qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

요약

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

초록

그것은 심각한 감염을 개발하기 위해 자신의 더 큰 위험 관련, 위장 (GI) 면역 억제 환자의 기관에 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염을 식별하는 데 매우 중요합니다. CMV 감염의 검출을위한 다수의 실험 방법 혈청학, 바이러스 배양, 분자 및 방법을 포함하여 개발되었다. 종종, 이러한 방법은 CMV와 조직의 참여를 반영하고 특히 지역 조직의 참여를 식별하지 않습니다. 따라서 위장관에서 CMV 감염의 검출은 자주 생검 조직의 조직 학적 전통에 의해 이루어집니다. 면역 조직 화학 (IHC)과 함께 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 염색이 생검 검사의 대들보가 남아있다. H & E와 IHC 때로는 해석이 어려워, 비정형 (모호한) 염색 패턴을 초래한다. 그것은 CMV 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)이 성공적으로 매우 포르말린 - 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 조직에서 수행 될 수 있다는 것을 나타내었다민감도와 특이도가 높은. 이 프로토콜의 목적은 임상 실험실 설정에 FFPE 생검 조직에서 CMV의 검출을위한 qPCR에 테스트를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 GI 조직 검사에서 CMV에 대한 모호한 염색의 경우 환자에 대한 큰 도움이 될 전망이다.

서문

임상 검체에서 거대 세포 바이러스 (CMV) 감염의 해석은 매우 중요하다. CMV는 헤르페스 바이러스의 betaherpesvirinae 아과의 구성원입니다. 다른 헤르페스 바이러스와 유사하게, CMV 활성 바이러스 복제 ^하나의 부족에 의해 특징 영구 또는 잠복 감염을 확립하는 기능을 갖는다. 바이러스의 재 활성화는 질병의 증상 ^2-4을 동반 할 수 비리 릴리스 특징 활성 바이러스 복제, 선도, 스트레스 또는 다른 면역 억제의 시간 동안 발생할 수 있습니다. 위장 (GI) CMV 질환의 증상은 자주 복통 및 / 또는 혈변 ^1이 (가) ^{있습니다.}

조직 학적으로 거대 세포 바이러스 위장염의 진단은 헤 마톡 실린 및 CMV 바이러스 흠을 식별 할 수 에오신 (H & E)를 사용합니다. 임상 혐의가 높은 아직 명백한 흠이 발생하지 않습니다되는 경우, 면역 조직 화학 (IHC)는 자주 외래 시험 방법으로 사용됩니다. 그러나, IHC또한 해석이 어려운 (그림 2) ⁵ 만들고, 드문 비 고전 나타나는 세포의 염색 패턴 (모호한)에 의해 방해 할 수 있습니다. 이는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) GI 생검 조직과 GI 생검에서 CMV를 검출하는 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)로부터 추출 된 DNA를 사용하고자 하였다. 이 기술은 GI 생검에서 거대 세포 바이러스의 검출에 유용한 것으로 표시하고, 모호한 IHC 염색의 경우 ^5,6에 특히 도움이되었습니다. 또한, qPCR에 또한 ⁶ 사용할 수있는 경우 추가 임상 CMV 테스트 데이터와 상관 관계가 표시되었습니다. CMV를 감지하는 qPCR에의 사용은 CMV에 대한 임상 혐의가 높은 경우 초기 진단과 치료로 이어질 수 있지만, H & E 및 CMV IHC는 부정적이다.

프로토콜

임상 시험 심사위원회의 승인을 받아, 전자 실험실 데이터베이스의 검색은 위장에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염 사례 조직 병리학 진단 (GI) 생검 (헤 마톡 실린을 나타내는 (FFPE) 블록 및 임베디드 포르말린 고정, 파라핀을 확인하기 위해 수행되었다 에오신 (H & E) 및 / 또는 면역 조직 화학 (IHC)).

FFPE GI 생검 조직에서 1. 조직 처리

1. 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)에 대한 FFPE GI 생검 조직 블록을 상환 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에). 이러한 블록을 실온에서 저장된다.
2. 블록의 고유 한 식별 번호와 함께 사전 라벨 1.7 밀리리터의 microfuge 튜브.
3. 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다.
4. 카세트 클램프로 조직 블록 좌석.
5. 신선하지 않는 블레이드를 사용하여 마이크로톰에 칼 각도로 블록을 맞 춥니 다.
6. 10 μm의 두께 부분을 잘라 마이크로톰을 조정합니다.
7. 일의 잠금을 해제전자 핸드 휠 미리 블레이드를 향해 블록.
8. 각각의 컷이 조직의 스크롤에 출시 할 수 있도록, 10 μm의 두께 간격으로 블록의 5 부분을 잘라냅니다. 각 스크롤 원하는 생검 조직의 적절한 표현이 포함되어 있는지 확인합니다.
9. 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다.
10. 포셉으로 만 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 파라핀으로 스크롤을 조작주의하면서, 미리 라벨링 원심 분리기 튜브에 조직의 모든 5 스크롤을 배치합니다. 튜브에 뚜껑을 스냅 랙에 다시 배치합니다.
11. 마이크로톰에서 조직 블록을 제거합니다.
12. 제거하고 잎을 버린다.
13. 이전의 조직과 접촉 할 수있는 어떤 표면 또는 장비의 오염을 제거.
14. 칼 홀더에 신선한, 사용하지 않는 날을 놓습니다.
15. 반복 처리 할 각 추가 블록 1.4-1.14 단계를 반복합니다. 티슈 두루마리 함유의 microfuge 튜브 포까지 실온에서 저장 될 수있다DNA 추출의 전자.

FFPE GI 생검 조직의 스크롤 2. DNA 추출

참고 :이 프로토콜이 FFPE 조직의 DNA 추출 키트 (: 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조주의)의 패키지 삽입에서 적응됩니다.

1. 각 샘플의 미세 튜브에 1 ㎖의 크실렌 (MSDS를 참조하십시오주의)를 추가합니다. 적극적으로 10 초 동안 뚜껑과 소용돌이를 닫습니다.
2. 구체적으로 다음과 같은 수정과 제조업체의 제품 삽입에 설명 된 DNA 추출을 진행합니다.
3. 먼저 각각의 미세 튜브 내부 통제 (IC)의 6 μl를 추가합니다.
   1. 1 시간 동안 56 ° C에서 ATL / 단백질 분해 효소 K 용해 배양 한 다음, 1 시간 30 분 동안 99 ° C에서보다는 90 ° C를 품어.
   2. 최종 DNA 용출 단계 동안, 정중 DNA 정화 컬럼의 뚜껑을 열고 오히려 buffe보다 막의 중앙에 50 μL DNase의 증류 / RNase가없는 물을 적용R은 ATE.
      주 : 해당 스토리지 및 시약의 준비를위한 패키지 안내서를 참조하십시오. DNA는 5 FFPE 스크롤에서 추출해야합니다. 실내 온도 (15-25 ℃)에서 모든 원심 분리 단계를 수행합니다.

CMV 3. qPCR에

1. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 프로 시저
   1. CMV 분석 실행을위한 엑셀 PCR 워크 시트를 생성합니다. 이 Excel 워크 시트는 마그네슘과 마스터 믹스를 만들기 위해 필요한 각 시약의 총 금액을 계산합니다. 이 샘플 당 필요한 각 시약의 양을 아래 나열된 배 샘플 및 컨트롤의 수와 곱 하나 (때문에 피펫으로 손실을 보상하기 위해).
      1. 양의 각 PCR 반응에 다음과 같은 시약은 표시 다음을 포함한다 :
         시약0; 샘플 당 금액
         CMV의 LC 마스터 믹스 유리 병 12.5 μL
         MG 솔루션 노란색 유리 병 2.5 μL
         총 양 15.0 μL
   2. 물이나없는 대상 컨트롤 (NTC), 음성 대조군, 낮은 양성 대조군, 높은 긍정적 인 제어, QS3 또는 QS4 하나, 모든 환자의 샘플을, 모든 분석에 포함 실행합니다. 모세 혈관의 순서로 설정해야합니다.
   3. 4 ℃에서 저장되는 실시간 PCR 기기의 냉각 블록 별을 얻 냉각 블록에 적합한 모세관 튜브를 놓습니다. 모세관 튜브의 표면을 만지지 마십시오. 모세 혈관을 취급 할 때는 항상 장갑을 사용합니다.
   4. 증폭 생산에 오염되지 않은 깨끗한 후드의 모든 중합 효소 연쇄 반응을 설정TS.
      1. 모든 환자 샘플, 플러스 5 컨트롤을 테스트하기 위해 PCR 키트에서 마스터 튜브의 정확한 수를 제거합니다. 하자 마스터 유리 병, 마그네슘 용액 냉각 블록 PCR 등급 물 해동. 각 마스터 유리 병 (12) 시험에 대한 충분한 시약이 포함되어 있습니다.
      2. 조심스럽게 마스터 유리 병 와동 빠른 최대 속도로 원심 분리기를 회전.
      3. 하나의 유리 병에 각 마스터 유리 병의 내용을 결합하고 다시 부드럽게 소용돌이.
      4. 하나의 멸균의 microfuge 튜브에 PCR 워크 시트에 표시된 금액의 마스터 믹스와 마그네슘의 솔루션을 결합합니다.
      5. 정량 표준 (QS)입니다 위치 5 모세관을 제외하고, 각 모세관 튜브에 부드럽게 나누어지는 마그네슘과 마스터 믹스 15 μl를 섞는다.
   5. 깨끗한 후드에서 처리 후드 Mg를 모세관 및 마스터 믹스를 함유하는 냉각 블록을 이동.
   6. 마스터의 나머지 30 μL에 내부 통제의 2 μL (IC)를 추가Mg를 섞는다. 위치 5 모세관 (QS에 대한 위치)에 부드럽게 나누어지는 15 μl를 섞는다.
   7. 물 피펫 10 μL은 해당 모세관 튜브에 DNA, 또는 샘플의 DNA를 제어 할 수 있습니다. 캐핑 도구를 사용하여 모세관 튜브를 모자.
   8. 실시간 PCR 기기에 블록 / 샘플을 냉각 가라.
2. 실시간 PCR 장비를 프로그램 (표 1 참조)
3. 증폭과 검출은 실시간 PCR 기기에서 수행
   1. 컴퓨터에 로그온
   2. 두 악기 아이콘을 클릭하고 소프트웨어에 로그인합니다.
   3. 실시간 PCR 기기를 켭니다
   4. 전면 화면에서 "CMV / EBV"를 클릭하십시오.
   5. 매크로 마법사의 지시를 따릅니다.
   6. 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 자체 테스트를 실행하는 상자를 선택합니다. 자체 테스트 기기를 사용하고있는 각각 하루에 한 번 수행해야합니다.
   7. 실행의 이름을 지정합니다.
   8. LEF 상부에 위치한 샘플 개수를 조정컨트롤과 환자의 합계 페이지 t 코너는 실행에 포함 된 각각의 환자 샘플의 식별 번호를 입력합니다.
   9. "애비 양의"탭을 클릭합니다.
   10. "샘플 유형"에서 표준에 해당하는 샘플의 유형을 지정합니다.
   11. 정량 표준 (QS)의 예상 농도를 입력합니다.
   12. 쿨러 블록에서 모세관 튜브를 제거하고 (블록 샘플 중 1 냉각 등, 회전 목마에 위치 # 1에 배치해야합니다) 회전 목마의 해당 위치에 배치합니다.
   13. 악기의 원심 분리기를 눌러 시작으로 회전 목마를 놓습니다.
   14. 원심 분리기를 열고 회전 목마를 제거합니다.
   15. 실시간 PCR 기기에 회전 목마를 놓습니다. 뚜껑을 닫습니다.
   16. 을 눌러 "시작 실행".
   17. 실시간 PCR 악기 샘플은 각각의 위치를​​ 확인합니다. 이 검사가 완료 될 때까지 악기에서 멀리 떨어진 곳에서 걷지 않는다 ESPE모세관의 하나가 컨베이어에없는 경우 cially. 악기는이를 기록하고 실행이 계속 될 경우 요청합니다. 떠나기 전에 예라고 응답.
   18. 실행이 완료되면, 생성 된 보고서를 닫습니다.
   19. "절대 정량"을 클릭합니다.
   20. 다음 색상 보정에있는 화살표를 클릭합니다.
   21. 드롭 다운 상자에서 "색상 선택 보상"을 클릭합니다.
   22. 실행에 적용 할 최신 색 보정 파일을 선택합니다.
   23. 상자가 뜨면 확인을 클릭합니다.
   24. 표준 곡선의 화살표를 클릭합니다.
   25. 드롭 다운 메뉴에서 "외부 사용"을 선택합니다.
   26. 가장 최근의 외부 표준 곡선 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다.
   27. 농도가 할당되어있는 경우 곡선이 존재하지 일직선를 보장하기 위해 절대 정량 메뉴의 각 곡선 봐. 705/Back (530)의 절대 정량이 자동으로 분석됩니다.
4. 숨어품 질 관리
   1. 어느 쪽이든 더 자주하는 쪽을 택 시약의 새로운 로트 번호가 수신 될 때마다 새로운 표준 곡선, 또는 6 개월마다, 생성합니다.
   2. 마그네슘과 마스터 믹스에 각 표준의 10 μl를 추가합니다. 이전에 추출 된 DNA와 키트에 포함 된 기준을 고려한다.
   3. 마그네슘은 정확한 정량을 보장하기 위해 표준 곡선을 생성하는 데 사용과 마스터 믹스에 각 표준에 대한 내부 통제의 1 μl를 추가합니다. 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대한 밀리그램 마스터 믹스에 IC를 추가하지 마십시오.
   4. 16 데이터 포인트에 달하는, NTC 및 정량 표준 QS 4, 3, 2, 1, 표준 곡선을 생성하기위한 실행 QS4의 1:10 희석의 세 개의 반복을 준비한다.
   5. 반복 된 표준에 대한 드롭 다운 메뉴 "의 복제"를 선택합니다
   6. 채널 530/back의 없음을 선택하고 실행을 분석 할 때 색 보정을 켜
   7. "(런) 표준 곡선"에서 "선택 전으로 저장영원한 "곡선의 이름을 지정합니다. 저장할 때 "표준 곡선으로 적용"주석을 입력합니다.
   8. 결과를 그래프. 그 결과 선형 계수는 0.81 ≥해야합니다.
   9. 매일 실행의 경우, 런타임에서 컨트롤로 QS3 또는 QS4의 복사본을 포함한다. 현재 외부 표준 곡선은 분석 단계에서 실행으로 가져올 수있다.
   10. 실행 관리 : DNA 제어, 음성 대조군, 낮은, 높은 양을 제어합니다. 예상 바이러스 부하가 결정하고 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정된다.
   11. 각 샘플에 IC를 추가하고 DNA를 추출하는 동안 제어 할 수 있습니다.
   12. 컨트롤의 범위 밖으로 떨어질 경우, 받아 들일 수없는 결과를 기록하고, 문제 해결에 대한 분석을 참조하십시오.
5. 컨트롤의 주파수
   1. NTC, 음, 낮은 양, 양의 높은, 및 표준 제어 : 모든 실행에 포함.

참고 : 컨트롤에 대한 허용 한계를. 더 피크가 관찰 될 수 없습니다노 템플릿 (NTC) 및 음성 대조군에 대한 개발. 봉우리는 530 채널에 존재해야하며, 예상 바이러스 부하는 결정 낮고 높은 긍정적 인 컨트롤의 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정됩니다.

결과

228 조직 블록의 총 모호 CMV IHC와 조직학 및 긍정적 인 면역 조직 화학 (IHC), 18 일을 기준으로 91 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 긍정적 인 사례로 구성되었다 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에), 79 음의 컨트롤에 의해 테스트되었습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, CMV 양성 케이스 전형적인 CMV 바이러스 개재물 (A) 및 / 또는 양성 IHC 염색 (B)을 보여준 것이다. 음성...

토론

많은 실험 방법은 혈청 학적 검사, 바이러스 배양, 분자 바이러스 혈증의 분석, 조직 검사 재료의 조직 학적, 그리고 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직 검사 최근에 설명 된대로, 분자 분석을 포함하여 거대 세포 바이러스의 진단 (CMV) 감염을 사용할 수 있습니다 조직 ^5,6. 혈청 검사는 진단의 의지가 한 번 만 안정적으로 노출을 식별하고 급성 CMV 감염 ^7과 잘 상관하지 않?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microfuge tubes	Costar	3620
serrated forceps	Electron Microscopy Services	62086-1S	Micro Forceps MF-1
Tabletop centrifuges (microfuge)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1 gallon
Ethanol	Fisher	Fisher Scientific: ET108	96-100%
microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR Supplement Kit	Qiagen	1031873
LightCycler centrifuge	Roche	75005087
LightCycler Cooling Block	Roche	10800058001
LightCycler Capping Tool	Roche	3357317
Color Compensation Kit	Roche	2158850
LightCycler 20 μL Capillaries	Roche	1 909 339
blades	Sakura	Fisher Scientific: 4689	Accu-Edge low profile