qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

Resumo

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Resumo

É crucial para identificar a infecção por citomegalovírus (CMV) no trato gastrointestinal (TGI) de pacientes imunossuprimidos, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Muitos métodos laboratoriais para a detecção de infecção por CMV têm sido desenvolvidos, incluindo sorologia, a cultura viral, e métodos moleculares. Muitas vezes, esses métodos refletem o acometimento sistêmico com CMV e não identificam especificamente o envolvimento do tecido local. Portanto, a detecção de infecção por CMV no tracto GI é frequentemente feito por histologia tradicional de tecidos de biopsia. Hematoxilina e eosina (H & E) em conjunto com a coloração imuno-histoquímica (IHQ) mantiveram-se os principais pilares de examinar essas biópsias. H & E e IHC, por vezes, resultar em atípicos (ambíguos) padrões de coloração, tornando difícil interpretação. Foi mostrado que a polimerase de reacção em cadeia quantitativa (qPCR) por CMV pode ser realizada com sucesso em, tecidos de biopsia (FFPE) em parafina e fixado em formalina para muitoalta sensibilidade e especificidade. O objetivo deste protocolo é para demonstrar como realizar testes de qPCR para a detecção de CMV no tecido biópsia FFPE em um ambiente de laboratório clínico. Este método é susceptível de ser de grande benefício para o paciente, em caso de coloração equívoca para CMV em biópsias GI.

Introdução

Interpretação da infecção por citomegalovírus (CMV) em amostras clínicas é criticamente importante. O CMV é um membro da subfamília Betaherpesvirinae de herpesvírus. Semelhante a outros vírus de herpes, CMV tem a capacidade de estabelecer infecção persistente ou latente caracterizada por uma falta de replicação viral activa ^1. A reativação do vírus pode ocorrer durante momentos de estresse ou outra imunossupressão, levando a replicação viral activa caracterizada pela liberação virion, que pode ser acompanhada de manifestações da doença ^2-4. Gastrointestinal (GI) os sintomas da doença CMV freqüentemente incluem dor abdominal e / ou fezes com sangue ^um.

O diagnóstico de CMV gastroenterite por histologia utiliza hematoxilina e eosina (H & E) para identificar CMV inclusões virais. Nos casos em que a suspeita clínica é alta ainda são observados sem inclusões óbvias, imuno-histoquímica (IHQ) é freqüentemente usado como um método de ensaio adjunto. No entanto, IHCtambém pode ser prejudicada pela não-clássicas surgem padrões raros de coloração celular (duvidosos), tornando difícil interpretação (Figura 2) ^5. Buscou-se utilizar DNA extraído de fixados em formalina e incluído em parafina (FFPE) tecidos de biópsia GI e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para detectar CMV em biópsias IG. Esta técnica tem mostrado ser útil na detecção de CMV em biópsias GI, e é particularmente útil em casos duvidosos IHC coloração ^5,6. Além disso, qPCR também tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os dados de teste de CMV clínica adicional, quando ele está disponível ^6. Uso de qPCR na detecção de CMV pode levar a um diagnóstico precoce e tratamento nos casos em que a suspeita clínica para CMV é alta, mas H & E e CMV IHC são negativos.

Protocolo

Com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional, foi realizada uma pesquisa no banco de dados do laboratório de eletrônica para identificar fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) blocos que representam casos de infecção pelo citomegalovírus (CMV) em gastrintestinal (GI) biópsias diagnosticados por histopatologia (hematoxilina e eosina (H & E) e / ou imuno-histoquímica (IHQ)).

1. Processamento de tecidos de biopsia de tecido FFPE GI

1. Colete FFPE GI blocos de tecido para biópsia citomegalovírus (CMV) polimerase quantitativa reação em cadeia (qPCR). Estes blocos são armazenados à temperatura ambiente.
2. Tubos pré-label 1,7 ml de microcentrífuga com número de identificação único do bloco.
3. Trave o volante micrótomo.
4. Assente o bloco de tecido para o prendedor de cassete.
5. Usando uma lâmina utilizada fresca, alinhar o bloco para o ângulo de faca no micrótomo.
6. Ajuste o micrótomo para cortar 10 mm de espessura.
7. Desbloquear ªe volante e avanço do bloco na direção da lâmina.
8. Corte 5 seções do bloco em 10 mM intervalos de espessura, permitindo que cada corte para rolar em um rolo de tecido. Certifique-se de que cada um pergaminho contém uma representação adequada dos tecidos de biópsia desejados.
9. Trave o volante micrótomo.
10. Com uma pinça, coloque todos os 5 pergaminhos de tecido para dentro do tubo de centrífuga de pré-rotulados, tendo o cuidado de apenas manipular a rolagem pela parafina, a fim de reduzir o potencial de contaminação cruzada. Encaixe a tampa no tubo e colocá-lo de volta na prateleira.
11. Retire o bloco de tecido a partir do micrótomo.
12. Retire e deite fora a lâmina.
13. Descontaminar todas as superfícies ou instrumentos que possam ter entrado em contato com o tecido anterior.
14. Coloque uma lâmina não utilizado fresco no suporte da faca.
15. Repita os passos 1,4-1,14 para cada bloco adicional para ser processado. Os tubos de microcentrífuga contendo os rolos de tecido podem ser armazenadas à temperatura ambiente até que o time da extração de DNA.

2. Extração de DNA a partir de Scrolls de FFPE GI biópsia de tecido

NOTA: Este protocolo é uma adaptação da bula do tecido kit FFPE DNA extração (ATENÇÃO: consulte a Ficha de Segurança (MSDS)).

1. Adicione 1 ml de xileno (ATENÇÃO: Consulte o MSDS) para cada tubo de microcentrífuga amostra. Fechar a tampa e vortex vigorosamente durante 10 sec.
2. Prossiga com a extração de DNA como descrito especificamente na inserção do produto do fabricante com as seguintes modificações.
3. Primeiro adicione 6 mL do controle interno (CI) para cada tubo de microcentrífuga.
   1. Seguindo o ATL / proteinase K incubação de lise a 56 ° C durante 1 hora, incubar a 99 ° C durante 30 minutos, em vez de 90 ° C durante 1 hora.
   2. Durante o passo final de eluição de ADN, aberto com cuidado a tampa da coluna de purificação de ADN e aplicar 50 ul de ADNase / água livre de ARNase destilada no centro da membrana, em vez de da-manhãr ATE.
      NOTA: Consulte a bula para o armazenamento e preparação de reagentes adequados. ADN deve ser extraído a partir de todos os cinco rolos de FFPE. Executar todos os passos de centrifugação à temperatura ambiente (15-25 ° C).

3. QPCR para CMV

1. Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedimento
   1. Gerar uma planilha do Excel PCR para o CMV ensaio prazo. Esta planilha Excel calcula a quantidade total de cada reagente necessário para tornar-se o mix principal com Mg. Multiplica-se a quantidade de cada reagente necessária por amostra (listados abaixo) vezes o número de amostras e controlos mais um (para compensar as perdas devido a pipetagem).
      1. Incluir os seguintes reagentes em cada reação de PCR, no montante indicado:
         Reagente0; Quantidade por Amostra
         Master mix CMV LC frasco de 12,5 mL
         Mg solução amarelo frasco de 2,5 mL
         O volume total de 15,0 uL
   2. Incluir em cada ensaio, execute uma água ou nenhum controle de destino (NTC), controle negativo, controle positivo baixo, um controle positivo alto, e quer QS3 ou QS4, e todas as amostras dos pacientes. Os capilares devem ser criados por esta ordem.
   3. Obter o bloco específico de arrefecimento para o equipamento de PCR em tempo real que está guardado a 4 ° C. Colocar os tubos capilares apropriadas do bloco de arrefecimento. Não toque na superfície dos tubos capilares. Sempre use luvas ao manusear os capilares.
   4. Configure todas as reações em cadeia da polimerase em uma capa limpa não contaminada com amplificação produçãots.
      1. Remover o número correto de frascos mestre do kit de PCR para testar todas as amostras dos pacientes, mais 5 controles. Deixe os frascos mestre, solução Mg e PCR degelo água grau no bloco de resfriamento. Cada frasco mestre contém reagentes suficientes para 12 ensaios.
      2. Suavemente vortex os frascos de mestrado e rápida spin-los na centrífuga à velocidade máxima.
      3. Combinar o conteúdo de cada recipiente principal para um frasco, e suavemente vortex novamente.
      4. Combine a mistura principal e solução de Mg nas quantidades indicadas na planilha de PCR em um único tubo de microcentrífuga estéril.
      5. Misturar suavemente e alíquota de 15 ul de mistura principal com Mg em cada tubo capilar, com excepção do capilar na posição 5, que é o padrão para a quantificação (QS).
   5. Mova o bloco de arrefecimento, contendo os tubos capilares e master mix com Mg da capa limpa para um capuz processamento.
   6. Adicione 2 mL de controlo interno (CI) para os restantes 30 mL de mestremisturar com Mg. Misture delicadamente e alíquota de 15 mL para o capilar na posição 5 (posição para o QS).
   7. Pipetar 10 ml de água, controle de ADN, ou o ADN da amostra no tubo capilar apropriado. Tapar os tubos capilares usando a ferramenta de nivelamento.
   8. Tome arrefecimento do bloco / amostras para o tempo real instrumento de PCR.
2. Programar o tempo real do instrumento de PCR (ver Tabela 1)
3. Amplificação e Detecção executada em tempo real o instrumento de PCR
   1. Efetue logon no computador
   2. Dê um duplo clique sobre o ícone do instrumento e fazer login no software.
   3. Ligue o tempo real instrumento de PCR
   4. Clique em "CMV / EBV" a partir da tela da frente.
   5. Siga as instruções do assistente de macro.
   6. Marque a caixa para executar um auto-teste, quando solicitado pelo software. Um auto-teste deve ser realizado uma vez a cada dia o instrumento estiver em uso.
   7. Nomeie o prazo.
   8. Ajuste a contagem de amostra localizada na ABL superiort canto da página para a soma de controles e pacientes incluídos no Executar e digite o número de cada amostra de identificação.
   9. Clique na aba "Abs Quant".
   10. Em "Tipo de amostra", atribuir o tipo de amostra adequado para o padrão.
   11. Digite as concentrações esperadas para o padrão de quantificação (QS).
   12. Retire os tubos capilares a partir do bloco de arrefecimento e colocá-los na posição correspondente no carrossel (arrefecimento do bloco de amostra # 1 deve ser colocado na posição # 1 no carrossel, etc.)
   13. Coloque o carrossel em centrífuga e começar a pressionar o instrumento.
   14. Abra centrífuga e remover o carrossel.
   15. Coloque o carrossel para o instrumento em tempo real, PCR. Feche a tampa.
   16. Pressione o botão "Start Run".
   17. A real-time PCR instrumento irá verificar cada posição para uma amostra. Não se afaste do instrumento até que essa verificação tenha sido concluída, especialmente se um dos capilares não é no carrossel. O instrumento vai notar isso e perguntar se a corrida é para ser continuada. Responda sim antes de sair.
   18. Uma vez que a corrida é completa, feche o relatório que foi gerado.
   19. Clique em "Absolute quantificação".
   20. Clique na seta ao lado de Cor de Compensação.
   21. Clique em "Selecionar cor de Compensação" a partir da caixa drop-down.
   22. Escolha o arquivo de compensação de cor mais atual para aplicar a fuga.
   23. Clique em OK quando a caixa aparece.
   24. Clique na seta por curva padrão.
   25. Selecione "uso externo" a partir do menu drop-down.
   26. Selecione o arquivo de curva padrão externo mais atual e clique em OK.
   27. Olhe para cada curva no menu Absolute Quantificação para garantir que as curvas estão presentes e não linha reta, se uma concentração é atribuída. A quantificação absoluta para o 705/Back 530 é analisado automaticamente.
4. Qucontrole ality
   1. Gerar uma nova curva padrão sempre que um número novo lote de reagentes é recebido, ou a cada seis meses, o que é mais freqüente.
   2. Adicionar 10 ml de cada uma das normas para a mistura principal com Mg. Considere as normas incluídas no kit de DNA previamente extraído.
   3. Adicionar 1 ml de controlo interno para cada padrão para a mistura principal com Mg utilizados em gerar a curva padrão, a fim de assegurar uma quantificação precisa. Não adicione IC para a mistura principal com Mg para o modelo de controle n º (NTC).
   4. Prepare um NTC e três repetições de quantificação Normas QS 4, 3, 2, 1, e uma diluição de 1:10 de QS4 para a corrida para gerar a curva padrão, totalizando em 16 pontos de dados.
   5. Selecione "idêntico" no menu drop-down para os padrões repetidos
   6. Escolha canal 530/back nenhum e ligar compensação de cor quando se analisa o prazo,
   7. Em "Curva padrão (In Run)", selecione "salvar como exexterno "eo nome da curva. Digite o comentário "aplicado como curva padrão" ao salvar.
   8. Gráfico dos resultados. O coeficiente de linearidade resultante deve ser ≥ 0,81.
   9. Para corridas diárias, incluir uma cópia do QS3 ou QS4 como um controle na corrida. A curva padrão externa atual podem ser importados para a corrida durante a fase de análise.
   10. Executar controles: sem controle de DNA, controle negativo, os baixos e os controles positivos altos. Carga viral esperada é determinada e ajustada para cada fornecedor e número de lote.
   11. Adicionar um IC para cada amostra e controle durante a extração de DNA.
   12. Se qualquer um dos controles cair fora da faixa, registrar os resultados inaceitáveis ​​e remeter o ensaio para a solução de problemas.
5. Frequência dos controlos
   1. Inclua em cada corrida: a NTC, baixo, alto positivo e padrão de controle positivo negativo.

Nota: os limites aceitáveis ​​para controles. Sem picos deve ser observard para a nenhum modelo (NTC) e controles negativos. Picos deve estar presente no canal 530 e cargas virais esperados são determinadas e ajustadas para cada vendedor e número de lote para os controlos positivos de baixa e alta.

Resultados

Um total de 228 blocos de tecido foram testadas por reação de polimerase em cadeia quantitativa (qPCR), que foi composta por 91 citomegalovírus (CMV) casos positivos com base na histologia e imuno-histoquímica positiva (IHC), 18 com equívoco CMV IHC, e 79 controles negativos. Tal como ilustrado na Figura 2, os casos positivos que demonstraram CMV CMV inclusões típicas virais (A) e / ou coloração IHC positivo (B). Casos duvidosos teria demonstrado, não-clássic...

Discussão

Muitos métodos laboratoriais estão disponíveis para o diagnóstico da infecção pelo citomegalovírus (CMV), incluindo sorologia, cultura viral, ensaios moleculares de viremia, histologia do material da biópsia e, como demonstrado recentemente, ensaios moleculares de, a biópsia fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE) ^5,6 tecido. Sorologia, uma vez que um dos pilares do diagnóstico, identifica apenas confiável exposição e não se correlaciona bem com a infecção por CMV aguda ^7. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microfuge tubes	Costar	3620
serrated forceps	Electron Microscopy Services	62086-1S	Micro Forceps MF-1
Tabletop centrifuges (microfuge)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1 gallon
Ethanol	Fisher	Fisher Scientific: ET108	96-100%
microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR Supplement Kit	Qiagen	1031873
LightCycler centrifuge	Roche	75005087
LightCycler Cooling Block	Roche	10800058001
LightCycler Capping Tool	Roche	3357317
Color Compensation Kit	Roche	2158850
LightCycler 20 μL Capillaries	Roche	1 909 339
blades	Sakura	Fisher Scientific: 4689	Accu-Edge low profile