Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Özet

Bu mikron çaplı daralması bir düzeni sekansından geçerken hücre için gereken süreden daha ölçmek için mikroflüidik bazlı analiz göstermektedir.

Özet

Burada verimli bir şekilde tek tek hücrelerin çok sayıda deforme değerlendirilmesi için ayrıntılı bir mikroakışkan cihazın tasarımı, imalat, ve Kullanım. Tipik olarak, 10 ~ ² hücreleri için veriler, 1 saat deney içinde elde edilebilir. Otomatik bir görüntü analiz programı ile birkaç saat içinde tamamlanması için olanak sağlama, görüntü verilerinin etkili deney sonrası analiz sağlar. Bizim cihaz geometri hücreleri böylece, ilk ve tek tek hücrelerin deformasyon zamana bağlı gevşeme denenecek sağlayan mikron çaplı boğumların bir dizi deforme gerekmesi açısından benzersizdir. Insan promiyelositik lösemi (HL-60) hücreleri, bu yöntemin uygulanabilirliği gösterilmiştir. Basınçla çalışan akışı kullanılarak mikron çaplı daralması vasıtasıyla deforme hücrelerin sürüş, insan promiyelositik (HL-60) hücreleri kısa bir süre sonra tazyik boyunca daha hızlı bir şekilde pasaj önce 9.3 msn bir ortalama süre boyunca birinci daralma tıkanmıştır gözlemlemekdaralma başına 4.0 msn medyan transit süre ile iyonları. Tersine, all-trans retinoik asit ile tedavi edilmiş (nötrofil tipi) HL-60 hücreleri 3.3 msn bir ortalama geçiş zamanı ile hemen boğumlar boyunca pasaj önce veya 4.3 ms için birinci daralma tıkamak. Bu yöntem hücrelerin viskoelastik doğası içgörü sağlamak ve sonuçta bu davranışın moleküler kökenlerini ortaya çıkarabilir.

Giriş

Hücre şeklinde değişikliklere çok biyolojik bağlamlarda kritik önem taşımaktadır. Örneğin, eritrositler ve lökositler kendi çapından daha küçük olan ¹ kılcal kısımlar boyunca deforme olurlar. Metastaz kanser hücrelerinin ikincil siteler ² de tohum dar interstisyel boşluklar yanı sıra dolambaçlı damar ve lenfatik ağlar aracılığıyla deforme gerekir. Tek tek hücrelerin fiziksel davranış prob için, mikrofluidik cihazlar yeteneklerine dar boşluklar ³ aracılığıyla göç ve pasif mikron çaplı daralmaları ³ ile ⁹ deforme dahil hücre davranışları bir dizi çalışma özelleştirilebilir ideal bir platform sunuyoruz. Polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan cihazlar, hücre deformasyonlar ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve temel görüntü işleme araçları kullanılarak analiz edilmesi sağlanarak, optik şeffaf. Ayrıca, boğumların dizileri tam bir ile eş zamanlı olarak birden fazla hücre analiz sağlayarak, tanımlanabilirBirçok mevcut teknikleri ^10,11 aşıyor çıktı.

Burada 'Hücre Deformer' PDMS mikroakışkan cihazı kullanılarak hücre deformablite sondalama için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Cihaz tasarlanmış sıralı daralması vasıtasıyla hücreler pasaj şekilde karıştırılır; Bu geometri ¹² yatak pulmoner kılcal gibi fizyolojik ortamlarda, yaygındır. Hücre deforme ölçmek için, geçiş zamanı kolaylıkla tek bir daralma ^4,6 transit için tek bir hücre için gereken süre olarak ölçülen, uygun bir ölçü sağlar. Hücre taşıma sırasında daralmış kanalları boyunca sabit bir basınç düşüşü korumak için, biz basınç tahrikli akış kullanın. Bizim protokol hücreleri daralmaları bir dizi deforme için zamanı ölçmek için basınç tahrikli akış, hazırlanması ve hücre görüntüleme yanı sıra görüntü işleme ile cihaz tasarımı ve imalatı, cihazın çalışması hakkında detaylı talimatları içerir. Biz dahilCihaz tasarımları ve ek dosyaları gibi görme veri işleme kodu hem de. Verilerin temsil edici bir örneği olarak, pasajlama boğumların sayısının bir fonksiyonu olarak daralması, bir dizi hücre geçiş süresini gösterir. Transit hücreler için zaman çizelgesi analizi bir mikroakışkan cihazın dar büzülmesina hücre tipleri ^4,5,13 çeşitli deformabilitesi farklılıkları ortaya olsa. Burada gösterilen cihaz benzersiz mikron çaplı daralmaları bir dizi hücre geçişi araştırmaz; Bu tasarım hücreler dolaşıma deneyim ve aynı zamanda gevşeme zamanı gibi hücrelerin ek fiziksel özelliklerini sondalama sağlayan dolambaçlı bir yol benzetilmiştir.

Protokol

1. Mikroakışkan Cihaz Tasarımı

NOT: giriş kapısı, hücre filtre, daralma dizi ve çıkış portu (Şekil 1): cihaz tasarım dört temel fonksiyonel bölgeleri vardır. Genel tasarım boyutları için küçük ayarlamalar ile, hücre tiplerinin geniş bir dizi uygulanabilir. Hem birincil hem ölümsüzleştirdi hücrelerin bir seçim için geçerli olan cihaz parametreleri ile birlikte bir kaç temel tasarım önerileri burada sağladı.

1. Ortalama hücre çapı yaklaşık olarak% 30-50 olduğu bir daralma dizi kanalı (Şekil 1B) genişliğini seçin; Önemli hücre deformasyon ama az tıkanmaya bu daralma-hücre boyutu oranı sonuçları. Daha önce test edilmemiş bir hücre tipini göz önüne alındığında, bu ~% 30-50 den optimum genişliğini bulmak için hücre çapı daralma genişlikleri bir dizi tasarım için ihtiyatlı olduğunu. Microfluidic cihazlar birçok türde olduğu gibi, 120'den fazla cihaz master kalıpları bir günah üzerinde desenli olabilirFarklı cihaz tasarımları bir dizi sağlayan gle 4 inç silikon gofret, tek bir imalat sürecinde imal edilecek.
2. Hücre çapı, en az% 50 olması, kanal yüksekliği seçin; Bu hücre, 2 boyutta sınırlı olmasını sağlar. (: Genişlik yükseklik) cihazın boyunca birleştirme sırasında kanal çöküşü önlemek için, kanal boy oranı az 01:10 den olduğundan emin olun. Bu boy oranını aşması çökmesini önlemek için destek mesajları eklemeniz gerekir kanallar için. Hücre akışını kesmeyecek şekilde en az iki hücre çapı olan bir mesafede alanı destek çubukları.
3. Hücre kümeleri (Şekil 1B) enkaz kaldırmak ve parçalamak için giriş limanlarında bir filtre içerir. Mesaj ayıran mesafe bir hücre çapına hemen hemen eşit olduğu, böylece, filtre mesaj boyut ve aralığa ayarlayın.
   NOT: özelliği büyüklüğünün alt sınırı litografi maskesi yazdırılma kararı ile ayarlanır. Tüm özellikler res içinde olduğundan emin olunmaske tedarikçi tarafından belirtilen lere sınırı.

2. Malzemeleri ve Hazırlık

NOT: Herhangi bir deney başlamadan önce, aşağıdaki öğelerin hazırlanması gerekir. Tüm bir düzeneğin şematik Şekil 1 'de verilmiştir.

1. Taşbaskı mikroişleme ^14,15 standart teknikler kullanılarak cihaz ana imal. Bir profilometre kullanarak desenli özelliklerin yüksekliğini doğrulayın.
   NOT: ustaları kolayca temiz oda tesisinde imal edilebilir olsa da, bazı laboratuvarlar yarı temiz bir ortamda ^16,17 kullanım için ucuz litografi yöntemleri geliştirmiştir.
2. Basınçlı hava, basıncın regüle ve bağlantı parçaları (Şekil 1A) dizisinin bir tank kullanılarak basınçla çalışan akışı için hava kaynağını hazırlayın.
   1. Bir hava besleme tankı ve elle regülatörü ayarlayın.
      Not: havada% 5 _CO2 gibi bir bileşim, tipik bir hücre kültürü incubato edilene benzer bir ortam sağlarR, ama diğer gaz karışımları da kullanılabilmektedir.
   2. Manuel regülatör ile in-line elektronik kontrollü regülatör ayarlayın. Az 2 kPa basınç dalgalanmalarına, düzenleyen ve kanallar boyunca sabit bir basınç düşüşü korumak için bir elektro-pnömatik dönüştürücü kullanın. Girişine LabVIEW yazılmış basit bir kod (Ek Bilgi) istenilen basınç kullanın.
      NOT: elektro-pnömatik dönüştürücü mikroakışkan cihaz üzerinde belirtilen basınç maç için vana çıkış basıncını ayarlamak için bir iç geribildirim döngüsü kullanır.
   3. Hücre süspansiyonunun akışı sürmek için basınçlı bir bölme ayarlayın. Boru standart bir akış sitometresi ile boru üzerinde bir basınç geçirmez bir mühür oluşturan bir makine kapağının üzerinden bir hücre süspansiyonu odasının birleştirin.
      Not: (Figür hücreler cihazın içine basınçlı bölmeden aktıkları bir basınçlı hava tankı bağlanan bir girişi ve bir çıkışı: basınç bölmesi kapağı, iki menfez ihtiva etmektedire 2).
3. Daralma dizi akan hücrelerin görüntüleri yakalamak için saniyede en az 100 kare bir kazanım oranına sahip bir kamera ile donatılmış bir inverted mikroskop ayarlayın. Bir video yakalama kartı ve bir bilgisayar ile kamera arayüzü.
4. PDMS duvarlara hücre yapışmasını en aza indirmek için yardımcı olur, hücre ortamı çözeltisine F127 küçük bir miktarının ilave edilmesi gibi, Pluronic F-127 ağ / fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS)% 10 ağırlık arasında bir yüzey aktif madde stok çözelti hazırlayın. F127 çözündürülmesi için yavaşça 37 ° C F 127 çözeltisi, girdap ve ısı hazırlamak. Kullanmak 0.2 um şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltisinin, ve oda sıcaklığında saklayın önce. Fazla 24 saat boyunca devam edecek kabarcıklar oluşturur vorteks ve filtreleme peşin olarak yüzey aktif madde çözeltisi hazırlayın.

3. Mikroakışkan Cihaz İmalatı

1. Microfluidic kanalları ile PDMS blok Üretiyor.
   1. Mix PDMS iyice1:10 ta oranı (w / w) tabanına sertleştirme maddesi.
   2. Cihaz master (Adım 2.1) üzerine karışımı dökün. Entrapped kabarcıklar kadar uygulanan vakum ile bir fanus içinde Degas kaybolur, ya da yaklaşık 10-20 dk.
      NOT: Bu süre sonunda, normal olması, hava-arayüzü PDMS, en kabarcıklar olabilir; Bu genellikle pişirme sırasında dağılacaktır. Bu kanallara bitişik hiçbir kalan kabarcıkların yok olmasını sağlamak için en çok önemlidir.
   3. 4 saat 65 ° C'de gazı giderilmiş cihazı pişirilir. Çöken kanalları engellemek için, daha fazla kanal çökmeye karşı daha fazla dirençli olan daha yüksek bir elastik modüle sahip olan bir cihaz için PDMS çapraz bağlanması için gece boyunca fırında cihazı. Ancak, pişirme genişletilmiş notu da PDMS embrittles ve delikleri (3.3 Adım) delme sırasında çatlamalara yol açabilir.
2. Ana kalıp mikroakışkan aygıtları çıkarın. Bir jilet ile PDMS blok üzerinden bireysel microfluidic cihazlar kesin ve direkte aygıtı kaldırıner. Yavaşça cihazın bir köşesini kaldırarak başlayın; düz yukarı PDMS bloğunu kaldırma aksine yavaş ve nazik soyma, PDMS ve usta hem stresi azaltır.
3. PDMS cihazın Punch delik tüp ve mikrokanalların arasındaki erişimi için bağlantı noktaları oluşturmak için. Biyopsi zımbası ile delik oluşturmak ve cihazın dış tarafına doğru kanal taraftan punch.
   NOT: Bir 0.75 mm delik çapına sahip bir biyopsi yumruk polietereterketon ile mükemmel delikleri (PEEK) boru (dış çapı = 1/32 "veya 0.79 mm) veya polietilen boru (PE-20, dış çapı = 0.043" veya 1.09 mm bu arabirim oluşturur ). Sığ kanalları ¹⁸ ile cihazlarda delik görselleştirmek yardımcı olmak için bir halka ışık kullanın. Biyopsi yumruk keskin olduğundan emin olun; sonra kesme kenarı dulls tekrar tekrar kullanılması ve biyopsi yumruk atılır ve değiştirilmesi gerekir.
4. PDMS toz ve teslim parçalarını kaldırmak için izopropanol (HPLC saflıkta) ile PDMS cihaz durulayın. Emin olunaçılmış delikler deliklerden sıkmak şişe saf izopropanolün akışı yönlendirerek enkaz açıktır. Filtrelenmiş hava ile kurutma. Temizlikten sonra, kanalları yer PDMS blok cihaz temizliğini korumak için temiz bir Petri kabındaki kadar yüz. Bağlama kadar bu formda depolamak cihazları da temin etmektedir.
5. , Metanol (HPLC kalitesinde) ile durulama cam yüzeyin temizliği filtrelenmiş hava ile kurutma ve cam plazma tedavi öncesi tamamen temiz ve kuru olduğundan emin olmak için 5-10 dakika için 200 ° C ocak üzerine yerleştirin.
   NOT: cam substrat her bir kanalın alt oluşturur. 10X veya 20X objektif paralel birden çok kanal görüntüleme için ideal olduğundan Tipik bir cam slayt, yeterlidir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, bir lamel (# 1.5 kalınlığında) cihazı bağ.
6. Cam alt-tabakaya bağlanması PDMS cihaz.
   1. Oksijen plazma kanal PDMS bloğunun yana ve bir cam slayt 1 tarafa tedavi.
      NOT: Welle tutulan bir deşarj ünitesinin inci, 1 dakikalık bir zaman kullanarak tedavi, ancak her oksijen plazma düzeneği için olan bir tedavi süresini optimize eder.
   2. Işlemden hemen sonra camın muameleli taraf üzerine PDMS kanal yan.
   3. Için hafif bir basınç ~ ile birlikte yapışmasını sağlayan 10 saniye tutun. En az 15 dakika boyunca yüksek bir sıcaklıkta (60-80 ° C), tüm cihaz fırında bağ gücünü artırmak için.

4. daraltılmış Kanalları aracılığıyla Hücreleri deformasyonlara

1. Bir mikroskop altında mikroakışkan cihazı kontrol edin. Kanallar çöktü veya kırık olmadığından emin olun ve her iki giriş ve çıkış delikleri düşük güç objektif (10X) ile cihaz kanalları doğrudan bağlayın. Bir jilet ile PDMS yüzeyini puanlama tarafından arızalı cihazları tayin ve deneyler için bunları kullanmayın.
2. Hücre kültürü numuneleri hazırlamak denenecek. Standart koşullar kullanılarak kültür hücreleri.
   1. Fya da, örneğin, 37 ° C'de _CO2 inkübatör içinde% 5,% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu ve% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde kültür HL-60 hücreleri.
   2. Yapışık hücreler için, taze büyüme ortamına, tripsinizasyon ve tekrar süspansiyon ile hasat. Standart trypsinization protokolü kullanın; , örneğin, 25 ^cm2 kültür alanı olan bir şişeye ~ 0.5 mi tripsin ekleyin ve ~ 30 ml taze ortam içerisinde yeniden süspanse edin. Daha önce tarif edildiği gibi 1 ^19,20 x 10 ⁵ hücre / ml 5 uM'lik bir nihai konsantrasyonda, all-trans retinoik (ATRA) ile nötrofil tipi hücreler içine, HL-60 hücreleri ayırt edebilecektir.
   3. Santrifüj 3 dakika boyunca 300 x g'de hücreler, dikkatli bir şekilde 0.1% h / h, F-127 ile taze kültür ortamında uygun nihai yoğunluk için süpernatan aspire ve süspansiyon hücreleri.
3. Coulter sayacı, Hemasitometre hücreleri saymak, ya da akış sitometresini. 1 x 10 x 10 ⁶ ila 5 arasında bir yoğunluğa hücre süspansiyonu ayarlama kadar. Süspansiyon yoğunluğu ayarlandığında, yaklaşık olarak% 0.1 h / h, F-127 ile destek olarak kullanılabilir.
   Not: Hücre yoğunluğu ve yüzey aktif madde konsantrasyonu, belirli bir hücre sistemlerine bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir Tablo 1 farklı hücre tiplerinin hücre ve F-127 önceden kullanılan konsantrasyonlarının bir kaydını sağlar.
4. Borunun bir akış sitometresinde hücre süspansiyonu yerleştirilir ve basınç kapağı bağlanır. Hücre süspansiyonu borunun ucundan çıkana kadar mikroakışkan cihaza bir bağlantı tüpü önce, yaklaşık 14-21 kPa basınç ve çalkalama ayarlayın. Bu boru ve aygıt hava kabarcıklarını azaltmaktadır.
5. Cihazın girişine hücre süspansiyonu ihtiva eden boru ucu takın. Cihaz, bir lamel bağlıdır, bu tür bir bağlantı tüpü önce, mikroskop aşamasının gibi düz ve katı bir yüzey üzerinde yerleştirilmiş olduğundan; lamel kırılgan olduğu ve aksi takdirde kırılabilir.
6. Boru int bir parça takınatık toplama için boş bir tüp içine çıkış ağzının ve mesafe de o bu şekilde, mikroskop aşamasının tarafına bantlanmış boş bir Falcon tüpüne gibi. Deneyler arasında, cihazın genel akışkan direnç tutarlılık için, giriş ve çıkış boruları her bir deney için, aynı çapta ve yaklaşık olarak aynı uzunlukta olduğundan emin olun.
7. Yavaşça yaklaşık 28 kPa veya hücreleri kanallarda aktığı kadar basıncı artırmak. Birden fazla kanal görüş alanında bulunmaktadır ve ekranın alt kısmına dik olacak şekilde konumlandırın cihazı. Kamera veri boyutu ile sınırlı ise, bağımsız veri noktaları yeterli sayıda üretmek için birden fazla videoları kazanır. İstediğiniz veri çıkışı için gerekli kare hızını ayarlayın. Saniyede 300 kare (fps) yüksek hızda görüntüleme kullanmak, hücre şekli değişiklikleri yakalamak için; , hücrelerin transit sürelerini ölçmek yaklaşık 100 fps kare hızları kullanmak için.

5. Veri Analizi

1. Mast dosya açmaer_script.m (İndirilebilir Ek Dosya) ve programı çalıştırın.
2. Ilk video seçin görünen Windows Gezgini penceresinden analiz edilecek. Seçilen video için kare hızını belirtin ve enter tuşuna basın.
   NOT: Bir rakamın ilk video için bir dikdörtgen kırpma pencere seçmek için kullanıcıya sorar görünecektir.
3. Soldan sağa tüm kanalları kapsar ve sadece üst ve alt (Şekil 3) en kanalların dizinin ilk ampulün yukarıda kanalları ile kesişen bir pencere seçer.
4. Kırpılmış görüntü daralma bölgeleri seçin. Seçilen her video için üst ve alt pencere sınırı arasındaki sabit bir piksel mesafeyi korumak için özel dikkat gösterin.
   NOT: Üst pencere kenarı üstteki daralma ve alt pencere kenarı belirten alttaki daralma (Şekil 4) belirtir; ara büzülmesina Bu kullanıcı girişi yaklaştırılır. Daha sonra, algoritma s görüntülerher videonun ilk 50 kare için hücrelerin egmentation (Şekil 5).
5. Algoritma doğru hücreleri bulma olup olmadığını belirlemek için yakından sol üst görüntü (Şekil 5A) izlemek; Bir ikilileştirilmiş görüntü tespit hücrelerin yerini göstermek için kaynak video bindirilir.
   NOT: farklı pencereler (Şekil 5B-5D) kodu tanı için ve belirli görüntü işleme operasyonları sonrası video kareleri göstermektedir.
6. Sonraki videoyu seçin Windows Gezgini penceresinden işlenecek.
   NOT: tekrarlayacak algoritma seçilen her video için 5.2-5.5 adımları.
7. Iptal seçeneğini kez tüm istenen videoları video listesi tamamlandığında fonksiyonunu talimat Windows Gezgini penceresinde yoluyla ilave edilmiştir.
   NOT: algoritma kullanıcı müdahalesi olmadan kalan işlemleri gerçekleştirecektir. Bu işlenmiş video ve bilgisayar pe sayısına bağlı olarak yaklaşık 1-2 saat sürerrformance. Tamamlandığında, algoritma transit süresi verilerin bir histogram üretecek ve MATLAB .mat dosyası ve bir Microsoft Excel xls dosyası olarak dizine verileri kaydetmek.

Sonuçlar

Farklı hücre tipleri, insan miyeloid lösemi hücreleri (HL-60), nötrofil farklılaşmış hücreleri, fare lenfosit hücreleri ve insan yumurtalık kanseri hücre hatları (OVCAR8, HEYA8) 'nin deforme araştırılması' Hücre deformer 'mikroakışkan tekniği kullanılarak değerlendirilir. Şekil 6'da gösterildiği gibi HL-60 ve nötrofil tipinde HL-60 hücrelerinin geçiş süresi için tipik sonuçlar, boğumların bir dizi geçiş için tek bir hücre için gereken süreden dah...

Tartışmalar

Burada basınç tahrikli akışını kullanarak büzüldü microfluidic kanallardan transit hücrelerinin deformasyonu analiz etmek için kapsamlı bir deneysel prosedür sağlar. MATLAB komut otomatik veri işleme (Ek Malzeme) sağlar; kod güncelleştirilmiş bir sürümü (korunur www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Daha genel olarak, burada sunulan teknikler sitoskeletal etkisi ve nükleer sertleştirme ajanlan ^24,23 hem de kanserli hücre tiple...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Pressure regulator	Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittings	McMaster Carr	5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView System Design Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable	National Instruments	SHC68-68