Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Riepilogo

Dimostriamo un saggio basato microfluidica-per misurare i tempi di cellule di transitare attraverso una sequenza di costrizioni micron scala.

Abstract

Qui noi dettaglio la progettazione, la fabbricazione e l'uso di un dispositivo di microfluidica per valutare la deformabilità di un gran numero di singole cellule in modo efficiente. In genere, i dati per ~ 10 ² cellule possono essere acquisite all'interno di un esperimento di 1 ora. Un programma di analisi delle immagini automatizzata consente efficiente analisi post-esperimento dei dati di immagine, consentendo l'elaborazione di essere completo entro poche ore. La geometria del dispositivo è unico in quanto le cellule devono deformare attraverso una serie di costrizioni micron scala, consentendo in tal modo la deformazione iniziale e rilassamento dipendente dal tempo di singole cellule da dosare. L'applicabilità di questo metodo per leucemia promielocitica umana (HL-60), le cellule è dimostrata. Cellule Guidando a deformarsi attraverso costrizioni micron scala usando flow-driven pressione, osserviamo che promielocitica umana (HL-60) le cellule momentaneamente occludono la prima costrizione per un tempo mediano di 9,3 msec prima passaging più rapidamente attraverso la successiva costrizioneioni con un tempo di transito medio di 4,0 msec per costrizione. Al contrario, tutto-trans retinoico trattati con acido (neutrofili-tipo) cellule HL-60 occludono la prima costrizione per soli 4.3 msec prima passaging attraverso le strettoie successivi con un tempo di transito medio di 3,3 msec. Questo metodo può fornire indicazioni sulla natura viscoelastica di cellule, e in ultima analisi rivelano le origini molecolari di questo comportamento.

Introduzione

Le variazioni di forma delle cellule sono fondamentali in numerosi contesti biologici. Ad esempio, eritrociti e leucociti deformano attraverso capillari che sono più piccoli di loro diametro ^1. In metastasi, le cellule tumorali devono deformare attraverso spazi interstiziali stretti così come vascolare tortuoso e le reti linfatiche per seminare nei siti secondari ^2. Per sondare il comportamento fisico delle singole cellule, dispositivi microfluidici presentano una piattaforma ideale che può essere personalizzato per studiare una serie di comportamenti cellulari tra cui la loro capacità di migrare attraverso strette fessure ³ e deformare passivamente attraverso costrizioni micron scala ^{3- 9.} Polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, consentendo deformazioni cellulari per essere osservata con un microscopio ottico e analizzati utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini di base. Inoltre, le matrici di costrizioni possono essere definite con precisione, consentendo l'analisi di più celle contemporaneamente conrendimento che supera molte tecniche esistenti ^10,11.

Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per sondare deformabilità cellulare utilizzando il dispositivo di microfluidica 'cellulare Deformatore' PDMS. Il dispositivo è progettato in modo che le cellule passaggio attraverso costrizioni sequenziali; questa geometria è comune in contesti fisiologici, come il capillare polmonare letto ^12. Per misurare la deformabilità delle cellule, il tempo di transito fornisce una metrica conveniente che è facilmente misurato come il tempo richiesto per una singola cella di transito attraverso un'unica ^4,6 costrizione. Per mantenere una caduta di pressione costante su tutti i canali ristretti durante il trasporto delle cellule, usiamo il flusso di pressione-driven. Il nostro protocollo include istruzioni dettagliate sulla progettazione e fabbricazione del dispositivo, il funzionamento del dispositivo di pressione-driven flusso, la preparazione e l'imaging di cellule, così come l'elaborazione delle immagini per misurare il tempo per le celle a deformare attraverso una serie di costrizioni. Includiamoentrambi i modelli del dispositivo e codice di elaborazione dati di visione come file supplementari. Come un campione rappresentativo di dati, mostriamo tempo di transito cella attraverso una serie di costrizioni in funzione del numero di costrizioni diversi passaggi. Analisi dei tempi per celle di transitare se costrizioni strette di un dispositivo microfluidico può rivelare differenze di deformabilità di una varietà di tipi cellulari ^4,5,13. Il dispositivo dimostrato qui sorveglia unicamente transito cella attraverso una serie di costrizioni micron scala; questo disegno emula il percorso tortuoso che le cellule vivono in circolazione e permette anche sondare le caratteristiche fisiche supplementari di cellule, come tempo di rilassamento.

Protocollo

1 Microfluidic Device Design

NOTA: Il disegno dispositivo ha quattro regioni funzionali di base: porta di entrata, filtro cellule, matrice costrizione, e la porta di uscita (Figura 1). Il disegno complessivo può essere applicato a una vasta gamma di tipi di cellule, con piccoli aggiustamenti alle dimensioni. Purché ecco alcuni consigli di progettazione di base insieme con i parametri del dispositivo che sono efficaci per una selezione di entrambe le cellule primarie e fotografati.

1. Selezionare la larghezza dei canali di matrice costrizione (Figura 1B) a circa il 30-50% del diametro medio delle cellule; Questa costrizione-cellula dimensioni quoziente desse un risultato deformazione delle cellule significativo ma intasamento minimo. Dato un tipo di cellula che non è stato testato in precedenza, è prudente progettare una gamma di larghezze di costrizione da ~ 30-50% il diametro delle cellule per trovare la larghezza ottimale. Come con molti tipi di dispositivi microfluidici, oltre 120 maestri stampi dispositivo possono essere modellati su un peccatogle wafer di silicio da 4 pollici, che consente una serie di disegni di dispositivi diversi per essere fabbricato in un unico processo di fabbricazione.
2. Selezionare l'altezza del canale di almeno il 50% del diametro della cellula; ciò assicura la cella è confinata in 2 dimensioni. Per evitare il collasso canale durante l'incollaggio, accertarsi che le proporzioni canale non meno di 1:10 è (altezza: larghezza) in tutto il dispositivo. Per i canali che devono superare il rapporto di aspetto, aggiungere posti di sostegno per prevenire il collasso. Pali di sostegno spazio ad una distanza che è almeno il doppio del diametro delle cellule, per non ostacolare il flusso delle cellule.
3. Include un filtro nei porti di entrata per rimuovere i detriti e disaggregare ammassi cellulari (Figura 1B). Regolare la dimensione e la spaziatura dei posti di filtro in modo che la distanza che separa i messaggi è approssimativamente pari ad un diametro di cella.
   NOTA: Il limite inferiore di dimensioni funzione è impostata dalla risoluzione alla quale la maschera litografica viene stampato. Assicurarsi che tutte le funzioni sono all'interno delle resoluzione limite specificato dal fornitore di maschera.

2. Le forniture e Preparazione

NOTA: Prima di iniziare qualsiasi esperimento, i seguenti elementi devono essere preparati. Una schematica dell'intero configurazione è dato in Figura 1.

1. Realizzare il maestro dispositivo utilizzando tecniche standard per microlavorazioni litografica ^14,15. Verificare l'altezza delle caratteristiche modellata utilizzando un profilometro.
   NOTA: Mentre master possono essere facilmente fabbricati in un impianto di camera bianca, alcuni laboratori hanno sviluppato metodi di litografia a basso costo per l'uso in un ambiente semi-pulito ^16,17.
2. Preparare la fonte d'aria per il flusso guidato-pressione, utilizzando un serbatoio di aria compressa e la sequenza dei regolatori aria e raccordi (Figura 1A).
   1. Impostare un serbatoio di alimentazione dell'aria e il regolatore manuale.
      NOTA: Una composizione di 5% di CO ₂ in aria mantiene un ambiente simile a un tipico incubato coltura cellularer, ma altre miscele di gas possono anche essere utilizzati.
   2. Impostare un regolatore di pressione a controllo elettronico in linea con il regolatore manuale. Utilizzare un convertitore elettro-pneumatico per regolare e mantenere una caduta di pressione stabile su tutti i canali, con le variazioni di pressione di meno di 2 kPa. Utilizzare il semplice codice scritto in LabVIEW (Informazioni supplementari) per inserire la pressione desiderata.
      NOTA: Il convertitore elettro-pneumatico utilizza un circuito di feedback interno per regolare la pressione di uscita della valvola in modo che corrisponda alla pressione specificata attraverso il dispositivo di microfluidica.
   3. Impostare una camera pressurizzata per guidare il flusso della sospensione cellulare. Assemblare una camera di sospensione cellulare su un citometro a flusso standard tubo e un cappuccio lavorata che crea una guarnizione a tenuta di pressione sul tubo.
      NOTA: Il tappo camera di pressione contiene due orifizi: un ingresso che si collega al serbatoio dell'aria compressa e una presa attraverso il quale le cellule derivano dalla camera in pressione nel dispositivo (Figure 2).
3. Impostare un microscopio invertito dotato di una fotocamera che ha un tasso di acquisizione di almeno 100 fotogrammi al secondo per catturare le immagini delle cellule che attraversano la matrice costrizione. Interfaccia la fotocamera con una scheda di acquisizione video e un computer.
4. Preparare una soluzione madre tensioattivo del 10% w / w Pluronic F-127 in tampone fosfato (PBS), come l'aggiunta di una piccola quantità di F127 alla soluzione multimediale cellule aiuterà a ridurre al minimo l'adesione delle cellule alle pareti PDMS. Per preparare la soluzione F127, vortice e riscaldare lentamente a 37 ° C per sciogliere la F127. Prima dell'uso, passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di tensioattivo in anticipo come vortex e filtraggio genera bolle che persistono per più di 24 ore.

3 Microfluidic Fabrication dispositivo

1. Realizzare blocco PDMS con canali microfluidici.
   1. Mescolare accuratamente PDMS unrapporto ta di 1:10 (w / w) agente indurente alla base.
   2. Versare il composto sopra il master del dispositivo (punto 2.1). Degas in una campana di vetro con il vuoto applicato fino a quando le bolle intrappolate scompaiono, o per circa 10-20 min.
      NOTA: Dopo questo tempo, ci possono essere ancora bolle all'interfaccia aria-PDMS, che è normale; queste saranno tipicamente dissipare durante la cottura. È più critico per garantire che non vi siano bolle rimanenti adiacenti ai canali.
   3. Cuocere il dispositivo degasato a 65 ° C per 4 ore. Per evitare che i canali di collassare, cuocere il dispositivo durante la notte per reticolare ulteriormente le PDMS per un dispositivo con un alto modulo elastico che è più resistente al collasso canale. Tuttavia, nota che si estendeva cottura embrittles anche i PDMS e può portare alla fessurazione quando punzonatura fori (punto 3.3).
2. Rimuovere i dispositivi microfluidici dallo stampo master. Tagliare dispositivi microfluidici individuali fuori del blocco PDMS con una lametta e rimuovere il dispositivo dal paloer. Iniziate sollevando delicatamente un angolo del dispositivo; peeling lento e dolce, in contrasto con il sollevamento del blocco di PDMS verso l'alto, riduce lo stress su entrambi i PDMS e il master.
3. Punch buchi nel dispositivo PDMS per creare porte di connessione per l'accesso tra tubi e microcanali. Creare fori con una biopsia, e punch dal lato canale attraverso il lato esterno del dispositivo.
   NOTA: Un pugno biopsia con un diametro 0,75 millimetri crea buchi che si interfacciano perfettamente con polietereterchetone (PEEK) tubo (diametro esterno = 1/32 "o 0,79 millimetri) o tubo di polietilene (PE-20, diametro esterno = 0,043" o 1,09 millimetri ). Utilizzare un anello di luce per aiutare a visualizzare i fori nei dispositivi con canali poco profondi ^18. Assicurarsi che la biopsia è tagliente; dopo un uso ripetuto all'avanguardia offusca e la biopsia deve essere eliminata e sostituita.
4. Sciacquare il dispositivo PDMS con isopropanolo (HPLC) per rimuovere polvere e depositati pezzi di PDMS. Assicurarsi che ilfori sono chiari di detriti da dirigere un flusso costante di isopropanolo puro da una bottiglia squeeze attraverso i fori. Asciugare con aria filtrata. Dopo la pulizia, posizionare i blocchi PDMS con canali a faccia in su in un piatto pulito Petri per mantenere la pulizia del dispositivo. Se necessario, dispositivi di archiviazione in questa forma fino legame.
5. Pulire il substrato di vetro risciacquando con metanolo (grado HPLC), asciugare con aria filtrata, e mettere su una piastra riscaldante a 200 ° C per 5-10 minuti al fine di garantire il vetro è completamente pulita e asciutta prima del trattamento al plasma.
   NOTA: Il substrato di vetro forma il fondo di ciascun canale. Tipicamente un vetrino sufficiente, dal momento che un obiettivo 10X o 20X è l'ideale per l'imaging più canali in parallelo. Per una maggiore risoluzione delle immagini, legare il dispositivo a un coprioggetto (# 1.5 di spessore).
6. Incollare il dispositivo PDMS al substrato di vetro.
   1. Il plasma ad ossigeno trattare il lato canale del blocco PDMS e 1 parte di un vetrino.
      NOTA: Won una unità di scarico manuale, utilizzare un tempo di trattamento di 1 min, ma ottimizzare il tempo di trattamento per ciascun apparecchio plasma di ossigeno.
   2. Posizionare il lato canale delle PDMS sulla parte superiore del lato trattato del vetro immediatamente dopo il trattamento.
   3. Tenere insieme con una leggera pressione per ~ 10 secondi per promuovere l'incollaggio. Cuocere l'intero dispositivo a temperatura elevata (60-80 ° C) per almeno 15 minuti per migliorare la forza di legame.

4 Deformazione cellule attraverso i canali ristretto

1. Controllare il dispositivo di microfluidica sotto un microscopio. Assicurarsi che i canali non sono crollate o rotti e che entrambi i fori di entrata e uscita si collegano direttamente nei canali del dispositivo utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (10X). Designare dispositivi difettosi segnando la superficie delle PDMS con una lametta e non usarli per esperimenti.
2. Preparare i campioni di coltura cellulare per essere processati. Cellule Cultura usano condizioni standard.
   1. Fo esempio, la cultura HL-60 cellule in terreno RPMI-1640 integrati con la soluzione di penicillina-streptomicina 1% e siero fetale bovino al 10% in 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C.
   2. Per le cellule aderenti, li raccogliere da tripsinizzazione e risospendere in terreno di coltura fresco. Utilizzare un protocollo standard di tripsinizzazione; per esempio, aggiungere ~ 0,5 ml di tripsina ad un pallone con il 25 cm ² area culturale, e risospendere in ~ 30 ml di terreno fresco. Differenziare cellule HL-60 in cellule neutrofili di tipo da parte di tutti-trans retinoico (ATRA) ad una concentrazione finale di 5 mM per 1 x 10 ⁵ cellule / ml come descritto in precedenza ^19,20.
   3. Centrifugare le cellule a 300 xg per 3 minuti, aspirare con cura le cellule surnatante e risospendere alla densità finale appropriato terreno di coltura fresco con 0,1% v / v F-127.
3. Contare le cellule utilizzando un contatore Coulter, emocitometro, o citofluorimetro. Regolare la sospensione cellulare ad una densità di 1 x 10 ⁶ a 5 x 10 ^{6 cellule / ml. Una volta che la densità della sospensione è impostato, supplemento con circa 0,1% v / v F-127.
   NOTA: La densità cellulare e la concentrazione di tensioattivi possono avere bisogno di essere modificato a seconda dei sistemi cellulari particolari; La tabella 1 fornisce una registrazione delle concentrazioni utilizzate in precedenza di cellule e di F-127 per i diversi tipi di cellule.}
4. Mettere sospensione cellulare in un citofluorimetro tubo e collegarlo al tappo a pressione. Prima di collegare il tubo al dispositivo microfluidica, regolare la pressione a circa 14-21 kPa e filo fino alla sospensione cellulare emerge dalla punta del tubo. Questo aiuterà a ridurre al minimo le bolle d'aria nel tubo e il dispositivo.
5. Inserire la punta del tubo contenente la sospensione cellulare nella presa del dispositivo. Se il dispositivo è legato ad un coprioggetto, posizionare il dispositivo su una superficie piana e solida come la fase di microscopio prima di collegare il tubo; il vetrino è fragile e può rompersi in caso contrario.
6. Inserire un pezzo di tubo into l'apertura di uscita e farlo passare in un tubo vuoto per la raccolta dei rifiuti, ad esempio un tubo Falcon vuota attaccata al lato del palco microscopio. Per coerenza nella resistenza fluidica complessiva del dispositivo tra esperimenti, verificare che il tubo di ingresso e uscita è dello stesso diametro e circa la stessa lunghezza per ogni esperimento.
7. Rampa delicatamente la pressione di circa 28 kPa o fino a quando le cellule passano attraverso i canali. Posizionare il dispositivo in modo che i diversi canali sono nel campo visivo e sono perpendicolari al fondo della schermata. Se la fotocamera è limitata dalla dimensione dei dati, acquisire più video per generare un numero sufficiente di punti di dati indipendenti. Regolare il tasso necessario per l'uscita dei dati desiderata telaio. Per catturare cambiamenti nella forma cellulare, utilizzare l'imaging ad alta velocità a 300 fotogrammi al secondo (fps); per misurare i tempi di transito di celle, utilizzare frame rate di circa 100 fps.

Analisi dei dati 5.

1. Aprire il file Master_script.m (scaricabile File supplementare) ed eseguire il programma.
2. Selezionare il primo video da analizzare dalla finestra di Windows Explorer che viene visualizzata. Specificare la frequenza dei fotogrammi per il video selezionato e premere invio.
   NOTA: Una figura apparirà che richiede all'utente di selezionare una finestra di ritaglio rettangolare per il primo video.
3. Selezionare una finestra che comprende tutti i canali da sinistra a destra e interseca i canali appena sopra la prima lampadina della matrice di canali in alto e in basso (Figura 3).
4. Selezionare le regioni costrizione da l'immagine ritagliata. Prestare particolare attenzione a mantenere una distanza fissa di pixel tra la finestra limite superiore e inferiore per ogni video selezionato.
   NOTA: Il bordo superiore della finestra specifica la costrizione più in alto e il bordo inferiore della finestra specifica la costrizione in basso (figura 4); costrizioni intermedie sono approssimate da questo input dell'utente. Successivamente, l'algoritmo mostra le segmentation delle cellule per i primi 50 frame di ogni video (Figura 5).
5. Monitorare l'immagine in alto a sinistra (Figura 5A) strettamente per determinare se l'algoritmo è localizzare con precisione le cellule; un'immagine binarizzata viene sovrapposta al video sorgente per dimostrare la posizione delle cellule identificate.
   NOTA: Le finestre diverse, (Figure 5B-5D) sono per la diagnosi di codice e dimostrano i fotogrammi video dopo le operazioni di elaborazione delle immagini specifiche.
6. Selezionare il video successivo da elaborare dalla finestra di Windows Explorer.
   NOTA: L'algoritmo si Ripetere i passaggi 5,2-5,5 per ogni video selezionato.
7. Selezionare Annulla una volta tutti i video desiderati sono stati aggiunti tramite la finestra di Esplora risorse per istruire la funzione che l'elenco dei video è completa.
   NOTA: L'algoritmo eseguirà le operazioni rimanenti senza l'intervento dell'utente. Questo richiederà circa 1-2 ore a seconda del numero di video trasformati e pe informaticirformance. Al termine, l'algoritmo produrrà un istogramma dei dati di tempo di transito e di salvare i dati nella directory come un file .mat MATLAB e un file xls di Microsoft Excel.

Risultati

Per studiare la deformabilità dei diversi tipi di cellule, cellule di leucemia mieloide umana (HL-60), le cellule differenziate neutrofili, cellule linfocitarie topo, e linee cellulari di carcinoma ovarico umano (OVCAR8, HEYA8) vengono valutati utilizzando la tecnica microfluidica il 'cellulare Deformer'. Risultati rappresentativi per il tempo di transito di HL-60 cellule HL-60 e neutrofili tipo mostrano i tempi per una singola cella di transito attraverso una serie di costrizioni, come mostrato nella F...

Discussione

Qui forniamo una procedura sperimentale completo per l'analisi della deformazione delle cellule che transitano attraverso i canali microfluidici ristretto con flusso pressione-driven. Uno script MATLAB consente l'elaborazione automatica dei dati (Supplemental materiale); di una versione aggiornata del codice è mantenuta ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Più in generale, le tecniche qui presentate possono essere adattati in molti saggi microfluidi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Pressure regulator	Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittings	McMaster Carr	5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView System Design Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable	National Instruments	SHC68-68