定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

要約

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

要約

これは、重症感染症を開発するための彼らの大きなリスクを考えると、胃腸（GI）免疫抑制患者の管内でのサイトメガロウイルス（CMV）感染を識別することが重要です。 CMV感染の検出のための多くの実験室方法は、血清学、ウイルス培養、および分子の方法を含む、開発されている。多くの場合、これらの方法は、CMVによる全身の関与を反映し、特に局所的な組織の関与を特定していない。したがって、GI管におけるCMV感染の検出は、しばしば、生検組織の伝統的な組織学によって行われる。免疫組織化学（IHC）に連動して、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色は、これらの生検を調べた柱が残っている。 H＆EおよびIHCは時々の解釈を困難にし、非定型（あいまい）染色パターンになる。これは、CMVの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）が正常に非常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織生検を行うことができることが示された高い感度および特異性。このプロトコルの目的は、臨床検査の設定でのFFPE生検組織におけるCMVの検出のための定量PCRテストを実行する方法を示すことです。この方法は、GI生検におけるCMVのための曖昧な染色例の患者のために非常に有益である可能性が高い。

概要

臨床検体中のサイトメガロウイルス（CMV）感染の解釈は非常に重要である。 CMVはヘルペスウイルスのbetaherpesvirinaeサブファミリーのメンバーである。他のヘルペスウイルスと同様に、CMVはアクティブなウイルス複製¹の欠如を特徴と持続性または潜伏感染を確立する能力を持っています。ウイルスの再活性化は、疾患の症状^2-4を伴うことがあるビリオン放出を特徴と活発なウイルス複製につながる、ストレスや他の免疫抑制の時間帯に発生する可能性があります。胃腸（GI）のCMV疾患の症状が頻繁に腹痛および/ ​​または血便^1が含まれ^ています。

組織学によるCMV胃腸炎の診断は、CMVウイルスの介在物を同定するためにヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）を利用する。臨床的疑いが高く、まだ明らかな介在物が観察されない場合において、免疫組織化学（IHC）は、しばしば補助試験法として使用される。しかし、IHCまた、解釈が難しい（ 図^2）5作る珍しい非古典登場する携帯染色パターン（あいまい）によって妨げられることができる。なお、GI生検においてCMVを検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）GI生検組織および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）から抽出したDNAを使用することが求​​められていた。この技術は、GI生検においてCMVの検出に貴重であることが示されており、曖昧なIHC染色ケース^5,6において特に有用であるれている。また、定量PCRはまた^、6利用可能になった追加のCMV臨床試験データとよく相関することが示されている。 CMVの検出に定量PCRの使用は、CMVのための臨床的疑いが高い場合での早期診断と治療につながる可能性がありますが、H＆EおよびCMV IHCは陰性である。

プロトコル

治験審査委員会の承認を得て、電子実験室のデータベースの検索は、胃腸内のサイトメガロウイルス（CMV）感染例組織病理によって診断（GI）生検（ヘマトキシリン​​を表す（FFPE）ブロックと組み込みホルマリン固定、パラフィンを特定するために実施されたエオシン（H＆E）および/または免疫組織化学（IHC））。

FFPE GI生検組織からの1。組織処理

1. サイトメガロウイルス（CMV）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）のためにFFPE GI生検組織ブロックを集める。これらのブロックは、室温で保存されている。
2. ブロックの固有の識別番号を事前にラベル1.7ミリリットルのマイクロチューブ。
3. ミクロトームのハンドホイールをロックします。
4. カセットクランプに組織ブロックを装着します。
5. 新しい未使用のブレードを使用して、ミクロトームナイフ角度にブロックの位置を合わせます。
6. 厚さ10μmの部分をカットするミクロトームを調整します。
7. 目のロックを解除Eのハンドルとブレードに向かってブロックを進める。
8. 各カットは、組織のスクロールにロールバックできるように、厚さ10μmの間隔でブロックの5つのセクションをカット。各スクロールが必要な生検組織の適切な表現が含まれていることを確認してください。
9. ミクロトームのハンドホイールをロックします。
10. ピンセットで、組織のすべての5巻物は、交差汚染の可能性を減少させるためにパラフィンでスクロールを操作するように注意しながら、予め標識遠心管に入れます。チューブのキャップをスナップし、ラックの上に戻って配置します。
11. ミクロトームから組織ブロックを削除します。
12. ブレードを取り外し、廃棄します。
13. 以前の組織と接触した可能性のある表面や楽器を除染。
14. ナイフホルダーに新しい未使用のブレードを配置します。
15. 繰り返しは、処理対象の各追加ブロックごとに1.4から1.14を繰り返します。組織スクロールを含有するマイクロフュージチューブはティムまで室温で保存することができるDNA抽出の電子。

FFPE GI生検組織のスクロールから2。のDNA抽出

注：このプロトコルはFFPE組織DNA抽出キット（：製品安全データシート（MSDS）を参照してください。注意）の添付文書から採用されている。

1. 各サンプル微量遠心管に：1ミリリットルのキシレン（MSDSを参照してください。注意）を追加します。 10秒間激しく蓋と渦を閉じます。
2. 、具体的に以下のように変更して、メーカーの製品添付文書で概説DNA抽出を続行します。
3. 最初に各微量遠心管に内部統制（IC）の6を添加する。
   1. Cは1時間°1時間56℃でATL /プロテイナーゼK溶解インキュベートした後、30分間99℃でインキュベートするのではなく、90。
   2. 最終的なDNA溶出工程の間に、慎重にDNA精製カラムの蓋を開けて、むしろbuffeなく、膜の中心に50μlの蒸留DNアーゼ/​​ RNaseフリー水を適用rは食べました。
      注：適切なストレージおよび試薬の製造のための添付文書を参照してください。 DNAはすべて5のFFPE巻物から抽出する必要があります。室温（15〜25℃）ですべての遠心操作を実行します。

CMVのため3。定量PCR

1. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手順
   1. CMVアッセイの実行のために、ExcelのPCRワークシートを生成します。このExcelのワークシートには、Mgをマスターミックスを構成するために必要な各試薬の総量を計算します。これは、サンプルごとに必要な各試薬の量（下記参照）倍のサンプルおよびコントロールの数プラス1を（ピペッティングによる損失を補償するために）掛ける。
      1. 量の各PCR反応において、以下の試薬が示さ含む。
         試薬0;サンプルあたりの量
         CMVの液晶マスターミックスバイアル12.5μL
         mgのソリューション黄色バイアル2.5μL
         総量15.0μL
   2. すべてのアッセイで例えば、水又は無標的対照（NTC）、陰性コントロール、低ポジティブコントロール、高い正の制御、およびQS3またはQS4いずれか、およびすべての患者サンプルを実行します。毛細血管の順に設定する必要があります。
   3. 4℃で保存されているリアルタイムPCR機器のための冷却ブロックの特定を得る冷却ブロックに適切な毛細管を配置します。毛細管の表面に触れないでください。毛細血管を取り扱う際は、必ず手袋を使用しています。
   4. 増幅生産で汚染されていないクリーンフード内のすべてのポリメラーゼ連鎖反応を設定TS。
      1. すべての患者試料に加え、5コントロールをテストするためにPCRキットからマスターバイアルの正しい数を削除します。マスターバイアル、Mgの溶液、および冷却ブロック内のPCRグレードの水を解凍しましょう​​。各マスターバイアルは12のテストのための十分な試薬が含まれています。
      2. 優しくマスターバイアルをボルテックスし、迅速な最大速度で遠心分離器で、そ​​れらをスピン。
      3. 1バイアルに各マスターバイアルの内容を組み合​​わせて、ゆっくり再びボルテックスする。
      4. マスターミックスとMgソリューションは、単一の滅菌マイクロチューブをPCRワークシートに表示されている量で結合します。
      5. 定量標準（QS）のためである5位の毛細血管を除いて、各キャピラリーチューブにやさしく、アリコートMgをマスターミックス15μLを混合します。
   5. クリーンフードから加工フードにMgを毛細管とマスターミックスを含む冷却ブロックを移動します。
   6. マスターの残り30μlに内部統制の2μL（IC）を追加Mgを混ぜる。 5位のキャピラリー（QS用位置）にやさしく、アリコート15μlを混ぜる。
   7. ピペット適切なキャピラリーチューブ内への水、コントロールDNA、またはサンプルDNAを10μl。キャッピングツールを使用して、キャピラリーチューブにキャップ。
   8. リアルタイムPCR機器にブロック/サンプルを冷却取る。
2. 番組のリアルタイムPCR計測器（ 表1を参照のこと）
3. 増幅および検出はリアルタイムPCR装置で行っ
   1. コンピュータにログオン
   2. ダブル器具のアイコンをクリックして、ソフトウェアにログイン。
   3. リアルタイムPCR測定器の電源をオン
   4. フロントスクリーンから「CMV / EBV」をクリックします。
   5. マクロウィザードの指示に従います。
   6. ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、セルフテストを実行するためにボックスをオンにします。セルフテストは、測定器が使用されている1日に1回実行する必要があります。
   7. 実行に名前を付けます。
   8. 上側のLEFにあるサンプル数を調整コントロールと患者の合計にページのTコーナーが実行に含まれ、各患者サンプルの識別番号を入力してください。
   9. 「ABSクワント」タブをクリックします。
   10. 「サンプルの種類」の下で、標準のための適切なサンプルタイプを割り当てる。
   11. 定量標準（QS）が予想される濃度を入力します。
   12. クーラーブロックから毛細管を削除し、（ブロックサンプル＃1を冷却するなど 、カルーセル上の位置＃1に配置する必要があります）カ ​​ルーセルの対応する位置にそれらを配置します。
   13. 測定器の遠心分離器を押し、スタートにカルーセルを配置します。
   14. 遠心分離機を開き、カルーセルを取り外します。
   15. リアルタイムPCR機器にカルーセルを配置します。ふたを閉めます。
   16. を押して「スタートファイル名を指定して実行」。
   17. のリアルタイムPCR装置は、サンプルのために、それぞれの位置をチェックします。このチェックが完了するまで、機器からESPEを離れて歩いたりしてはならない毛細血管の一つがカルーセルにない場合cially。測定器は、この点に注意して、実行を継続するかどうか尋ねるでしょう。離れる前にyesと答える。
   18. 実行が完了すると、生成されたレポートを閉じます。
   19. 「絶対定量」をクリックします。
   20. 色補正の横にある矢印をクリックしてください。
   21. ドロップダウンボックスから「色の選択報酬」をクリックしてください。
   22. 実行するために適用するために、最新のカラー補正ファイルを選択してください。
   23. ボックスがポップアップ表示されたら[OK]をクリックします。
   24. 標準曲線の矢印をクリックします。
   25. ドロップダウンメニューから「外部利用」を選択します。
   26. 最新の外部標準曲線ファイルを選択し、[OK]をクリックします。
   27. 濃度が割り当てられている場合の曲線は、存在していない平坦な線であることを確認するために絶対定量メニューの各曲線を見てください。 705/Back 530のための絶対定量が自動的に分析されている。
4. QUalityコントロール
   1. より頻繁な方、試薬の新しいロット番号が受信されるたびに、新しい標準曲線、または半年ごとに生成します。
   2. Mgをマスターミックスに各標準液10μlを加える。以前に抽出されたDNAのようなキットに含まれている基準を検討してください。
   3. Mgは正確な定量性を確保するために、標準曲線を生成する際に使用したマスターミックスに各標準のための内部統制の1を添加する。テンプレートなしのコントロール（NTC）のためにMgをマスターミックスにICを追加しないでください。
   4. 16のデータポイントで、合計NTCおよび定量標準QS 4、3、2、1、標準曲線を作成し、実行のためのQS4の1:10希釈の3回の反復を用意します。
   5. 繰り返さ標準のためのドロップダウンメニュー内の "の複製」を選択します。
   6. チャンネル530/backのnoneを選択し、実行を分析する際、色補正をオンにし、
   7. 「（ファイル名を指定して実行で）標準曲線」に、EX名前を付けて保存」を選択ternal「曲線に名前を付けます。保存時に「標準曲線として適用 "コメントを入力します。
   8. 結果をグラフ化する。その結果、直線性係数は0.81を≥しなければなりません。
   9. 毎日実行するために、走行中のコントロールとしてQS3またはQS4のコピーが含まれています。現在の外部標準曲線は、分析フェーズ中に実行にインポートすることができる。
   10. 実行されるコントロール：いいえDNAコントロール、陰性コントロール、低、高陽性対照。予想されるウイルス量を測定し、各ベンダーとロット番号のために調整される。
   11. 各サンプルにICを追加し、DNA抽出の際に制御します。
   12. コントロールのいずれかが範囲外に落ちた場合、容認できない結果を記録し、トラブルシューティングのためのアッセイを参照してください。
5. コントロールの周波数
   1. すべての実行中に、次のとおり、NTC、負、正の低、高い正、そして標準コントロール。

注：コントロールの許容限度。ピークが観察されるべきではないテンプレートなし（NTC）および陰性対照のためのD。ピークは530チャンネルで存在すべきであると予想されるウイルス量は決定され、低域と高陽性対照のため、各ベンダやロット番号のために調整されている。

結果

228組織ブロックの合計91サイトメガロウイルス（CMV）陽性組織学および陽性免疫組織化学（IHC）に基づいてケース、あいまいCMV IHC 18、および79ネガティブコントロールで構成された定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により試験した。 図2に示すように、CMV陽性症例は、典型的なCMVウイルス封入体（A）および/ ​​または陽性IHC染色（B）を実証している...

ディスカッション

多くの実験室的方法は、最近実証されたように、血清学、ウイルス培養、分子ウイルス血アッセイ、生検材料の組織学、および、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検の分子アッセイを含む、サイトメガロウイルスの診断（CMV）感染にご利用いただけます組織^5,6。血清学的検査は、診断の主力一度のみ確実に露出を識別し、急性CMV感染⁷とよく相関しない。ウイルス培養?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microfuge tubes	Costar	3620
serrated forceps	Electron Microscopy Services	62086-1S	Micro Forceps MF-1
Tabletop centrifuges (microfuge)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1 gallon
Ethanol	Fisher	Fisher Scientific: ET108	96-100%
microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR Supplement Kit	Qiagen	1031873
LightCycler centrifuge	Roche	75005087
LightCycler Cooling Block	Roche	10800058001
LightCycler Capping Tool	Roche	3357317
Color Compensation Kit	Roche	2158850
LightCycler 20 μL Capillaries	Roche	1 909 339
blades	Sakura	Fisher Scientific: 4689	Accu-Edge low profile