미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

요약

우리는 미크론 크기의 긴축의 시퀀스를 통해 전송하여 셀에 대한 척도를 측정하기 위해 마이크로 유체 기반 분석을 보여준다.

초록

여기서 효율적인 방식으로 개별 셀의 다수의 변형성을 평가 상세보기 미세 유동 장치의 설계, 제조 및 사용을 우리. 통상적으로, ² ~ 10 셀의 데이터는 실험 1 시간 내에 취득 할 수있다. 자동화 된 영상 분석 프로그램을 몇 시간 내에 완료 될 수 있도록 처리를, 화상 데이터의 효율적인 사후 실험 분석을 가능하게한다. 우리의 디바이스 구조는 세포가함으로써 초기 변형과 개별 셀의 시간 의존 휴식 정량 될 수 있도록, 마이크론 스케일의 긴축 일련 변형해야한다는에서 독특하다. 인간 전 골수성 백혈병 (HL-60) 세포에이 방법의 적용은 입증된다. 압력 중심의 흐름을 사용하여 마이크론 규모의 긴축을 통해 변형 세포를 운전, 우리는 인간의 전골 (HL-60) 세포가 일시적으로 후속 수축을 통해보다 신속하게 계대 전에 9.3 밀리의 평균 시간에 대한 최초의 수축을 막다 관찰수축 당 4.0 밀리의 평균 통과 시간과 이온. 대조적으로, 모든 트랜스 레티노 산 처리 (호중구 형) HL-60 세포를 3.3 밀리의 중앙값 통과 시간과 후속 긴축을 통해 계대 전에 단지 4.3 밀리위한 첫번째 수축을 흡장. 이 방법은 세포의 점탄성 특성에 대한 통찰력을 제공하고, 궁극적으로이 문제의 분자 기원을 밝힐 수 있습니다.

서문

세포 모양의 변화는 많은 생물학적 상황에서 중요하다. 예를 들어, 적혈구 및 백혈구는 자신의 지름이 ^1보다 작은 모세관을 통해 변형. 전이에있어서, 암 세포는 ² 차 사이트에서 시드 좁은 틈새 간격뿐만 아니라 비틀린 혈관 및 림프관을 통해 네트워크를 변형한다. 개별 셀의 물리적 행동을 조사하기 위해, 마이크로 유체 장치는 자신의 능력 좁은 틈 ^3를 통해 마이그레이션하는 수동적 마이크론 규모의 긴축 ^{3 구를} 통해 변형을 포함하여 세포 행동의 범위를 연구하기 위해 사용자 정의 할 수있는 이상적인 플랫폼을 제시한다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)은 미세 유동 장치 세포 변형이 광학 현미경을 이용하여 가시화하고 기본적인 화상 처리 도구를 사용하여 분석 할 수 있도록 광학적으로 투명하다. 또한, 긴축 배열 정확하게 동시에 여러 셀의 분석을 가능하게 정의 될 수있다많은 기존의 기술 ^{10, 11을} 초과 처리량.

여기에서 우리는 '셀 붙은'PDMS 미세 유체 장치를 사용하여 세포 변형성을 프로빙에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 장치 설계 순차 긴축을 통해 세포가 통과되도록; 이 형상은 ¹² 침대 폐동맥과 같은 생리 학적 맥락에서 일반적입니다. 셀 변형성을 측정하기 위해, 전송 시간은 용이하게 단일 함입 ^4,6 통해 통과하여 개별 셀에 필요한 시간으로서 측정되는 편리한 메트릭을 제공한다. 세포 교통 동안 제한된 채널에서 일정한 압력 강하를 유지하기 위해, 우리는 압력 중심의 흐름을 사용합니다. 우리 프로토콜은 세포가 긴축의 일련의 변형에 대한 시간을 측정하는 압력 구동 흐름, 제조 및 세포 영상뿐만 아니라, 화상 처리에 의해 디바이스 설계 및 제조 장치의 동작에 대한 자세한 설명을 포함한다. 우리는 포함디바이스 설계 및 보조 파일로 시청 데이터 처리 코드가 모두. 데이터의 대표적인 샘플로서, 우리는 긴축 계대 수의 함수로서 일련의 긴축을 통해 셀 전송 시간을 나타낸다. 전송에 대한 척도 세포 분석 미세 유동 장치의 좁은 긴축은 ^4,5,13 세포 유형의 다양한 변형성의 차이를 밝힐 수 있지만. 여기서 입증 장치 고유 미크론 규모의 긴축 일련 세포 교통을 조사한다; 이 디자인은 세포 순환 경험과 또한 완화 시간으로서 세포의 추가적인 물리적 특성을 프로빙을 가능하게 비틀린 경로를 에뮬레이트한다.

프로토콜

1 미세 유체 장치 설계

참고 : 입력 포트, 휴대 필터, 수축 배열하고, 출력 포트 (그림 1) : 장치의 디자인은 네 가지 기본 기능 영역이 있습니다. 전체적인 설계 치수에 약간의 조정으로, 세포 유형의 다양한 배열에 적용될 수있다. 모두 기본 및 불후의 세포의 선택을위한 효과적인 장치 매개 변수와 함께 몇 가지 기본적인 디자인 권장 사항은 현재 위치를 제공한다.

1. 평균 기포 직경의 약 30 % ~ 50 %로 수축 어레이 채널 (도 1B)의 폭을 선택; 상당한 세포 변형을 최소화하지만 막힘이 수축 - 대 - 셀 크기 비율 결과. 이전에 테스트 한 세포 유형을 고려할 때 ~ 30 % ~ 50 %에서 최적의 폭을 알 수 기포 직경을 수축 폭의 범위를 설계 현명하다. 마이크로 유체 장치의 여러 유형과 마찬가지로, 120 장치 마스터 금형은 죄에 패터닝 할 수있다다른 디바이스 설계의 배열을 가능 GLE 4 인치 실리콘 웨이퍼, 단일 제조 공정에서 제조 될 수있다.
2. 셀 직경의 적어도 50 %로 신장 채널을 선택; 이는 셀이 2 차원 적으로 한정된다 보장한다. (: 폭 높이) 장치를 통해 결합시 채널의 붕괴를 방지하기 위해, 채널 화면 비율이 더 적은 1시 10분보다 있는지 확인합니다. 이 화면 비율을 초과 붕괴를 방지하기 위해 지지대를 추가해야합니다 채널하십시오. 셀 흐름을 방해하지 않도록 적어도 두 셀 직경 거리에 공간 지지대.
3. 세포 클러스터 (그림 1B)를 이물질을 제거하고 해리하는 할 수있는 입력 포트에서 필터를 포함합니다. 글 분리 거리가 하나의 셀 직경과 거의 같도록 필터 포스트들의 크기와 간격을 조정한다.
   NOTE : 피처 크기의 하한은 리소그래피 마스크가 인쇄 된 해상도에 의해 설정된다. 모든 기능은 입술 이내인지 확인마스크 공급 업체가 지정한 해결 방법 제한.

2 소모품 및 준비

참고 : 어떤 실험을 시작하기 전에 다음 항목을 준비해야합니다. 전체 설치의 개략도는 그림 1에 제시되어있다.

1. 마이크로 리소그래피 ^14,15위한 표준 기술을 이용하여 디바이스를 제조 마스터. 프로파일로 미터를 사용하여 패터닝 된 피처의 높이를 확인한다.
   NOTE : 마스터 용이 청정 설비에서 제작 될 수 있지만, 일부 실험실 세미 ^16,17 깨끗한 환경에서 사용하기위한 저렴 리소그래피 방법을 개발 하였다.
2. 압축 공기와 공기 조절기 및 액세서리 (그림 1A)의 시퀀스의 탱크를 사용하여, 압력 중심의 흐름 공기 소스를 준비합니다.
   1. 공기 공급 탱크 및 수동 조절을 설정한다.
      주 : 공기에서 5 % CO _{2 조성물은} 통상적 인 세포 배양으로 incubato 유사한 환경을 유지R이지만, 다른 가스 혼합물을 사용할 수도있다.
   2. 수동 레귤레이터의 온라인 전자 제어 압력 조절기를 설정합니다. 2 미만의 kPa의 압력 변동으로 조절하고 채널에 걸쳐 안정한 압력 강하를 유지하는 전공 변환기를 사용한다. 입력 LabVIEW에서 작성된 간단한 코드 (보충) 원하는 압력을 사용합니다.
      주 : 전공 변환기는 미세 유동 장치를 통해 지정된 압력과 일치하도록 밸브 출구 압력을 조정하는 내부 피드백 루프를 사용한다.
   3. 세포 현탁액의 흐름을 구동하기 위해 가압 챔버를 설정합니다. 튜브 사이토 표준 흐름과 튜브에 압력 단단히 밀착 가공 캡에서 세포 현탁액 챔버를 조립합니다.
      NOTE : (Figur를 세포 장치로 가압 챔버로부터 유입되는 압축 공기 탱크에 연결된 유입구 및 배출구 : 압력 실 캡이 오리피스를 포함예 2).
3. 함입 배열을 통해 흐르는 셀의 이미지를 캡처하는 초당 최소 100 프레임의 획득 속도를 갖는 카메라가 장착 도립 현미경을 설정한다. 비디오 캡처 카드와 컴퓨터와 카메라 인터페이스.
4. PDMS 벽에 세포 부착을 최소화 할 수 휴대 미디어 용액 F127 소량의 추가 등의 플루로 닉 F-127 w / 인산염 완충 식염수 (PBS) w 10 % 스톡 계면 활성제 용액을 제조 하였다. F127을 용해 부드럽게 37 ° C에서 F127 솔루션, 소용돌이와 열을 준비합니다. 사용 0.2 μM 주사기 필터를 통해 용액을 통과하고, 실온에서 보관 전. 이상 24 시간 동안 지속됩니다 거품을 생성 소용돌이로 교반 및 필터링과 같은 사전에 계면 활성제 용액을 준비합니다.

3 미세 유체 소자의 제작

1. 미세 유체 채널 PDMS 블록을 제작합니다.
   1. 믹스 PDMS 철저1:10 따 비율 (w w /)베이스에 경화제.
   2. 장치 마스터 (2.1 단계)을 통해 혼합물을 따르. 포획 거품까지 적용 진공 벨 항아리에 드가 사라, 또는 약 10 ~ 20 분.
      참고 :이 시간이 지나면 여전히 정상적인 공기 PDMS 인터페이스에 거품이있을 수 있습니다; 다음은 일반적으로 베이킹 중에 방출됩니다. 이 채널에 인접한 더 남아있는 거품이 없는지 확인하는 것이 가장 중요합니다.
   3. 4 시간 동안 65 ° C에서 탈기 장치를 굽는다. 붕괴 채널을 방지하기 위해, 상기 채널 붕괴에 더 내성이 높은 탄성 계수와 장치의 PDMS를 가교 밤새 장치 굽는다. 그러나, 베이킹 확장 참고 또한 PDMS를 취화 및 구멍 (3.3 단계) 펀칭 경우 균열이 발생할 수 있습니다.
2. 마스터 몰드로부터 미세 유체 장치를 제거합니다. 면도날 PDMS 블록 중 개별 미세 유체 장치를 잘라 마스트에서 장치를 제거어. 부드럽게 장치의 한 모서리를 들어 올려 시작; 똑바로 PDMS 블록을 해제에 반대 느리고 부드러운 박리, PDMS 마스터 모두에서 스트레스를 줄일 수 있습니다.
3. PDMS 장치에 펀치 구멍 튜브와 마이크로 사이의 액세스를위한 연결 포트를 만들 수 있습니다. 생검 펀치를 사용하여 홀을 만들고 장치의 외부 측면에 이르기까지 채널 사이드로부터 펀치.
   주 : 0.75 mm 구멍 크기를 가진 생검 펀치는 폴리 에테르 에테르 케톤과 완벽하게 구멍 (PE​​EK) 튜브 (외경 = 32 분 "또는 0.79 mm) 또는 폴리에틸렌 관 (PE-20, 외경 = 0.043"또는 1.09 mm를 해당 인터페이스를 생성 ). 얕은 채널 ^18와 장치에 구멍을 시각화하는 데 도움이되는 링 라이트를 사용합니다. 생검 펀치 날카로운해야합니다; 후 절삭 날이 둔하게 사용을 반복 생검 펀치는 폐기하고 교체해야합니다.
4. PDMS의 먼지와 제기 덩어리를 제거하는 이소프로판올 (HPLC 등급)와 PDMS 장치를 씻어. 확인펀치 구멍 구멍을 통해 스퀴즈 병에서 순수한 이소프로판올를 일정하게 연출하여 부스러기입니다. 여과 된 공기와 바람을 불어 건조시킵니다. 청소 한 후 채널 장소 PDMS 블록 장치의 청결을 유지하기 위해 깨끗한 페트리 접시에 직면하고 있습니다. 결합 될 때까지이 형태로 저장 장치를 요구하는 경우.
5. 메탄올 (HPLC 등급)로 세척하여 유리 기판을 청소 여과 된 공기와 바람을 불어 건조하고, 유리가 플라즈마 처리 전에 완전히 깨끗하고 건조하기 위해 5 ~ 10 분 동안 200 ° C의 열판에 배치합니다.
   주 : 유리 기판은 각 채널의 바닥을 형성한다. 10X 20X 대물 또는 병렬로 다수의 채널을 이미징 이상적이므로 일반적으로 유리 슬라이드가 충분하다. 고해상도 영상의 경우, 커버 슬립 (# 1.5 두께)에 접합 장치.
6. 유리 기판 상에 PDMS 소자를 접합.
   1. 산소 플라즈마는 채널 PDMS 블록의 측면과 유리 슬라이드 (1) 측의 치료.
      참고 : W휴대용 토출 부 i 번째, 1 분의 처리 시간을 사용하지만, 각각의 산소 플라즈마 장치의 처리 시간을 최적화한다.
   2. 즉시 치료 후 유리의 처리 측면의 상단에있는 PDMS의 채널 측 놓습니다.
   3. 에 대한 가벼운 압력 ~와 함께 결합을 촉진하기 위해 10 초를 잡습니다. 적어도 15 분 동안 상승 된 온도 (60 ~ 80 °의 C)에서 구워 장치 전체의 접합 강도를 향상시킬 수있다.

4 제한된 채널을 통해 세포를 변형

1. 현미경으로 미세 유체 장치를 검사합니다. 채널이 축소 또는 고장이 아닌지 확인하고 모두 입구와 출구 구멍 저전력 목적 (10X)를 사용하여 디바이스 채널에 직접 연결하는 것이. 면도날로 PDMS의 표면을 득점하여 결함 장치를 지정하고 실험에 사용하지 않습니다.
2. 세포 배양 샘플을 준비하는 정량한다. 표준 조건을 이용하여 세포를 배양.
   1. F또는 예를 들어, 37 ° C에서 CO ₂ 배양기 5 %에서 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 배양 HL-60 세포.
   2. 부착 세포의 경우, 신선한 성장 배지에 재현 탁하고 트립신 처리하여 그들을 수확. 표준 트립신 프로토콜을 사용하여; 예를 들어, 25cm ^두 문화 영역과 플라스크에 ~ 0.5 ml의 트립신을 추가하고, ~ 30 ㎖의 신선한 매체에서 재현 탁. 이전 ^{19,20 바와 같이,} 1 × ¹⁰⁵ 세포 / ml 당 5 μM의 최종 농도에서 모든 트랜스 레티노 (ATRA)에 의해 호중구 형 세포에 HL-60 세포를 분화.
   3. 원심 분리기는 3 분 동안 300 XG에 세포를 조심스럽게 0.1 % v / V를 F-127와 신선한 문화 매체의 해당 최종 밀도가 뜨는에 resuspend 세포를 대기음.
3. 콜터 카운터, hemacytometer를 사용하여 세포를 계산하거나, 유동 세포 계측기. 1 × ¹⁰⁶ ~ 5 × 105의 밀도로 세포 현탁액을 조정 까지. 서스펜션 밀도가 설정되면, 약 0.1 % v / V를 F-127과 보완.
   NOTE : 세포 밀도 및 계면 활성제의 농도는 특히 전지 시스템에 따라 수정 될 필요가있다; 표 1은 다른 세포 유형에 대한 세포 및 F-127의 이전에 사용 된 농도의 기록을 제공한다.
4. 관 유동 세포 계수기에 세포 현탁액을 놓고 압력 캡에 연결합니다. 세포 현탁액은 튜브의 끝에서 나온다 때까지 미세 유체 장치에 튜브를 연결하기 전에, 약 14 ~ 21 kPa의에 대한 압력과 높이를 조정합니다. 이것은 배관 및 장치에 기포를 최소화 할 것이다.
5. 장치 입구에 세포 현탁액을 함유하는 튜브의 팁을 삽입한다. 장치가 커버 슬립에 결합되는 경우, 그러한 배관을 연결하기 전에 현미경 스테이지로서 편평한 고체 표면 상에 장치를 배치; 커버 슬립은 허약하고, 그렇지 않으면 중단 될 수 있습니다.
6. 튜브 INT의 조각을 삽입폐기물 수집 빈 튜브에 출구 포트 및 라우팅을 O 이러한 현미경 스테이지의 측면을 녹화 빈 팔콘 튜브 등. 실험 사이의 장치의 전체 유체 저항의 일관성을 위해, 입구 및 출구 배관은 각 실험에 대해 동일한 직경과 대략 동일한 길이가되도록.
7. 부드럽게 약 28 kPa의 세포 또는 채널을 통해 흐를 때까지 압력을 램프 업 (ramp up). 여러 개의 채널들이 시야에있는 스크린의 하단에 수직하도록 배치 장치. 카메라 데이터의 크기에 의해 제한되는 경우, 독립적 인 데이터 지점의 충분한 수를 생성하기 위해 복수의 영상을 획득. 원하는 데이터 출력을 위해 필요한 프레임 레이트를 조정한다. 초당 300 프레임 (fps)의 고속 영상을 사용하여, 세포 모양의 변화를 캡처하려면; 세포의 이동 시간을 측정 약 100 프레임의 프레임 레이트를 사용한다.

(5) 데이터 분석

1. 파일 돛대를 엽니 다er_script.m (다운로드 보충 파일) 프로그램을 실행합니다.
2. 첫 번째 비디오를 선택 표시되는 Windows 탐색기 창에서 분석 할 수 있습니다. 선택한 비디오의 프레임 속도를 지정하고 enter 키를 누릅니다.
   참고 : 그림은 그 첫 번째 비디오 직사각형 자르기 창을 선택하라는 메시지가 나타납니다.
3. 왼쪽에서 오른쪽으로 모든 채널을 포함하고 단지 상부 및 하부 (도 3)에서 채널 어레이의 상기 제 전구 채널 교차 윈도우를 선택한다.
4. 잘라낸 이미지에서 수축 영역을 선택합니다. 선택한 모든 비디오의 상단과 하단 창 경계 사이의 고정 픽셀 거리를 유지하기 위해 특별한주의를 기울이십시오.
   참고 : 창 상단의 모서리가 맨 위의 수축 및 바닥 창 가장자리를 지정은 맨 밑의 수축 (그림 4)을 지정; 중간 긴축이 사용자의 입력에서 근사된다. 다음으로, 알고리즘 S를 표시각 비디오의 첫 번째 50 프레임에 대한 세포의 egmentation (그림 5).
5. 알고리즘이 정확하게 세포의 위치하는지 확인하는 데 밀접하게 왼쪽 상단 이미지 (그림 5A)를 모니터; 치화 화상 식별 셀의 위치를​​ 보여주기 위해 비디오 소스 상에 중첩된다.
   NOTE : 다른 윈도우 (도 5B-5D)는 코드 진단하고 특정 이미지 처리 동작 후의 비디오 프레임들을 보여준다.
6. 다음 비디오를 선택 Windows 탐색기 창에서 처리 할 수​​ 있습니다.
   참고 : 반복됩니다 알고리즘이 선택한 각 동영상에 대한 5.2-5.5 단계를 반복합니다.
7. 취소 선택하면 원하는 모든 비디오는 동영상 목록이 완료 함수를 지시하는 Windows 탐색기 창을 통해 추가되었습니다.
   주 : 알고리즘은 사용자 개입없이 나머지 작업을 수행합니다. 이렇게 처리 된 비디오 및 컴퓨터 PE의 수에 따라 약 1 ~ 2 시간이 걸릴 것이다rformance. 완료되면, 알고리즘은 전송 시간 데이터의 히스토그램을 생성하며 MATLAB의 .mat 파일과 마이크로 소프트 엑셀과 같은 .xls 파일 디렉토리에 데이터를 저장한다.

결과

서로 다른 세포 유형, 인간 골수성 백혈병 세포 (HL-60), 분화 호중구 세포, 마우스 림프구 세포 및 인간 난소 암 세포주 (OVCAR8, HEYA8)의 변형성을 조사하기 위해 '셀 붙은'마이크로 유체 기술을 이용하여 평가된다. 도 6에 도시 된 바와 같이 HL-60, 호중구 형 HL-60 세포의 통과 시간에 대한 대표적인 결과는 긴축의 시리즈를 통해 통과하여 단일 세포에 대한 척도를 나타낸다. 트랜 시트 ...

토론

여기에서 우리는 압력 중심의 흐름을 이용하여 수축 미세 유체 채널을 경유하는 세포의 변형을 분석하기위한 포괄적 인 실험 절차를 제공합니다. MATLAB 스크립트는 자동 데이터 처리 (보충 자료)를 할 수 있습니다; 코드의 업데이트 된 버전 (유지 www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). 더 광범위하게, 여기에 제시된 기술은 세포 골격의 효과 및 핵 경화제 ^24,23?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Pressure regulator	Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittings	McMaster Carr	5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView System Design Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable	National Instruments	SHC68-68