Une technique microfluidique à la sonde cellulaire Déformabilité

Résumé

Nous démontrons un dosage à base de microfluidique pour mesurer les délais pour les cellules de transiter par une séquence d'étranglements l'échelle du micron.

Résumé

Ici, nous décrivons la conception, la fabrication et l'utilisation d'un dispositif microfluidique pour évaluer l'aptitude à la déformation d'un grand nombre de cellules individuelles d'une manière efficace. Généralement, les données pour ~ 10 ² cellules peuvent être acquises dans le cadre d'une expérience de 1 heure. Un programme d'analyse d'image automatisée permet une analyse efficace post-expérience de données d'image, permettant un traitement pour être terminée en quelques heures. Notre géométrie du dispositif est unique en ce que les cellules doivent se déformer à travers une série de rétrécissements l'échelle du micron, ce qui permet la déformation initiale et la détente en fonction du temps de cellules individuelles à doser. L'applicabilité de cette méthode de leucémie promyélocytaire humaine (HL-60) cellules est démontrée. Cellules conduire à déformer par des constrictions l'échelle du micron en utilisant débit commandé par la pression, nous observons que promyélocytaire humaine (HL-60) cellules occlusion momentanément le premier étranglement pour une durée médiane de 9,3 msec avant repiquage plus rapidement à travers la constriction ultérieureions avec un temps de transit moyen de 4,0 ms par constriction. En revanche, (de type neutrophile) tout-trans rétinoïque traité à l'acide cellules HL-60 occlusion de la première constriction seulement 4,3 msec avant repiquage à travers les étranglements ultérieures avec un temps de transit médian de 3,3 msec. Cette méthode peut donner un aperçu de la nature viscoélastique des cellules, et finalement révéler les origines moléculaires de ce comportement.

Introduction

Les changements dans la forme des cellules sont essentielles dans de nombreux contextes biologiques. Par exemple, les erythrocytes et les leucocytes se déforment à travers des capillaires plus petits que leur diamètre ^1. Dans les métastases, les cellules cancéreuses doivent se déformer à travers des espaces interstitiels étroites ainsi que des vaisseaux sinueux et des réseaux lymphatiques pour ensemencer à ^deux sites secondaires. Pour sonder le comportement physique des cellules individuelles, des dispositifs microfluidiques présentent une plate-forme idéale qui peut être personnalisé pour étudier une gamme de comportements cellulaires, y compris leur capacité à migrer à travers espaces étroits ³ et à déformer passivement à travers les constrictions micrométriques ^{3- 9.} Polydiméthylsiloxane (PDMS) des dispositifs microfluidiques sont optiquement transparent, ce qui permet les déformations de la cellule pour être visualisées par microscopie à la lumière et analysées à l'aide des outils de base de traitement d'image. En outre, les tableaux de rétrécissements peuvent être définis avec précision, permettant l'analyse de plusieurs cellules simultanément avec unedébit qui dépasse de nombreuses techniques existantes ^10,11.

Nous présentons ici un protocole expérimental détaillé pour sonder la déformabilité de la cellule en utilisant un dispositif microfluidique la «cellule de Deformer 'PDMS. Le dispositif est conçu de telle sorte que le passage à travers les cellules successives des étranglements; cette géométrie est commun dans les contextes physiologiques, tels que le lit capillaire pulmonaire ^12. Pour mesurer la déformabilité de la cellule, le temps de transit fournit une mesure commode qui peut être facilement mesurée par le temps nécessaire à une cellule individuelle de transit à travers une seule de ^4,6 constriction. Afin de maintenir une chute de pression constante à travers les canaux rétrécis pendant le transport de cellules, on utilise le débit commandé par la pression. Notre protocole comprend des instructions détaillées sur la conception de l'appareil et la fabrication, le fonctionnement du dispositif de flux, la préparation axée sur la pression et l'imagerie des cellules, ainsi que le traitement d'image pour mesurer le temps pour que les cellules se déforment à travers une série d'étranglements. Nous incluonsdeux modèles d'appareil et le code de traitement des données de vision en tant que fichiers supplémentaires. Comme un échantillon représentatif de données, nous montrons cellule de temps de transit à travers une série d'étranglements en fonction du nombre de constrictions à des passages. Analyse de l'échelle de temps de transit à travers les cellules à des constrictions étroites d'un dispositif microfluidique peut révéler des différences dans la capacité de déformation d'une variété de types de cellules ^4,5,13. Le dispositif montré ici recense unique cellule de transit à travers une série de rétrécissements l'échelle du micron; cette conception émule le chemin tortueux que les cellules subissent en circulation et permet également sonder les caractéristiques physiques supplémentaires des cellules telles que les temps de relaxation.

Protocole

1. microfluidique périphérique Conception

REMARQUE: La conception de l'appareil dispose de quatre zones fonctionnelles de base: port d'entrée, filtre cellulaire, matrice de constriction, et les ports de sortie (Figure 1). La conception générale peut être appliquée à un large éventail de types de cellules, avec des modifications mineures aux dimensions. Pourvu voici quelques recommandations de conception de base ainsi que les paramètres de l'appareil qui sont efficaces pour une sélection de deux cellules primaires et immortalisés.

1. Sélectionner la largeur de la matrice de canaux d'étranglement (figure 1B) à environ 30 à 50% du diamètre moyen des cellules; cette taille résultats constriction rapport à cellule à cellule de déformation importante mais encrassement minimal. Compte tenu d'un type de cellule qui n'a pas encore été testé, il est prudent de concevoir une gamme de largeurs de constriction de ~ 30-50% du diamètre de la cellule pour trouver la largeur optimale. Comme pour de nombreux types de dispositifs microfluidiques, plus de 120 moules maîtres de l'appareil peuvent être modelés sur un péchégle tranche de silicium de 4 pouces, ce qui permet une gamme de différents modèles d'appareil devant être fabriqué dans un processus de fabrication unique.
2. Sélectionner la hauteur du canal à au moins 50% du diamètre de la cellule; ce qui garantit la cellule est limitée en 2 dimensions. Pour empêcher l'effondrement de canal pendant la liaison, à ce que le rapport d'aspect du canal n'est pas inférieure à 01 heures 10 (hauteur: largeur) à travers le dispositif. Pour les canaux qui doivent dépasser ce ratio d'aspect, ajouter les messages de soutien pour éviter l'effondrement. soutien de l'espace postes à une distance qui est au moins deux fois le diamètre de la cellule pour ne pas empêcher l'écoulement de cellules.
3. Inclure un filtre dans les ports d'entrée pour éliminer les débris et ventiler les amas de cellules (figure 1B). Ajuster la taille et l'espacement des postes de filtre de sorte que la distance séparant les postes est sensiblement égale à un diamètre de la cellule.
   REMARQUE: La limite inférieure de la taille de l'élément est définie par la résolution à laquelle le masque de lithographie est imprimée. Veiller à ce que toutes les fonctions sont dans les reslimite de olution spécifiée par le fournisseur de masque.

2. fournitures et préparation

REMARQUE: Avant de commencer toute expérience, les éléments suivants doivent être préparés. Un schéma de l'ensemble de l'installation est donné dans la figure 1.

1. Fabriquer le maître de l'appareil en utilisant des techniques standard de micro-usinage lithographique ^14,15. Vérifiez la hauteur des fonctions répétées à l'aide d'un profilomètre.
   NOTE: Bien que les maîtres peuvent être facilement fabriqués dans une salle blanche, certains laboratoires ont développé des méthodes de lithographie peu coûteux pour une utilisation dans un environnement semi-propre ^16,17.
2. Préparez la source d'air pour un débit commandé par la pression, en utilisant un réservoir d'air et la séquence des régulateurs d'air et les raccords (figure 1A) comprimé.
   1. Mettre en place un réservoir d'alimentation en air et le régulateur manuel.
      Remarque: Une composition de 5% de CO ₂ dans l'air maintient un environnement similaire à un incubato typique de culture de cellulesr, mais d'autres mélanges de gaz peuvent également être utilisés.
   2. Mettre en place un régulateur de pression à commande électronique en ligne avec le régulateur manuel. Utilisation d'un convertisseur électro-pneumatique pour réguler et maintenir une chute de pression à travers les canaux stable, avec une fluctuation de moins de 2 kPa de pression. Utilisez le code simple écrit en LabVIEW (Renseignements supplémentaires) à l'entrée de la pression désirée.
      NOTE: Le convertisseur électro-pneumatique utilise une boucle de réaction interne pour régler la pression de sortie de la vanne en fonction de la pression déterminée dans le dispositif microfluidique.
   3. Mettre en place une chambre sous pression pour entraîner l'écoulement de la suspension de cellules. Assembler une chambre de suspension cellulaire sur un cytomètre de flux type tube et un bouchon usiné qui crée un joint étanche à la pression sur le tube.
      Remarque: le couvercle de la chambre de pression contient deux orifices: un orifice d'entrée qui relie le réservoir d'air comprimé, et une sortie par laquelle les cellules s'écouler de la chambre sous pression dans le dispositif (Figure 2).
3. Mise en place d'un microscope inversé équipé d'une caméra qui a un taux d'acquisition d'au moins 100 images par seconde pour capturer des images de cellules s'écoulant à travers la matrice d'étranglement. Interface de l'appareil photo avec une carte de capture vidéo et un ordinateur.
4. Préparer une solution mère de l'agent tensio-actif de 10% en poids / poids de Pluronic F-127 dans du tampon phosphate salin (PBS), que l'ajout d'une petite quantité de F127 à la solution de milieu cellulaire permettra de réduire au minimum l'adhésion des cellules aux parois PDMS. Pour préparer la solution de F127, vortex et chauffer doucement à 37 ° C pour dissoudre le F127. Avant l'utilisation, passer la solution à travers un filtre seringue de 0,2 um et stocker à température ambiante. Préparer la solution de tensioactif à l'avance que vortex et le filtrage va générer des bulles qui persisteront pendant plus de 24 heures.

3. microfluidique fabrication de périphériques

1. Fabriquer bloc PDMS avec des canaux microfluidiques.
   1. Mix PDMS bien unta rapport de 1:10 (p / p) d'agent de durcissement à base.
   2. Verser le mélange sur la base de l'appareil (étape 2.1). Degas dans une cloche sous vide appliquée jusqu'à ce que les bulles piégées disparaissent, ou pour environ 10-20 min.
      REMARQUE: Passé ce délai, il peut encore être bulles à l'interface air-PDMS, ce qui est normal; ceux-ci seront généralement dissiper pendant la cuisson. Il est plus important de s'assurer qu'il n'y ait pas de bulles adjacentes pour les canaux restants.
   3. Cuire le dispositif dégazé à 65 ° C pendant 4 heures. Pour empêcher l'effondrement de canaux, le dispositif de cuisson pendant une nuit pour réticuler davantage les PDMS pour un dispositif ayant un module élastique plus élevé qui est plus résistant à l'effondrement canal. Toutefois, notez que la cuisson prolongée fragilise également les PDMS et peut conduire à la fissuration lors de la perforation des trous (étape 3.3).
2. Retirer des dispositifs microfluidiques du moule maître. Couper dispositifs microfluidiques individuels sur le bloc de PDMS avec une lame de rasoir et retirez l'appareil du mâter. Commencez par soulever délicatement un coin du dispositif; pelage doux et lent, par opposition à la levée du bloc de PDMS vers le haut, réduit le stress sur les deux PDMS et le maître.
3. Percez des trous dans le dispositif PDMS afin de créer des ports de connexion pour l'accès des tubes et des microcanaux. Créer trous à l'aide d'un poinçon de biopsie, et le punch d'un côté de la voie par le biais de la face extérieure de l'appareil.
   REMARQUE: Un poinçon de biopsie avec un diamètre d'alésage de 0,75 mm crée des trous que l'interface parfaitement avec la polyétheréthercétone (PEEK), un tube (diamètre extérieur = 1/32 "ou 0,79 mm) ou un tube de polyethylene (PE-20, diamètre extérieur = 0,043" ou 1,09 mm ). Utilisez un anneau de lumière pour aider à visualiser des trous dans les dispositifs de canaux peu profonds ^18. Assurez-vous que le poinçon de biopsie est forte; après usage répété la fine pointe s'émousse et le poinçon de biopsie doit être jeté et remplacé.
4. Rincer le dispositif PDMS avec de l'isopropanol (qualité HPLC) pour enlever la poussière et déposées morceaux de PDMS. Assurez-vous que laperforations sont libres de débris en dirigeant un flux régulier de l'isopropanol pur à partir d'un flacon souple à travers les trous. Sécher avec de l'air filtré. Après le nettoyage, placer des cales PDMS avec chaînes face vers le haut dans un plat propre Petri pour maintenir la propreté de l'appareil. Si nécessaire, des dispositifs de stockage sous cette forme jusqu'à liaison.
5. Nettoyer le substrat de verre par un rinçage avec du méthanol (qualité HPLC), sécher avec de l'air filtré, et le placer sur une plaque de cuisson à 200 ° C pendant 5-10 min à assurer la vitre est bien propre et sec avant traitement par plasma.
   NOTE: Le substrat de verre formant le fond de chaque canal. Typiquement, une lame de verre suffit, car un objectif 10X ou 20X est idéal pour l'imagerie de plusieurs canaux en parallèle. Aux images à haute résolution, lier l'appareil à une lamelle (# 1.5 épaisseur).
6. Coller le dispositif PDMS sur le substrat de verre.
   1. traiter le plasma d'oxygène du côté de canal du bloc PDMS et d'une face d'une lame de verre.
      REMARQUE: Wvec un dispositif de décharge à main, en utilisant un temps de 1 min de traitement, mais optimiser le temps de traitement pour chaque appareil de plasma d'oxygène.
   2. Placer le côté du canal de PDMS sur le dessus de la face traitée du verre immédiatement après le traitement.
   3. Maintenez avec une légère pression pour ~ 10 sec pour favoriser la liaison. Cuire l'ensemble du dispositif à une température élevée (60-80 ° C) pendant au moins 15 min pour améliorer la force de liaison.

4 Déformation cellules par des canaux rétrécie

1. Inspectez le dispositif microfluidique sous un microscope. Veiller à ce que les canaux ne sont pas effondrés ou cassées et que les deux trous d'entrée et de sortie se connectent directement dans les canaux de l'appareil en utilisant un objectif de faible puissance (10X). Désigner les appareils défectueux en marquant la surface du PDMS avec une lame de rasoir et ne pas les utiliser pour des expériences.
2. Préparation des échantillons de culture cellulaire à doser. des cellules de culture en utilisant des conditions standard.
   1. Faou par exemple, la culture des cellules HL-60 dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec une solution de pénicilline-streptomycine à 1% et du sérum de veau fœtal à 10% dans 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C.
   2. Pour les cellules adhérentes, les récolter par traitement à la trypsine et remettre en suspension dans un milieu de croissance frais. Utilisez un protocole de traitement à la trypsine norme; par exemple, ajouter environ 0,5 ml de trypsine dans un ballon de 25 cm ² de la culture, et remettre en suspension dans ~ 30 ml de milieu frais. Différencier les cellules HL-60 en cellules de type neutrophile par tout-trans rétinoïque (ATRA) à une concentration finale de 5 uM à 1 x 10 ⁵ cellules / ml comme décrit précédemment ^19,20.
   3. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min, soigneusement aspirer les cellules du surnageant et remettre en suspension à la densité finale appropriée dans un milieu de culture frais, avec 0,1% v / v F-127.
3. Compter les cellules en utilisant un compteur Coulter, hématimètre, ou cytomètre de flux. Ajuster la suspension de cellules à une densité de 1 x 10 ⁶ à 5 x 10 ^{6 cellules / ml. Une fois que la densité de la suspension est réglée, supplément à environ 0,1% v / v F-127.
   REMARQUE: La densité cellulaire et la concentration en agent tensio-actif peut être nécessaire de modifier en fonction des systèmes de cellules particulières, le tableau 1 fournit un enregistrement des concentrations de cellules utilisés précédemment et F-127 pour les différents types de cellules.}
4. Placez suspension cellulaire dans un cytomètre de flux tube et se connecter au bouchon de pression. Avant de raccorder le tuyau au dispositif microfluidique, ajuster la pression à environ 14 à 21 kPa et de rinçage jusqu'à ce que la suspension cellulaire se dégage de l'extrémité du tube. Cela aidera à réduire les bulles d'air dans le tube et le dispositif.
5. Insérer l'extrémité du tube contenant la suspension cellulaire dans l'entrée du dispositif. Si le dispositif est collé sur une lamelle, de placer le dispositif sur une surface plane, solide, tel que la platine du microscope avant de raccorder la tubulure; la lamelle est fragile et peut casser contraire.
6. Insérez un morceau de tuyau into l'orifice de sortie et l'acheminer dans un tube vide pour la collecte des déchets, tel qu'un tube Falcon vide collé sur le côté de la platine du microscope. Pour assurer la cohérence de la résistance fluidique totale du dispositif entre les expériences, en sorte que les tubes d'entrée et de sortie sont de même diamètre et approximativement de la même longueur pour chaque expérience.
7. Rampe doucement la pression à environ 28 kPa ou jusqu'à ce que les cellules passent par les canaux. Positionner le dispositif de sorte que plusieurs canaux sont dans le champ de vision et sont perpendiculaires à la partie inférieure de l'écran. Si l'appareil est limitée par la taille des données, d'acquérir plusieurs vidéos afin de générer un nombre suffisant de points de données indépendants. Régler la vitesse nécessaire à la production de données d'image souhaitée. Pour tenir compte des changements dans la forme des cellules, utiliser l'imagerie à haute vitesse à 300 images par seconde (fps); pour mesurer le temps de transit des cellules, utiliser des taux de trame d'environ 100 fps.

Analyse 5. données

1. Ouvrez le fichier de mâter_script.m (téléchargeable de fichier supplémentaire) et exécuter le programme.
2. Sélectionnez la première vidéo à analyser à partir de la fenêtre de l'Explorateur Windows qui s'affiche. Spécifiez le taux de trame pour la vidéo sélectionnée et appuyez sur Entrée.
   REMARQUE: Un chiffre apparaît pour demander à l'utilisateur de sélectionner une fenêtre rectangulaire de culture pour la première vidéo.
3. Sélectionner une fenêtre qui englobe tous les canaux de gauche à droite et de coupe juste au-dessus des canaux de la première ampoule de la matrice de canaux à partir du haut et du bas (figure 3).
4. Sélectionnez les régions de constriction de l'image recadrée. Portez une attention particulière à maintenir une distance de pixels fixe entre la fenêtre limite supérieure et inférieure pour chaque vidéo sélectionnée.
   REMARQUE: La fenêtre bord supérieur définit la fenêtre supérieure et la constriction bord inférieur indique la constriction la plus inférieure (figure 4); constrictions intermédiaires sont estimés à partir de cette entrée de l'utilisateur. Ensuite, l'algorithme affiche les segmentation de cellules pour les 50 premières images de chaque vidéo (Figure 5).
5. Surveillez l'image en haut à gauche (figure 5A) en étroite collaboration afin de déterminer si l'algorithme est de localiser avec précision les cellules; une image binarisée est superposée à la source vidéo à montrer l'emplacement des cellules identifiées.
   REMARQUE: Les différentes fenêtres, (figures 5B-5D) sont pour le diagnostic de code et montrent les images de la vidéo après les opérations spécifiques de traitement d'image.
6. Sélectionnez la vidéo suivante à traiter de la fenêtre de l'Explorateur Windows.
   NOTE: L'algorithme va répéter les étapes 5.2 à 5.5 pour chaque vidéo sélectionnée.
7. Sélectionnez annuler une fois toutes les vidéos désirées ont été ajoutés par la fenêtre de l'Explorateur Windows pour charger la fonction que la liste des vidéos est terminée.
   NOTE: L'algorithme effectue les opérations restantes sans intervention de l'utilisateur. Cela prendra environ 1-2 heures selon le nombre de vidéos transformés et pe informatiquesrfo rm a n. À la fin, l'algorithme va produire un histogramme des données de temps de transit et de sauvegarder les données dans le répertoire comme un fichier .mat MATLAB et un fichier xls Microsoft Excel.

Résultats

Pour étudier la capacité de déformation de différents types de cellules, des cellules de leucémie myéloïde humaine (HL-60), les cellules neutrophiles différenciées, des cellules de lymphocytes de souris et des lignées de cellules de cancer ovarien humain (OVCAR8, HEYA8) sont évalués en utilisant la technique microfluidique la 'cellule Deformer. Les résultats représentatifs pour le temps de transit des cellules HL-60 et de type neutrophile HL-60 montrent le délai pour une seule cellule de transit à tr...

Discussion

Ici nous fournissons une procédure expérimentale complet d'analyse de la déformation des cellules qui transitent par des canaux microfluidiques constriction en utilisant un écoulement commandé par la pression. Un script MATLAB permet le traitement automatique des données (matériel supplémentaire); une version mise à jour du code est maintenue ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). De façon plus générale, les techniques présentées ici peuvent ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Pressure regulator	Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittings	McMaster Carr	5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView System Design Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable	National Instruments	SHC68-68