Микрожидкостных Техника для исследования клеток деформируемости

Резюме

Мы демонстрируют Microfluidics основе анализа измерить временные рамки для клеток к транзиту через последовательность микронного масштаба перетяжек.

Аннотация

Здесь мы подробно на проектирование, изготовление и использование микрофлюидном устройства для оценки деформируемости большого количества отдельных клеток в эффективным образом. Как правило, данные за ~ 10 ² клеток могут быть приобретены в рамках эксперимента на 1 час. Автоматизированная программа анализа изображения позволяет проводить эффективный анализ после эксперимента данных изображения, что позволяет обработку на полноту в течение нескольких часов. Наша геометрии устройство уникально тем, что клетки должны деформироваться через серию микронного масштаба сужений, тем самым позволяя начальная деформация и зависит от времени релаксации отдельных клеток, которые будут проанализированы. Применимость этого метода к человеческой промиелоцитарного лейкоза (HL-60) клеток демонстрируется. Вождение клетки деформироваться через микронного масштаба перетяжек с использованием потока давления приводом, заметим, что человек промиелоцитарного (HL-60) клетки моментально закрывают первую сужение для средней продолжительностью 9,3 мс до пассажей быстрее через последующей сужаютионы с медианой времени пролета 4,0 мс в сужении. В отличие от этого, полностью транс-ретиноевой кислоты, обработанных (нейтрофилов-тип) HL-60 клетки закрывают первую сужение для всего 4,3 мс, прежде чем пассирования через последующие сужений со средним временем пролета 3,3 мсек. Этот метод может дать представление о вязкоупругой природы клеток, и в конечном итоге выявить молекулярные истоки такого поведения.

Введение

Изменения формы клеток имеют решающее значение в многочисленных биологических контекстах. Например, эритроциты и лейкоциты деформации через капилляры, которые меньше, чем их собственный диаметром ^1. В метастазов, раковые клетки должны деформироваться в узких интерстициальных пробелов, а также извилистый сосудистой и лимфатической сетей, чтобы отобрать в средних сайтов ^2. Чтобы исследовать физическое поведение отдельных клеток, микрофлюидных устройства представляют собой идеальную платформу, которую можно настроить для изучения ряд клеточных поведения в том числе их способности мигрировать через узкие щели ³ и пассивно деформироваться через микронного масштаба перетяжек ^{3- 9.} Полидиметилсилоксан (PDMS) микрофлюидных устройства оптически прозрачны, что позволяет клеточные деформации быть визуализированы с помощью световой микроскопии и проанализированы с помощью базовых инструментов обработки изображений. Кроме того, массивы перетяжек может быть точно определены, что позволяет анализ нескольких ячеек одновременно спропускная что превосходит многие существующие методы ^10,11.

Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для зондирования клеток деформируемость используя микрожидкостных устройств 'Сотовый Deformer' PDMS. Устройство предназначено так, чтобы клетки проход через последовательных сужений; Эта геометрия является общей в физиологических условиях, таких как легочный капиллярный слой ^12. Чтобы оценить клеточный деформируемость, время прохождения обеспечивает удобный метрику, который легко измерить как время, необходимое для отдельной клетки транзита через одну сужения ^4,6. Для поддержания постоянной перепад давления на суженных каналов во время транспортировки клеток, мы используем поток давления приводом. Наш протокол содержит подробные инструкции по конструкции прибора и изготовления, эксплуатации устройства от давления приводом потока, подготовки и визуализации клеток, а также обработки изображений для измерения времени для клетки деформироваться через серию перетяжек. Мы включаемоба проекта устройств и код обработки данных видение в качестве вспомогательных файлов. В репрезентативной выборке данных, мы показываем время сотовый транзитный через серию перетяжек в зависимости от количества перетяжек пассированными. Анализ временных сроков для клеток к транзита хотя узкие перетяжки из микрофлюидном устройства может выявить различия в деформируемости различных типов клеток ^4,5,13. Устройство показали, здесь однозначно обследует транзитной камере через серию микронного масштаба сужений; Этот дизайн эмулирует извилистый путь, что клетки испытать в обращении, а также позволяет зондирования дополнительные физические характеристики клеток, таких как время релаксации.

протокол

1 Микрожидкостных Дизайн устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция устройства состоит из четырех основных функциональных областей: Заход в порт, ячейка фильтра, сужение массива, и выход порта (рисунок 1). Общий дизайн может применяться для широкого круга типов клеток, с незначительными изменениями в размерах. При условии, здесь несколько основных рекомендаций дизайн наряду с параметрами устройств, которые являются эффективными для выбора начальной и иммортализованных клеток.

1. Выберите ширину сужение массива каналов (Рисунок 1В), составит около 30-50% от среднего диаметра клеток; Это сужение-клетка размер соотношение результатов в значительной деформации клеток, но минимальной засорения. Учитывая тип клеток, что ранее не было проверено, это разумно, чтобы спроектировать спектр сужения ширины от ~ 30-50% диаметра клеток, чтобы найти оптимальную ширину. Как и во многих видах микрофлюидных устройств, более 120 устройств мастер формы могут быть с рисунком на грехгле 4 дюйма кремниевой пластины, что позволяет множество различных конструкций устройства, чтобы быть изготовлены в одном процессе изготовления.
2. Выбор высоты канала, по крайней мере 50% от диаметра клеток; это обеспечивает клеток ограничена в 2 размеров. Для предотвращения коллапса канала во время склеивания, не убедиться, что соотношение сторон канала составляет не менее 1:10 (высота: ширина) на протяжении всего устройства. Для каналов, которые должны превышать этот пропорции, добавить поддержку сообщения для предотвращения краха. Поддержка пространство сообщений на расстоянии, что, по меньшей мере в два раза диаметр ячейки, чтобы не препятствовать потоку клеток.
3. Включите фильтр в портах въезда для удаления мусора и разбивке клеточных кластеров (Рисунок 1б). Настройте размер и расстояние между столбами фильтров так, чтобы расстояние разделения сообщения приблизительно равна одному диаметру клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нижний предел размера элемента установлен постановлением, при которой литография маска печатной. Убедитесь, что все функции в пределах разрешенииспособность по ограничение определено поставщиком маски.

2. Поставки и подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом любой эксперимент, следующие пункты должны быть готовы. Схема всей установки приведена на рисунке 1.

1. Изготовление ведущего устройства с использованием стандартных методов для литографических микрообработке ^14,15. Проверьте высоту узорных особенностей использованием профилометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как мастера можно легко изготовлены в чистых помещениях объекта, некоторые лаборатории разработали недорогие методы литографии для использования в полу-чистой окружающей среде ^16,17.
2. Подготовьте источник воздуха для потока давления приводом, с помощью танка сжатого воздуха и последовательности регуляторов воздуха и фитингов (Рисунок 1А).
   1. Настраивать бак подачи воздуха и ручной регулятор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: состав 5% СО ₂ в воздухе поддерживает подобную среду в качестве типичного для культивирования клеток incubatoR, но и другие газовые смеси могут быть также использованы.
   2. Настраивать регулятор электронным управлением давления в линии с ручным регулятором. Используйте электропневматический преобразователь для регулирования и поддержания стабильного падения давления между каналами, с колебаниями давления менее 2 кПа. Используйте простой код, написанный на LabVIEW (дополнительную информацию) для ввода нужного давления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: электро-пневматический преобразователь использует внутренний контур обратной связи для регулировки давления на выходе клапана совпадения указанного давления на микрожидкостных устройств.
   3. Установка герметичной камере для управления потоком суспензии клеток. Сборка клеточной суспензии из камеры стандартного проточного цитометра трубки и обработанной колпачком, который создает герметичного уплотнения на трубе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Камера давления крышка содержит два отверстия: входное отверстие, которое подключается к нагнетатель и выход, через который клетки вытекают из герметичной камере в устройство (FigurE 2).
3. Настройка инвертированного микроскопа, оснащенного камерой, которая имеет частоту дискретизации не менее 100 кадров в сек для захвата изображения клеток, проходящих через массив сужения. Интерфейс камеры с карты видеозахвата и компьютером.
4. Подготовка исходного раствора ПАВ из 10% вес / вес Pluronic F-127 в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), как добавление небольшого количества F127 в клетки носителя раствором поможет минимизировать адгезию клеток к PDMS стен. Для приготовления раствора F127, вихрь и тепло осторожно при 37 ° С, чтобы растворить F127. Перед использованием пройти раствора через шприцевой фильтр 0,2 мкм и хранить при комнатной температуре. Подготовьте раствор ПАВ заранее как вортексе и фильтрации будет генерировать пузырьки, которые будут сохраняться в течение более чем 24 часов.

3 Микрожидкостных Изготовление устройства

1. Изготовление PDMS блок с микроканалов.
   1. Mix PDMS тщательноСоотношение TA 1:10 (вес / вес) отвердителя на базу.
   2. Вылейте смесь на ведущего устройства (этап 2.1). Дега в колпаком с прикладной вакууме до захваченных пузырьков исчезают, или около 10-20 мин.
      Примечание: По истечении этого времени, могут все еще быть пузырьков на поверхности раздела воздух-PDMS, который является нормальным; они, как правило, рассеивается во время выпечки. Это наиболее важно обеспечить, чтобы там не осталось пузырьков, прилегающих к каналам.
   3. Выпекать дегазированного устройства при 65 ° С в течение 4 часов. Для предотвращения каналов от коллапса, испечь устройство на ночь для дальнейшего сшивания PDMS для устройства с более высоким модулем упругости, который более устойчив к краху канала. Тем не менее, отмечают, что продлен выпечки также охрупчивает в PDMS и может привести к растрескиванию при пробивки отверстий (шаг 3,3).
2. Удалить микрофлюидных устройств от главного плесени. Вырезать отдельные микрофлюидных устройств из PDMS блока с лезвием бритвы и удалите устройство с мачтыэ. Начните осторожно отрывая один угол устройства; медленный и нежный шелушение, в отличие от подъема PDMS блок вертикально вверх, уменьшает нагрузку на обеих PDMS и мастера.
3. Проделайте отверстия в устройстве PDMS, чтобы создать порты подключения для доступа между трубой и микроканалов. Создание отверстий с помощью биопсии удар, и удар со стороны канала, через к внешней стороне устройства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия удар с 0,75 мм калибр создает отверстия, интерфейс отлично с полиэфирэфиркетон (PEEK) трубки (наружный диаметр = 1/32 "или 0,79 мм) или полиэтиленовых труб (ПЭ-20, наружный диаметр = 0,043" или 1,09 мм ). Используйте кольцо света, чтобы помочь себе отверстия в устройствах с мелкими каналами ^18. Убедитесь, что биопсия удар резкий; после многократного использования передний край притупляет и биопсия удар следует снять и заменить.
4. Промойте устройство PDMS с изопропанол (ВЭЖХ) для удаления пыли и поданные куски PDMS. Убедитесь, чтоперфорированные отверстия свободно от мусора, направляя устойчивый поток чистого изопропанола от гибкую бутылку через отверстия. Продуйте отфильтрованного воздуха. После очистки, место PDMS блоки с каналами лицевой стороной вверх в чистую чашку Петри для поддержания чистоты устройства. При необходимости, хранить устройства в таком виде до склеивания.
5. Очистите стеклянную подложку путем промывки метанолом (ВЭЖХ), просушите отфильтрованного воздуха, и разместить на 200 ° C плите в течение 5-10 мин, чтобы обеспечить стекло полностью чистой и сухой перед плазменной обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянная подложка образует дно каждого канала. Обычно предметное стекло достаточно, так как 10X или 20X цель идеально подходит для работы с изображениями нескольких каналов параллельно. Для повышения визуализации резолюции, скрепить устройство к покровного (# 1.5 толщины).
6. Бонду устройство PDMS к стеклянной подложке.
   1. Кислород плазменной лечить сторону канала блока PDMS и 1 сторону предметного стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: WIth единицы разряда ручного, использовать время обработки 1 мин, но оптимизировать время лечения для каждого аппарата кислородной плазмы.
   2. Поместите сторону канала PDMS поверх обработанной стороны стекла сразу же после обработки.
   3. Держите вместе с легким нажимом на ~ 10 сек для продвижения склеивание. Выпекать всего устройства при повышенной температуре (60-80 ° С) в течение по крайней мере 15 минут, чтобы улучшить прочность соединения.

4 Деформирующий клетки через суженные каналов

1. Осмотрите микрожидкостных устройств под микроскопом. Убедитесь, что каналы не рухнул или сломан, и что оба впускные и выпускные отверстия подключить непосредственно в каналы устройств с помощью цели малой мощности (10x). Назначить неисправные устройства, забив поверхности PDMS с бритвой и не использовать их для экспериментов.
2. Подготовка образцов клеточных культур, чтобы быть проанализированы. Культуры клеток с использованием стандартных условий.
   1. Fили пример, культуры HL-60 клеток в среде RPMI-1640 с добавлением 1% раствора пенициллин-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки в 5% CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С.
   2. Для адгезивных клеток, собирают их обработки трипсином и ресуспендируют в свежей среде роста. Используйте стандартный протокол трипсинизации; например, добавить ~ 0,5 мл трипсина в колбу с 25 см ² области культуры, и ресуспендируйте в ~ 30 мл свежей среды. Дифференцировать HL-60 клеток в клетки нейтрофилов типа на полностью транс-ретиноевой (ATRA) в конечной концентрации 5 мкМ на 1 х 10 ⁵ клеток / мл, как ранее описано ^19,20.
   3. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 3 мин, тщательно аспирации супернатант и ресуспендируют клетки в соответствующий конечной плотности в свежей культуральной среде с 0,1% об / об F-127.
3. Граф клеток с использованием счетчика частиц, гемацитометра или проточного цитометра. Регулировка клеточной суспензии до плотности 1 × 10 ⁶ до 5 х 10 6 клеток / мл. После того, как плотность суспензии установлено, добавка с приблизительно 0,1% об / об F-127.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток и концентрация ПАВ может потребоваться изменение в зависимости от конкретных клеточных системах; Таблица 1 обеспечивает запись ранее используемых концентрациях клеток и F-127 для различных типов клеток.
4. Поместите клеточной суспензии в проточной цитометрии трубы и подключить к крышке давления. Перед подсоединением трубки к микрофлюидного устройства, отрегулировать давление до приблизительно 14-21 кПа и на одном уровне, пока суспензию клеток не выходит из кончика трубки. Это поможет свести к минимуму пузырьки воздуха на трубки и устройства.
5. Вставьте кончик трубки, содержащей суспензию клеток в входе в устройство. Если устройство связывается с покровным, поместить устройство на ровную твердую поверхность, например, на столике микроскопа Перед подключением трубки; покровное является хрупким и может в противном случае разорвать.
6. Вставьте кусок междунар трубO выходное отверстие и способа его в пустой трубке для сбора отходов, таких как пустой трубки сокола приклеенный к стороне столике микроскопа. Для последовательности в общей жидкостной устойчивости устройства между экспериментами, гарантировать, что на входе и выходе трубки имеет тот же диаметр и примерно такой же длины для каждого эксперимента.
7. Осторожно нарастить давление около 28 кПа или до клетки течь через каналы. Установите устройство таким образом, чтобы несколько каналов в поле зрения и перпендикулярно к нижней части экрана. Если камера ограничена размером данных, приобретают несколько видео, чтобы создать достаточное количество независимых точек данных. Регулировка частоты кадров, как необходимую для желаемого вывода данных. Для захвата изменений в формы клеток, использовать высокую изображений скорости в 300 кадров в сек (кадров в секунду); для измерения транзитные времена клеток, использовать частоту кадров примерно 100 кадров в секунду.

Анализ 5. данных

1. Откройте файл Master_script.m (Доступно для скачивания Справочная файла) и запустите программу.
2. Выберите первый видео для анализа из окна Проводника Windows, которое появляется. Укажите частоту кадров для выбранного видео и нажмите клавишу ВВОД.
   ПРИМЕЧАНИЕ: фигура будет казаться, что предлагает пользователю выбрать прямоугольное окно обрезки для первого видео.
3. Выберите окно, которое охватывает все каналы слева направо и пересекает каналы чуть выше первой лампочки массива каналов в верхней и нижней (рисунок 3).
4. Выберите сужений регионы от обрезанного изображения. Обратите особое внимание на поддержание фиксированное расстояние пикселя между верхней и нижней границей окна для каждого видео выбранной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний край окна определяет верхний сужение и нижний край окна определяет самый нижний сужение (рисунок 4); промежуточные перетяжек аппроксимируются от этого пользователя ввода. Далее, алгоритм отображает Segmentation клеток в течение первых 50 кадров каждого видео (Рисунок 5).
5. Монитор верхний левый изображение (Рисунок 5A) тесно для определения, если алгоритм точного размещения клеток; бинаризуется изображение накладывается на исходном видео, чтобы продемонстрировать расположение выявленных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные окна, (рисунки 5B-5D) предназначены для диагностики кода и продемонстрировать видеокадры после определенных операций по обработке изображений.
6. Выбор следующего видео для обработки из окна Проводника Windows.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм будет повторять шаги 5.2-5.5 для каждого видео выбранной.
7. Выберите отменить, как только все необходимые видеофайлы были добавлены через окно Проводника Windows поручить функцию, что список видео является полной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм будет выполнять оставшиеся операции без вмешательства пользователя. Это займет около 1-2 ч в зависимости от количества видео обработанных и компьютерных реrformance. После завершения, алгоритм будет производить гистограмму данных временных транзитных и сохранить данные в каталоге как .mat файл MATLAB и .xls файла Microsoft Excel.

Результаты

Для исследования деформируемости различных типов клеток, миелоидных лейкозных клеток человека (HL-60), дифференцированных нейтрофилов клеток, мыши лимфоцитами и яичников линий раковых клеток человека (OVCAR8, HEYA8) оцениваются с помощью микрофлюидных технику в «ячейку Deformer '. Представител...

Обсуждение

Здесь мы предлагаем комплексную экспериментальную процедуру для анализа деформации клеток транзитом через суженные микроканалов используя поток давления приводом. Сценарий MATLAB позволяет автоматизированную обработку данных (дополнительного материала); Обновленная версия кода подд...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Pressure regulator	Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittings	McMaster Carr	5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView System Design Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable	National Instruments	SHC68-68