上であることを確認してください。このアスペクト比を超えていなければならないチャンネルでは、崩壊を防ぐために支柱を追加します。細胞の流れを妨げないための少なくとも2倍の細胞の直径である距離の空間支柱。
3. 破片を除去し、細胞クラスター（ 図1B）を脱凝集する入口ポートにフィルタを含む。ポストを隔てる距離は、一つのセルの直径にほぼ等しくなるように、フィルタのポストのサイズと間隔を調整する。
   注：フィーチャーサイズの下限はリソグラフィマスクが印刷される解像度によって設定される。すべての機能は解像度の範囲内であることを確認してくださいマスク供給者によって指定されたolution制限。

2。サプライと準備

注：いずれかの実験を開始する前に、次の項目が用意されなければならない。全体のセットアップの概略図を図1に示す。

1. リソグラフィ微細加工^14,15のための標準的な技術を使用してデバイス·マスタを作製する。プロフィルを用いてパターンの機能の高さを確認してください。
   注：マスターを容易にクリーンルーム施設で製造することができるが、いくつかの研究室は、半クリーン環境^16,17における使用のための安価なリソグラフィ方法を開発した。
2. 圧縮空気と空気レギュレータおよび付属品（ 図1A）の配列のタンクを使用して、圧力駆動流のための空気源を準備します。
   1. 空気供給タンクと手動調整器を設定します。
      注：空気中に5％の組成はCO _2は 、典型的な細胞培養incubatoと同様の環境を維持しますrは、他のガス混合物を使用することもできる。
   2. インライン手動レギュレータと電子制御式圧力調整器を設定します。 2未満キロパスカルの圧力変動で、調整し、チャネル間で安定した圧力降下を維持するために、電空変換器を使用してください。入力に所望の圧力をLabVIEWで書かれた簡単なコード（補足情報）を使用します。
      注：電空変換器は、マイクロ流体デバイス間で所定の圧力に一致するようにバルブ出口圧力を調整するために内部帰還ループを使用しています。
   3. 細胞懸濁液の流れを駆動するために加圧室を設定する。チューブ標準的なフローサイトメーターとチューブの圧力気密シールを作成し、機械加工されたキャップの外に細胞懸濁液チャンバーを組み立てます。
      注：細胞が装置内に加圧室から流出それを通して圧縮空気タンクに接続し、入口、および出口（Figur：圧力室キャップは、2つのオリフィスを含んでいるE 2）。
3. くびれアレイを流れる細胞の画像を捕捉する秒当たり少なくとも100フレームの取得速度を有するカメラを装着した倒立顕微鏡を設定する。ビデオキャプチャカードとコンピュータとカメラをインターフェイス。
4. 細胞培地溶液にF127を少量添加するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で/ wのプルロニックF-127の10％wストック界面活性剤溶液を調製PDMSの壁への細胞接着を最小限にするために役立つ。 F127を溶解させ、37℃で穏やかにF127溶液を、ボルテックスし、熱を調製した。使用前に、室温で0.2μmのシリンジフィルターとストアに溶液を通過させる。以上の24時間持続する泡を生成しますボルテックスおよびフィルタリングなど事前に界面活性剤溶液を調製します。

3マイクロ流体デバイスの製造

1. マイクロ流体チャネルを有するPDMSブロックを製作。
   1. ミックスPDMS徹底的に1:10 taの比（w / w）のベースに硬化剤。
   2. デバイスのマスター（ステップ2.1）上の混合物を注ぐ。真空を適用しながらベルジャー内ドガ閉じ込められた気泡が消えるまで、または約10〜20分。
      注：この後、まだ正常な空気-PDMS界面で気泡があるかもしれない。これらは通常、焼成時に消費します。これは、チャネルに隣接する残存気泡がないことを確実にするために最も重要である。
   3. 4時間65℃で、脱気したデバイスを焼く。崩壊チャンネルを防止するために、更なるチャンネルの崩壊に対してより耐性が高い弾性率を有するデバイスのためのPDMSを架橋するために、一晩デバイスを焼く。しかし、ベーキング拡張ノートも、PDMSを脆化さとホール（ステップ3.3）を打ち抜く際にクラックが発生する場合があります。
2. マスターモールドからマイクロ流体デバイスを削除します。かみそりの刃でPDMSブロックのうちの個別のマイクロ流体デバイスをカットし、マストからデバイスを削除えー。優しくデバイスの一角をリフトオフすることから始めます。遅いと穏やかな剥離が、まっすぐにPDMSブロックを持ち上げるとは対照的に、PDMSおよびマスターの両方のストレスを軽減します。
3. チューブとマイクロチャネル間のアクセスのための接続ポートを作成するために、PDMSデバイスに穴をパンチ。生検パンチを使用して穴を作成し、デバイスの外側に至るチャンネル側からパンチ。
   注：0.75ミリメートル内径穴を作成し、そのインターフェイスを完全エーテルエーテルケトンとエーテルケトン（PEEK）、チューブ（外径= 32,1 "または0.79ミリメートル）またはポリエチレンチューブ（PE-20、外径= 0.043"または1.09ミリメートルと生検パンチ）。浅いチャネル¹⁸を備えたデバイスに穴を視覚化するためにリングライトを使用してください。生検パンチがシャープであることを確認してください。繰り返し使用した後に刃先が鈍くや生検パンチは廃棄、交換する必要があります。
4. PDMSのほこりや提出チャンクを除去するためにイソプロパノール（HPLCグレード）でPDMSデバイスをすすぐ。ことを確認してくださいパンチ穴は貫通穴スクイーズボトルから純粋なイソプロパノールの安定した流れを向けることによってデブリの明確である。ろ過された空気で乾燥ブロー。洗浄後、チャンネルの場所PDMSブロックは、デバイスの清浄度を維持するためのクリーンなペトリ皿に表向き。ボンディングまで、この形で、店のデバイスが必要な場合。
5. メタノール（HPLCグレード）を洗浄することにより、ガラス基板を清掃し、濾過空気でブロー乾燥し、ガラスは、プラズマ処理の前に完全に清潔で乾燥していることを確認するために5〜10分間、200℃のホットプレート上に置きます。
   注：ガラス基板は、各チャネルの底部を形成する。 10Xまたは20Xの目的は、並列に複数のチャネルを画像化するために理想的であるので、典型的にはガラススライドは、十分である。高解像度イメージングのために、カバースリップ（＃1.5厚さ）にデバイスを接着する。
6. ガラス基板にPDMSデバイスを接着。
   1. 酸素プラズマは、チャネルPDMSブロックの側面とガラススライドの1側面を扱う。
      注：Wハンドヘルド排出部番目、1分の処理時間を使用するが、各酸素プラズマ装置のための処理時間を最適化する。
   2. 処理直後のガラスの処理面の上にPDMSのチャンネル側に配置します。
   3. 結合を促進するために〜10秒間軽い圧力と一緒に持ってください。結合強度を改善するために、少なくとも15分間、高温（60〜80℃）で、装置全体焼く。

4。くびれチャンネルを通して細胞を変形させる

1. 顕微鏡下でマイクロ流体デバイスを調べます。チャンネルが崩壊したり、壊れていないことを確認し、両方の入口と出口の穴が低消費電力目標（10X）を使用して、デバイスのチャネルに直接接続すること。かみそりの刃でPDMSの表面を採点することによって欠陥デバイスを指定し、実験のために利用していない。
2. 細胞培養試料を調製するアッセイされる。標準的な条件を用いて培養細胞。
   1. Fまたは、例えば、37℃で5％CO ₂インキュベーター中で1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液および10％ウシ胎児血清を補充したRPMI-1640培地中で培養するHL-60細胞。
   2. 接着細胞の場合は、新鮮な増殖培地中のトリプシン処理および再懸濁することにより、それらを収穫。標準のトリプシン処理プロトコルを使用します。例えば、25cm ^2の培養面積を有するフラスコに〜0.5ミリリットルのトリプシンを追加して、〜30ミリリットル新鮮な培地を再懸濁。以前^19,20に記載され^ているように1×10 ⁵細胞/ mlあたり5μMの最終濃度で、全トランスレチノイン（ATRA）による好中球系細胞へのHL-60細胞を分化する。
   3. 遠心3分間300×gで細胞を慎重に0.1％（v / v）のF-127を含む新鮮な培養培地中で適切な最終密度に再懸濁した細胞上清を吸引除去する。
3. コー​​ルターカウンター、血球計を用いて細胞を数えるか、フローサイトメーター。 1×10 ^6×10 5個の密度に細胞懸濁液を調整 6細胞/ mlまで。サスペンション密度が設定されると、約0.1％v / vのF-127サプリメント。
   注：細胞密度および界面活性剤濃度は、特定の細胞系に応じて変更する必要があり、 表1は、異なる細胞タイプの細胞およびF-127の以前に使用された濃度の記録を提供する。
4. チューブフローサイトメーターで細胞懸濁液を置き、圧力キャップに接続します。細胞懸濁液は、チューブの先端から出てくるまでは、マイクロ流体デバイスにチューブを接続する前に、約14〜21キロパスカルの圧力とフラッシュを調整します。これはチューブと、デバイス内の気泡を最小限に抑えるのに役立ちます。
5. デバイスの入口に細胞懸濁液を含むチューブの先端を挿入します。デバイスは、カバースリップに接着されている場合は、配管を接続する前に、そのような顕微鏡ステージなどの平らな固体表面上に置か;カバーガラスは壊れやすく、それ以外の場合は破損する可能性があります。
6. チューブのintの部分を挿入します廃棄物収集のための空のチューブに出口や経路をOなどの顕微鏡ステージの側面にテープで留め、空のファルコンチューブなど。実験間のデバイスの全体の流体抵抗値の一貫性を保つために、入口と出口のチューブが各実験の同じ直径とほぼ同じ長さであることを確認してください。
7. 静かに約28キロパスカルの圧力を立ち上げるか、細胞がチャネルを通って流れるまで。複数のチャネルが視野にあり、画面の下部に垂直であるように、デバイスの位置を決めます。カメラは、データサイズによって制限されている場合は、独立したデータポイントの十分な数を生成するために、複数の動画を取得する。所望のデータ出力のために必要に応じてフレームレートを調整します。毎秒300フレーム（fps）での高速イメージングを使用して、細胞形状の変化をキャプチャするには、細胞の通過時間を測定するために、およそ100コマのフレームレートを使用する。

5。データ解析

1. ファイルマストを開きer_script.m（ダウンロード補足ファイル）、プログラムを実行します。
2. 表示されるWindowsエクスプローラのウィンドウから分析すべき最初のビデオを選択します。選択されたビデオのフレームレートを指定し、Enterキーを押します。
   注：図は、それは最初のビデオのための長方形のトリミングウィンドウを選択するようにユーザに促す表示されます。
3. 左から右へのすべてのチャネルを包含し、ちょうど上部と下部（ 図3）でのチャンネルの配列の最初の電球の上のチャネルと交差するウィンドウを選択します。
4. トリミングされた画像からくびれ領域を選択します。選択されたすべてのビデオのための上部と下部のウィンドウ境界の間の固定ピクセル距離を維持するために特別な注意を払ってください。
   注：トップウィンドウの端が最上位のくびれを指定し、下部のウィンドウの端を一番下のくびれ（ 図4）を指定します。中間くびれは、このユーザー入力から近似される。次に、アルゴリズムは、sが表示され各ビデオの最初の50フレームのための細胞のegmentation（ 図5）。
5. アルゴリズムは正確に細胞を配置しているかどうかを判断するために密接に左上の画像（ 図5A）を監視する。値化画像が識別されたセルの位置を示すためにソースビデオに重畳される。
   注：異なるウィンドウ（ 図5B-5D）をコード診断のためであり、特定の画像処理後のビデオフレームを実証する。
6. Windowsエクスプローラのウィンドウから次に処理するビデオを選択します。
   注：このアルゴリズムは、選択された各ビデオのためのステップ5.2〜5.5を繰り返します。
7. [キャンセル]を選択し、一度、すべての目的のビデオは、ビデオリストが完成し、関数に指示するWindowsエクスプローラのウィンドウを経由して追加されました。
   注：このアルゴリズムは、ユーザーの介入なしに残りの操作を実行します。これは、処理されたビデオとコンピュータのPEの数に応じて約1〜2時間かかりますrformance。完了すると、アルゴリズムは、通過時間データのヒストグラムが生成されますし、MATLAB .MATファイルおよびMicrosoft Excelの.xlsファイルとしてディレクトリ内のデータを保存します。

結果

異なる細胞型、ヒト骨髄性白血病細胞（HL-60）、分化した好中球細胞、マウスリンパ球細胞、およびヒト卵巣癌細胞系（OVCAR8、HEYA8）の変形性を調査するために「セルフォーマ 'マイクロ流体技術を用いて評価される。 図6に示すように、HL-60および好中球型HL-60細胞の通過時間のための代表的な結果は、くびれの一連通過する単一の細胞のための時間スケールを示す。トランジ?...

ディスカッション

ここでは、圧力駆動流を使用してくびれたマイクロ流体チャネルを通して通過する細胞の変形を分析するための総合的な実験手順を提供する。 MATLABスクリプトは、自動データ処理（補足資料）を可能にし、コードの更新バージョン（維持されているwww.ibp.ucla.edu/research/rowat ）。より広義に、ここに提示技術は、細胞骨格の影響、核硬化剤^24,23?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Pressure regulator	Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittings	McMaster Carr	5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView System Design Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable	National Instruments	SHC68-68