QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

Özet

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Özet

Bu şiddetli enfeksiyon geliştirmek için onların daha fazla risk göz önüne alındığında, gastrointestinal (Gİ) bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda yolu sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu tespit etmek çok önemlidir. CMV enfeksiyonu tespiti için çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü ve moleküler yöntemler de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Genellikle, bu yöntemler CMV ile sistemik ilişkisini yansıtır ve özellikle lokal doku tutulumu tespit yok. Bu nedenle, GI bölgesindeki CMV enfeksiyonu tespiti sıklıkla biyopsi dokusu, geleneksel histoloji ile yapılır. Immünohistokimyasal (İHK) ile birlikte hematoksilen ve eozin (H & E) boyama Bu biyopsilerin incelenmesi dayanaklarını kalmıştır. H & E ve İHK bazen yorumlama zorlaştırır, atipik (şüpheli) boyanma sonuçlanabilir. Bu CMV kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) başarılı bir şekilde çok için formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi dokusu üzerinde gerçekleştirilebilir gösterilmiştiryüksek duyarlılık ve özgüllük. Bu protokolün amacı, bir klinik laboratuvar ortamında FFPE biyopsi dokusunda CMV tespiti için qPCR testleri gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. Bu yöntem, GI biyopsilerinde CMV için belirsiz boyanma durumlarda hastalar için büyük bir fayda olması muhtemeldir.

Giriş

Klinik örneklerde sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu yorumlanması önem taşımaktadır. CMV herpesvirüslerinin betaherpesvirinae alt familyasının bir üyesidir. Diğer herpes virüsleri benzer şekilde, CMV, aktif viral replikasyon ¹ eksikliği ile karakterize edilen bir biçimde ya da latent enfeksiyon kurma yeteneğine sahiptir. Virüsün reaktivasyonu hastalık belirtileri ^2-4 eşlik edilebilir virionu salınımıyla karakterize aktif viral replikasyon, yol, stres veya diğer immünosupresyonun dönemlerinde oluşabilir. Gastrointestinal (GI) CMV hastalığı belirtileri sık sık karın ağrısı ve / veya kanlı dışkı ¹ içerir.

Histoloji CMV gastroenterit tanısı hematoksilen ve CMV viral kapanımlar tespit etmek eozin (H & E) kullanır. Klinik şüphe yüksek henüz belirgin kalıntılar görülmektedir durumlarda, immünhistokimyasal (İHK) sık sık bir yardımcı bir test yöntemi olarak kullanılmaktadır. Ancak, İHKAyrıca yorumlanması zor (Şekil 2) ⁵ yapma, nadir klasik olmayan görünen hücresel boyanma (şüpheli) engel olabilir. Bu formalin fikse, parafine gömülü (FFPE) GI biyopsi dokusu ve GI biyopsi CMV'nin algılamak için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) çıkarılan DNA kullanmak için aranan oldu. Bu teknik, GI biyopsilerinde CMV saptanmasında önemli olduğu gösterilmiştir ve şüpheli IHC boyama durumlarda ^5,6 özellikle yararlıdır edilmiştir. Ayrıca, qPCR da ⁶ uygun olduğunda ek klinik CMV test verileri ile iyi bir korelasyon olduğu gösterilmiştir. CMV tespit QPCR kullanımı CMV için klinik şüphe yüksek olduğu durumlarda erken tanı ve tedaviye yol açabilir, fakat H & E ve CMV İHK olumsuzdur.

Protokol

Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, elektronik laboratuvar veritabanı arama gastrointestinal (CMV) enfeksiyonu vakalarının histopatolojik tanı (GI) biyopsiler (hematoksilen temsil eden (FFPE) bloklar ve gömülü formalin fikse, parafin belirlemek için yapıldı eozin (H & E) ve / veya immünohistokimya (IHC)).

FFPE GI Biyopsi Doku 1. Doku İşleme

1. Sitomegalovirüs (CMV) için FFPE GI biyopsi doku blokları toplayın kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR). Bu bloklar, oda sıcaklığında saklanır.
2. Bloğun benzersiz kimlik numarası ile Pre-etiket 1.7 ml mikrofuj tüpler.
3. Mikrotom çarkını kilitleyin.
4. Kaset kıskaç içine doku blok koltuk.
5. Taze, kullanılmamış bir bıçak kullanarak, mikrotom üzerinde bıçak açısına blok hizalayın.
6. 10 mikron kalınlığında bölümleri kesmek için mikrotomu ayarlayın.
7. Th kilidinie çarkı ve avans bıçağın doğru bloğu.
8. Her kesim bir doku kaydırma içine rulo sağlayan, 10 mikron kalınlığında aralıklarla bloğunun 5 bölümleri kesmek. Her kaydırma istenen biyopsi dokularının yeterli gösterimini içeren emin olun.
9. Mikrotom çarkını kilitleyin.
10. Forseps ile, sadece çapraz kirlenme riskini azaltmak amacıyla, parafin ile kaydırma işlemek için dikkatli olmak, önceden etiketlenmiş bir santrifüj tüpü içine doku tüm 5 kayar yerleştirin. Tüp kapağı ek ve rafa geri yerleştirin.
11. Mikrotom gelen doku bloğu çıkarın.
12. Çıkarın ve bıçak atın.
13. Önceki doku ile temas etmiş olabilecek yüzeyleri veya araçları dekontamine.
14. Bıçak tutucu içine taze, kullanılmamış bıçağı yerleştirin.
15. Tekrar işlenecek her bir ek blok için 1,4-1,14 adımları tekrarlayın. Doku kayar ihtiva mikrofüj tüpler tim kadar oda sıcaklığında saklanabilirDNA ekstraksiyon e.

FFPE GI Biyopsi Doku Scrolls 2. DNA Ekstraksiyon

NOT: Bu protokol FFPE doku DNA ekstraksiyon kiti (: Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) bakın DİKKAT) ve prospektüste uyarlanmıştır.

1. Her bir numune, bir mikrofüj tüpüne 1 ml ksilen (MGVS'de Bakınız DİKKAT) ekleyin. Kuvvetli bir şekilde 10 saniye için kapak ve girdap kapatın.
2. Spesifik olarak şu değişiklikler ile üreticinin ürün ekin özetlenen DNA ekstraksiyonu ile devam edin.
3. İlk olarak, her bir mikrofüj tüpüne, dahili kontrol (IC) 6 ul ekleyin.
   1. 1 saat boyunca 56 ° C'de ATL / proteinaz K liziz inkübasyondan sonra, 1 saat süre ile, 30 dakika boyunca 99 ° C 'de yerine, 90 ° C inkübe edin.
   2. Nihai DNA elüsyon adımı sırasında dikkatli bir DNA saflaştırma kolonunun kapağı açın ve oldukça Buffe göre, zarın merkezi 50 ul damıtılmış DNAse / RNAse içermeyen su uygulamakr ATE.
      NOT: Uygun depolama ve reaktiflerin hazırlanması için paket içeriğine bakınız. DNA Tüm 5 FFPE verilirse elde edilmelidir. Oda sıcaklığında (15-25 ° C) tüm santrifüj adımları uygulayın.

CMV 3. QPCR

1. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Prosedür
   1. CMV tahlil çalıştırmak için bir Excel çalışma sayfası PCR oluşturun. Bu Excel çalışma sayfası Mg ile ana karışımı telafi etmek için gerekli her reaktif toplam miktarını hesaplar. Bu örnek başına ihtiyaç duyulan her reaktif miktarını (aşağıda listelenen) kez örneklerin ve kontrollerin sayısı artı çarpar biri (nedeniyle pipetle için kaybını telafi etmek için).
      1. Miktarında, her PCR reaksiyonunda aşağıdaki reaktifler belirtilen şunlardır:
         Reaktif0; Örnek başına miktar
         CMV LC usta karışımı flakon 12.5 ul
         Mg Çözüm sarı flakon 2.5 ul
         Toplam hacmi 15.0 ul
   2. , Bir su ya da hedefsiz kontrol (NTC), negatif kontrol, düşük bir pozitif kontrol, yüksek bir pozitif kontrol ve QS3 veya QS4 ya da, ve hasta numuneleri, her deneyde dahil çalıştırın. Kapilerler bu sırayla kurmak olmalıdır.
   3. 4 ° C'de saklanan gerçek zamanlı PCR alet için soğutma bloğu spesifik elde edilir Soğutma bloğu içinde uygun kılcal tüpler yerleştirin. Kılcal tüplerin yüzeyine dokunmayın. Kılcal damarları tutarken daima eldiven kullanın.
   4. Amplifikasyon üretimi ile kontamine olmayan temiz bir başlık tüm polimeraz zincir reaksiyonları kurmakts.
      1. Tüm hasta örnekleri, artı 5 kontrolleri test etmek için PCR kiti usta şişeleri doğru sayısını çıkarın. Let ana flakon, Mg çözüm ve soğutma bloğuna PCR sınıf su çözülme. Her bir ana şişe 12 testler için yeterince reaktif madde içerir.
      2. Yavaşça ana şişeleri vorteks ve hızlı maksimum hızda santrifüj bunları dönerler.
      3. Bir şişenin içine her ana flakon içeriğini birleştirin ve yavaşça tekrar vorteks.
      4. Tek bir steril mikrofüj tüpü içine PCR çalışma sayfasına belirtilen miktarlarda ana karışımı ve Mg solüsyonu birleştirin.
      5. Kantitasyonu standart (QS) için olan konum 5 kılcal dışında, her bir kılcal tüp içine yavaşça ve kısım Mg ile ana karışımı 15 ul karıştırın.
   5. Temiz başlık bir işleme kaput Mg ile kılcal boru ve ana karışımı içeren soğutma bloğunu taşımak.
   6. Master kalan 30 ul iç kontrolün 2 ul (IC) EkleMg ile karıştırın. 5. pozisyondaki kılcal (QS için konum) içine yavaşça ve 15 ul alikot karıştırın.
   7. Su pipetle 10 ul, uygun bir kılcal tüp içine DNA, ya da örnek DNA kontrol eder. Kapatma aracını kullanarak kılcal tüpler Cap.
   8. Real-time PCR enstrüman blok / örnekleri soğutma atın.
2. Real-time PCR enstrüman programı (bkz. Tablo 1)
3. Amplifikasyonu ve saptanması, gerçek zamanlı PCR cihazı üzerinde gerçekleştirilen
   1. Bilgisayarda oturum
   2. Çift alet simgesine tıklayın ve yazılımı içine giriş.
   3. Real-time PCR aleti açın
   4. Ön ekrandan "CMV / EBV" üzerine tıklayın.
   5. Makro Sihirbazın istemleri izleyin.
   6. Yazılımı tarafından istendiğinde bir self-test çalıştırmak için kutusunu seçin. A self-test Cihaz kullanımdayken her gün bir defa yapılmalıdır.
   7. Run Ad.
   8. Üst LEF bulunan örnek sayısını ayarlayınkontrol ve hasta toplamına sayfanın t köşe vadede dahildir ve her hasta numunesi kimlik numarasını girin.
   9. "Abs Quant" sekmesine tıklayın.
   10. "Numune türü" altında, standart için uygun örnek türü atayabilirsiniz.
   11. Sayımıdır standart (QS) için beklenen konsantrasyonlarda yazın.
   12. Soğutucu bloğundan kılcal tüpleri çıkarın ve (blok örnek # 1 soğutma, vb atlıkarınca pozisyon # 1 yerleştirilmelidir) atlıkarınca karşılık gelen konuma yerleştirin.
   13. Cihazın santrifüj ve basın başlangıç ​​içine atlıkarınca yerleştirin.
   14. Santrifüj açın ve atlıkarınca çıkarın.
   15. Real-time PCR aracı haline atlıkarınca yerleştirin. Kapağı kapatın.
   16. Basın "Başlat Çalıştır".
   17. Gerçek-zamanlı PCR cihazı, bir numune için her pozisyonunu kontrol eder. Bu onay tamamlanana kadar uzak cihazdan değil yürümek, ESPEkılcalların bir atlıkarınca değilse likle. Cihaz, bu not ve çalışma devam edecek olup olmadığını soracaktır. Ayrılmadan önce evet cevabı.
   18. Çalışma tamamlandıktan sonra, oluşturulan raporu kapatın.
   19. "Mutlak Nicel" üzerine tıklayın.
   20. Sonraki Color Tazminat için oka tıklayın.
   21. Açılan kutudan "Renk Seç Tazminat" tıklayın.
   22. Vadede uygulamak için en güncel renk telafisi dosyayı seçin.
   23. Kutusu açılır, Tamam'a tıklayın.
   24. Standart Eğrisi tarafından oka tıklayın.
   25. Açılan menüden "dış kullanın" seçeneğini seçin.
   26. En güncel dış standart eğri dosyayı seçin, ardından Tamam'a tıklayın.
   27. Bir konsantrasyon atanırsa eğrileri, mevcut ve düz değil çizgi emin olmak için mutlak miktarının menüsü altında her eğri bak. 705/Back 530 Mutlak miktarının otomatik olarak analiz edilir.
4. Quality kontrolü
   1. Daha sık hangisi belirteçlerin yeni bir lot numarası alındığında, yeni bir standart eğri, ya da her altı ayda bir, üretir.
   2. Mg ile ana karıştırmak için her bir standart 10 ul ekleyin. Daha önce çıkarılan DNA gibi kiti ile birlikte standartları düşünün.
   3. Mg doğru sayılmasını sağlamak için standart bir eğri oluşturmak için kullanılan ile ana karışımı, her bir standart için iç kontrol 1 ul ekle. Hayır Şablon Kontrolü (NTC) için Mg ile ana karışımı IC katmayın.
   4. 16 veri noktası olarak toplam bir NTC ve kantitasyonu Standartlar QS 4, 3, 2, 1 ve standart eğri oluşturmak üzere çalıştırmak için QS4 bir 1:10 seyreltme üç suret hazırlayın.
   5. Tekrarlanan standartları için açılır menüden of "tekerrür" seçiniz
   6. Kanal 530/back hiçbiri seçin ve çalıştırmak analiz ederken renk tazminat açmak,
   7. "(Run) Standart Eğri" altında "seçeneğini ex olarak kaydetmekdahili "ve eğri isim. Kaydederken "standart eğri olarak uygulanır" açıklama girin.
   8. Sonuçlarını grafik. Elde edilen doğrusallık katsayısı 0,81 ≥ gerekir.
   9. Günlük ishal için, vadede bir kontrol olarak QS3 veya QS4 bir kopyasını içerir. Mevcut dış standart eğri analiz aşamasında vadede ithal edilebilir.
   10. Run Kontroller: hayır DNA kontrol, negatif kontrol, düşük ve yüksek pozitif kontroller. Beklenen viral yük belirlenir ve her satıcı ve çok sayıda ayarlanır.
   11. Her bir örnek için bir IC ekleyin ve DNA ekstraksiyon sırasında kontrol eder.
   12. Denetimlerden herhangi aralığının dışında düşersen, kabul edilemez sonuçları kaydetmek ve sorun giderme için tahlil bakın.
5. Kontrol sıklığı
   1. Bir NTC, negatif, düşük pozitif, pozitif, yüksek ve standart kontrol: Her vadede içerir.

NOT: kontroller için kabul edilebilir sınırlar. Resim tepe noktaları dikkat edilmelidirherhangi bir şablon (NTC) ve negatif kontroller için d. Peaks 530 kanalda bulunması gereken ve beklenen viral yükler belirlenir ve düşük ve yüksek pozitif kontroller için her satıcı ve çok sayıda ayarlanır.

Sonuçlar

228 doku blok toplam şüpheli CMV İHK ile histoloji ve pozitif immünohistokimyasal (İHK), 18 dayanan 91 sitomegalovirüs (CMV) pozitif olgu oluşuyordu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ve 79 negatif kontroller ile test edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CMV pozitif vaka tipik viral CMV kusurları (A) ve / veya pozitif boyanma IHC (B) göstermiştir olacaktır. Negatif kontroller hiçbir şüpheli histoloji veya İHK lekeleme ⁵ gös...

Tartışmalar

Pek çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü, moleküler viremi deneyleri, biyopsi histolojisi ve, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi son gösterildiği gibi, moleküler deneyleri de dahil olmak üzere sitomegalovirüs tanısında (CMV) enfeksiyonu için kullanılabilir doku ^5,6. Seroloji, tanı bir dayanak kez, sadece güvenilir bir pozlama belirler ve akut CMV enfeksiyonu ⁷ ile iyi bir korelasyon yoktur. Geleneksel ve erken antijene kabuk şişe hem de Vi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microfuge tubes	Costar	3620
serrated forceps	Electron Microscopy Services	62086-1S	Micro Forceps MF-1
Tabletop centrifuges (microfuge)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1 gallon
Ethanol	Fisher	Fisher Scientific: ET108	96-100%
microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR Supplement Kit	Qiagen	1031873
LightCycler centrifuge	Roche	75005087
LightCycler Cooling Block	Roche	10800058001
LightCycler Capping Tool	Roche	3357317
Color Compensation Kit	Roche	2158850
LightCycler 20 μL Capillaries	Roche	1 909 339
blades	Sakura	Fisher Scientific: 4689	Accu-Edge low profile