qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

Zusammenfassung

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Zusammenfassung

Es ist entscheidend, Cytomegalovirus (CMV)-Infektion im Magen-Darm-Trakt (GI) bei immunsupprimierten Patienten zu identifizieren, aufgrund ihrer höheren Risiko für schwere Infektionen. Viele Laborverfahren zum Nachweis von CMV Infektion entwickelt worden, einschließlich der Serologie, Viruskultur und molekularbiologischer Methoden. Oft sind diese Methoden reflektieren systemische Beteiligung mit CMV und nicht spezifisch lokale Gewebe Beteiligung zu identifizieren. Daher wird der Nachweis von CMV Infektion in den GI-Trakt häufig durch herkömmliche Histologie der Biopsiegewebe gemacht. Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung in Verbindung mit der Immunhistochemie (IHC) haben die Hauptstützen der Untersuchung dieser Biopsien geblieben. H & E und IHC manchmal in atypischen (zweideutig) Färbungsmuster führen, was die Interpretation erschweren. Es wurde gezeigt, dass quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zur CMV erfolgreich auf Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebebiopsie durchgeführt werden, für sehrhohe Sensitivität und Spezifität. Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie qPCR Tests für den Nachweis von CMV in FFPE Biopsiegewebe in einer klinischen Laborumgebung durchzuführen. Diese Methode ist wahrscheinlich von großem Nutzen für die Patienten in Fällen von zweideutigen Färbung für CMV in GI Biopsien sein.

Einleitung

Interpretation von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion in klinischen Proben ist von entscheidender Bedeutung. CMV ist ein Mitglied der Unterfamilie Betaherpesvirinae von Herpesviren. Ähnlich wie bei anderen Herpesviren, hat die Fähigkeit, CMV dauerhafte oder latente Infektion zu etablieren, gekennzeichnet durch einen Mangel der aktiven Virusreplikation ^1. Reaktivierung des Virus kann in Zeiten von Stress oder andere Immunsuppression auftreten, was zu aktiver Virusreplikation, gekennzeichnet durch Virion Mitteilung, die von Krankheitsmanifestationen ^2-4 begleitet sein kann. Gastrointestinale (GI) CMV-Erkrankung Symptome sind häufig Bauchschmerzen und / oder Blut im Stuhl ^ein.

Die Diagnose der CMV Gastroenteritis durch Histologie nutzt Hämatoxylin und Eosin (H & E), um virale CMV Einschlüsse identifizieren. In Fällen, in denen der klinische Verdacht hoch noch keine offensichtlichen Einschlüsse beobachtet werden, ist der Immunhistochemie (IHC) häufig als Ergänzung Testverfahren verwendet. Jedoch IHCkann auch durch nicht-klassische selten auftretenden Zellfärbungsmuster (zweideutig) behindert werden, so dass die Interpretation erschweren (Abbildung 2) ^5. Es wurde versucht, aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) GI Biopsiegewebe und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) auf CMV in GI Biopsien erkennen extrahierten DNA zu verwenden. Diese Technik hat sich gezeigt, wertvoll bei der Detektion von CMV in GI Biopsien werden und ist besonders nützlich in zweideutigen IHC Färbung Fällen ^5,6. Auch hat qPCR auch gezeigt, dass auch mit zusätzlichen klinischen CMV Testdaten zu korrelieren, wenn es ⁶ ist verfügbar. Verwendung von qPCR bei der Aufdeckung von CMV kann auf frühere Diagnose und Behandlung in Fällen, in denen der klinische Verdacht auf CMV ist hoch führen, aber H & E-und CMV-IHC negativ sind.

Protokoll

Mit der Zustimmung des Institutional Review Board wurde eine Suche des elektronischen Labor-Datenbank durchgeführt, um in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Blöcken, die Fälle von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion bei gastrointestinalen (GI) Biopsien durch Histopathologie diagnostiziert (Hämatoxylin und identifizieren Eosin (H & E) und / oder Immunhistochemie (IHC)).

1. Gewebeverarbeitung aus FFPE GI Biopsie Gewebe

1. FFPE GI Biopsie Gewebeblöcke Sammeln für Cytomegalovirus (CMV) quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Diese Blöcke werden bei Raumtemperatur gelagert.
2. Pre-Etikett 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit der Block eindeutige Identifikationsnummer.
3. Sperren Sie die Mikrotom Handrad.
4. Setzen Sie die Gewebeblock in die Kassette Klemme.
5. Mit einem frischen, unbenutzte Klinge, richten Sie den Block an den Messerwinkel am Mikrotom.
6. Stellen Sie die Mikrotom bis 10 um dicke Schnitte geschnitten.
7. Entsperren thE Handrad und vorab der Block in Richtung der Klinge.
8. Cut 5 Sektionen des Blocks bei 10 um dicke Abständen, so dass jeder Schnitt in einer Schriftrolle von Gewebe zu rollen. Stellen Sie sicher, dass jede Rolle enthält eine angemessene Vertretung der gewünschten Biopsie Gewebe.
9. Sperren Sie die Mikrotom Handrad.
10. Mit Pinzette, legen alle fünf Schriftrollen von Gewebe in der Pre-markierten Zentrifugenröhrchen, wobei darauf geachtet, das Buch nur durch die Manipulation Paraffin, um Potenzial für eine Kreuzkontamination zu verringern. Lassen Sie die Kappe auf dem Rohr und setzen Sie ihn wieder auf den Rost.
11. Entfernen Sie die Gewebeblock aus dem Mikrotom.
12. Entfernen und Entsorgen der Klinge.
13. Dekontaminieren keine Flächen oder Geräte, die in Kontakt mit dem früheren Gewebe kommen kann.
14. Legen Sie eine frische, unbenutzte Klinge in den Messerhalter.
15. Wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,14 für jeden zusätzlichen Block zu verarbeiten. Die Mikrozentrifugenröhrchen von Geweberollen enthalten, können bei Raumtemperatur bis zur tim gespeichert werdene der DNA-Extraktion.

2. DNA-Extraktion aus FFPE Scrolls of GI Biopsie Gewebe

HINWEIS: Dieses Protokoll wird von der Packungsbeilage des FFPE Gewebe DNA-Extraktions-Kits (: siehe Material Safety Data Sheet (MSDS) VORSICHT) angepasst.

1. 1 ml Xylol (ACHTUNG: siehe Sicherheitsdatenblatt) zu jeder Probe Mikrozentrifugenröhrchen. Den Deckel schließen und kräftig vortexen für 10 Sekunden.
2. Fahren Sie mit der DNA-Extraktion, wie insbesondere in Produktbeilage des Herstellers mit den folgenden Modifikationen beschrieben.
3. Fügen Sie zuerst 6 ul der internen Kontrolle (IC) zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen.
   1. Nach dem ATL / Proteinase K-Lyse-Inkubation bei 56 ° C für 1 h, Inkubation bei 99 ° C für 30 Minuten, anstatt 90 ° C für 1 Stunde.
   2. Während der abschließenden DNA-Elution Schritt, vorsichtig zu öffnen, den Deckel des DNA-Reinigungskolonne und gelten 50 ul destilliertem DNAse / RNAse-freies Wasser in der Mitte der Membran, anstatt buffer ATE.
      HINWEIS: In der Packungsbeilage für die geeignete Lagerung und Vorbereitung der Reagenzien. DNA sollte von allen 5 FFPE Rollen extrahiert werden. Führen alle Zentrifugationsschritte bei Raumtemperatur (15-25 ° C).

3. QPCR für CMV

1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verfahren
   1. Generieren Sie ein Excel-Arbeitsblatt für die PCR-CMV-Testlauf. Diese Excel-Tabelle berechnet die Gesamtmenge jedes Reagenz notwendig sind, um den Master-Mix mit Mg. Er multipliziert die Menge von jedem Reagenz, die pro Probe (siehe unten) mal der Anzahl der Proben und Kontrollen plus eins (um den Verlust durch Pipettieren zu kompensieren).
      1. Gehören die folgenden Reagenzien in jeder PCR-Reaktion in der Höhe angegeben:
         Reagens0; Menge pro Probe
         CMV-LC-Master-Mix Fläschchen 12,5 ul
         Mg-Lösung gelben Phiole 2,5 ul
         Gesamtvolumen 15,0 ul
   2. Fügen Sie bei jedem Test, führen Sie ein Wasser oder keine Zielkontrolle (NTC), Negativkontrolle, einen niedrigen positiven Kontrolle, eine hohe positive Kontrolle und entweder QS3 oder QS4 und alle Patientenproben. Die Kapillaren sollte in dieser Reihenfolge gesetzt werden.
   3. Der Kühlblock erhalten, die spezifisch für die Echtzeit-PCR-Instrument, das bei 4 ° C gelagert wird Legen Sie die entsprechenden Kapillaren in den Kühlblock. Die Oberfläche der Kapillaren nicht berühren. Verwenden Sie immer Handschuhe bei der Handhabung der Kapillaren.
   4. Richten Sie alle Polymerase-Kettenreaktionen in einer sauberen Haube nicht mit der Verstärkung der Produktion verunreinigtts.
      1. Entfernen Sie die richtige Anzahl von Master-Ampullen aus dem PCR-Kit, um alle Patientenproben, plus 5 Kontrollen zu testen. Lassen Sie die Master-Fläschchen, Mg-Lösung und PCR-Wasser Tauwetter in den Kühlblock. Jeder Master-Fläschchen enthält genügend Reagenzien für 12 Tests.
      2. Vorsichtig vortexen die Stamm Fläschchen und schnell drehen sie in der Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit.
      3. Die Inhalte der einzelnen Master-Fläschchen in einem Fläschchen, und sanft wieder Wirbel.
      4. Kombinieren Sie den Master-Mix-und Mg-Lösung in den auf dem PCR-Arbeitsblatt angegeben in einem einzigen sterilen Mikrozentrifugenröhrchen beträgt.
      5. Vorsichtig mischen und 15 ul Aliquot Master-Mix mit Mg in jede Kapillare, mit Ausnahme der Kapillare in Position 5, die für die Quantifizierung Standard (QS) ist.
   5. Bewegen Sie den Kühlblock die Kapillaren und Master-Mix enthalten, mit Mg von der sauberen Haube zu einer Verarbeitungs Kapuze.
   6. In 2 ul der internen Kontrolle (IC) auf die verbleibenden 30 ul Mastermischen mit Mg. Vorsichtig mischen und 15 ul Aliquot in die Kapillare in Position 5 (Position für die QS).
   7. Pipette 10 ul Wasser, Kontroll-DNA oder Proben-DNA in den geeigneten Kapillarrohr. Verschließen Sie die Kapillaren mit dem Capping-Tool.
   8. Nehmen Kühlblock / Proben auf der Echtzeit-PCR-Instrument.
2. Programmieren Sie die Echtzeit-PCR-Instrument (siehe Tabelle 1)
3. Amplifikation und Detektion auf der Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt
   1. Melden Sie sich auf dem Computer
   2. Klicken Sie doppelt auf das Gerätesymbol und melden Sie sich in der Software.
   3. Schalten Sie den Echtzeit-PCR-Instrument
   4. Klicken Sie auf "CMV / EBV" aus der Frontscheibe.
   5. Folgen Sie den Anweisungen des Assistenten, Makro.
   6. Wählen Sie die Box, um einen Selbsttest durch, wenn sie von der Software dazu aufgefordert werden. Ein Selbsttest muss einmal pro Tag das Gerät im Einsatz durchgeführt werden.
   7. Nennen Sie den Lauf.
   8. Stellen Sie die Probenzahl in der oberen befindet left Ecke der Seite auf die Summe der Kontrollen und Patienten im Vorfeld enthalten und die Identifizierungsnummer jeder Patientenprobe.
   9. Klicken Sie auf der Registerkarte "Abs Quant".
   10. Unter "Sample-Typ", weisen Sie den entsprechenden Probentyp für den Standard.
   11. Geben Sie die zu erwartenden Konzentrationen für die Quantifizierung Standard (QS).
   12. Entfernen der Kapillarröhrchen an dem Kühlerblock und sie in der entsprechenden Position in dem Karussell (Kühlblock Probe Nr. 1 ist in Position 1 auf dem Karussell angebracht werden, etc.).
   13. Legen Sie das Karussell in die Zentrifuge und Start drücken des Instruments.
   14. Öffnen und entfernen Sie die Zentrifuge Karussell.
   15. Legen Sie das Karussell in die Echtzeit-PCR-Instrument. Schließen Sie den Deckel.
   16. Drücken Sie "Start Ausführen".
   17. Die Echtzeit-PCR-Instrument wird jede Position für eine Probe zu prüfen. Sie vom Instrument weg gehen nicht bis diese Prüfung abgeschlossen ist, vorallem wenn eine der Kapillaren nicht in dem Karussell. Das Instrument wird dies beachten und fragen, ob der Lauf fortgesetzt werden. Antwort ja vor der Abreise.
   18. Nachdem der Lauf beendet ist, schließen Sie den Bericht, der generiert wurde.
   19. Klicken Sie auf "Absolute Quantifizierung".
   20. Klicken Sie auf den Pfeil neben Farbe Compensation.
   21. Klicken Sie auf "Wählen Sie die Farbkorrektur" aus der Drop-Down-Feld.
   22. Wählen Sie das aktuelle Farbkompensationsdatei auf der Flucht an.
   23. Klicken Sie auf OK, wenn die Box erscheint.
   24. Klicken Sie auf den Pfeil von Standard-Kurve.
   25. Wählen Sie "extern" aus der Drop-Down-Menü.
   26. Wählen Sie den aktuellen externen Standardkurve Datei, klicken Sie dann auf OK.
   27. Schauen Sie sich jede Kurve unter der Absolute Quantifizierung Menü, um sicherzustellen, dass Kurven vorhanden und nicht flache Linie sind, wenn eine Konzentration zugeordnet ist. Die absolute Quantifizierung für die 705/Back 530 wird automatisch analysiert.
4. Qunalität Steuer
   1. Erzeugen Sie eine neue Standardkurve, wenn eine neue Charge von Reagenzien empfangen wird, oder alle sechs Monate, je nachdem, was häufiger ist.
   2. In 10 ul jeder Standard-zum Master-Mix mit Mg. Betrachten Sie die mit dem Kit wie zuvor extrahierten DNA enthalten Standards.
   3. 1 ul der internen Kontrolle für jeden Standard an den Master-Mix mit Mg bei der Erzeugung der Standardkurve verwendet, um genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Sie IC an den Master-Mix mit Mg für den Leerwert-Kontrolle (NTC) nicht hinzu.
   4. Bereiten Sie ein NTC und drei Wiederholungen von Quantifizierung Standards QS 4, 3, 2, 1, und einer 1:10-Verdünnung von QS4 für den Lauf um die Standardkurve zu erzeugen, insgesamt in 16 Datenpunkten.
   5. Wählen Sie "Replikat" in der Drop-Down-Menü für die wiederholte Standards
   6. Wählen Sie Kanal 530/back keine, und schalten Sie die Farbkompensation bei der Analyse der Sicht,
   7. Unter "Standard Curve (In Run)" wählen Sie "Speichern unter Exinternen "und benennen Sie die Kurve. Geben Sie den Kommentar "als Standardkurve aufgetragen" beim Speichern.
   8. Grafik die Ergebnisse. Die daraus resultierende Linearitätskoeffizient muss ≥ 0,81 werden.
   9. Für die tägliche Abfahrten, sind eine Kopie des QS3 oder QS4 als Kontrolle in der Flucht. Die aktuelle externe Standardkurve kann während der Analysephase in den Lauf eingeführt werden.
   10. Führen Kontrollen: keine DNA Kontrolle, Negativkontrolle, niedrige und hohe positive Kontrollen. Erwartete Viruslast bestimmt und für jeden Lieferanten und Chargennummer angepasst.
   11. In einer IC zu jeder Probe und während der DNA-Extraktion zu kontrollieren.
   12. Wenn eine der Kontrollen fallen außerhalb des Bereichs, notieren Sie die Ergebnisse inakzeptabel und verweisen den Test für die Fehlersuche.
5. Die Häufigkeit der Kontrollen
   1. Fügen Sie in jedem Lauf: ein NTC, negativ, schwach positiv, hohe positive und Standardsteuerung.

Hinweis: Der zulässige Grenzwerte für Kontrollen. Keine Spitzen sollten beobachtend für die ohne Vorlage (NTC) und Negativkontrollen. Peaks sollte in der 530-Kanal vorhanden sein und die erwarteten Viruslast bestimmt und für jeden Lieferanten und Chargennummer für den niedrigen und hohen positiven Kontrollen angepasst.

Ergebnisse

Ein insgesamt 228 Gewebeblöcke wurden durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), die von 91 Cytomegalovirus (CMV)-positiven Fällen mit zweideutigen CMV IHC bestand, wurde basierend auf positive Histologie und Immunhistochemie (IHC), 18, und 79 negative Kontrollen getestet. Wie in Abbildung 2 dargestellt, würde CMV-positiven Fällen typische CMV Viruseinschlüsse (A) und / oder positive IHC-Färbung (B) gezeigt haben. Nicht eindeutige Fälle würden seltenen...

Diskussion

Viele Labormethoden sind für die Diagnose des Cytomegalovirus (CMV)-Infektion, darunter Serologie, Viruskultur, Molekularbiologie Virämie Assays, Histologie von Biopsiematerial und, wie kürzlich gezeigt, molekulare Tests von Formalin-fixierte, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsie verfügbar Gewebe ^5,6. Serologie, einst eine tragende Säule der Diagnose, nur zuverlässig identifiziert Belichtung und nicht gut mit akuten CMV-Infektion ⁷ korrelieren. Viruskultur, sowohl konventionelle als früh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microfuge tubes	Costar	3620
serrated forceps	Electron Microscopy Services	62086-1S	Micro Forceps MF-1
Tabletop centrifuges (microfuge)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1 gallon
Ethanol	Fisher	Fisher Scientific: ET108	96-100%
microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR Supplement Kit	Qiagen	1031873
LightCycler centrifuge	Roche	75005087
LightCycler Cooling Block	Roche	10800058001
LightCycler Capping Tool	Roche	3357317
Color Compensation Kit	Roche	2158850
LightCycler 20 μL Capillaries	Roche	1 909 339
blades	Sakura	Fisher Scientific: 4689	Accu-Edge low profile