КПЦР является чувствительным и быстрый метод для обнаружения цитомегаловирусной ДНК в формалине фиксированной парафин биопсии ткани

Резюме

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Аннотация

Очень важно определить цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции в желудочно-кишечном тракта (ЖКТ) из пациентов с иммунодефицитом, учитывая их более высокий риск для развития тяжелой инфекции. Многие лабораторные методы для обнаружения ЦМВ-инфекции были разработаны, в том числе серологических, вирусной культуры и молекулярных методов. Часто эти методы отражают системный причастность к ЦМВ и не конкретно определить причастность местных тканей. Таким образом, обнаружение цитомегаловирусной инфекции в желудочно-кишечном тракте часто делается путем традиционного гистологии биопсии ткани. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание в сочетании с иммуногистохимии (IHC) остались устои рассмотрении этих биопсии. Н & Е и IHC иногда привести к атипичных (двусмысленных) моделей окрашивания, делая интерпретация трудно. Было показано, что количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) для ЦМВ успешно может быть выполнена на фиксированных формалином, парафин (FFPE) биопсии ткани для оченьВысокая чувствительность и специфичность. Целью этого протокола является продемонстрировать, как выполнить тестирование КПЦР для обнаружения ЦМВ в FFPE биопсии ткани в клинических лабораторных условиях. Этот метод, вероятно, будет весьма полезным для пациентов в случаях двусмысленной окрашивания для ЦМВ в GI биопсии.

Введение

Интерпретация цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции в клинических образцах является критически важным. ЦМВ является членом Betaherpesvirinae подсемейства герпесвирусов. Как и в других герпесвирусов, ЦМВ имеет возможность установить постоянный или латентной инфекции характеризуется отсутствием активной репликации вируса ^1. Повторная активация вируса может произойти во время стресса или другого иммуносупрессии, что приводит к активной репликации вируса характеризуется вириона релиза, который могут сопровождать проявлений болезни ^2-4. Желудочно-кишечные (GI) симптомы ЦМВ заболевания часто включают боль в животе и / или Кровавый стул ^1.

Диагноз ЦМВ гастроэнтерита по гистологии использует гематоксилином и эозином (H & E) для выявления ЦМВ вирусных включений. В случаях, когда не высокая, но наблюдаются никаких очевидных включений клиническое подозрение, иммуногистохимия (IHC) часто используется в качестве адъюнкт-метода испытания. Тем не менее, IHCтакже может быть затруднено редких неклассических появляющихся моделей сотовых окрашивания (двусмысленных), что делает толкование трудно (рис. 2) ^5. Было стремились использовать ДНК, выделенной из фиксированных формалином, парафин (FFPE) Г.И. биопсии ткани и количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) для обнаружения ЦМВ в GI биопсии. Эта техника была показано, что ценно в обнаружении ЦМВ в GI биопсии, и особенно полезно в двусмысленных IHC окрашивания случаях ^5,6. Кроме того, КПЦР Также было показано, хорошо коррелирует с клинической дополнительной тестовых данных CMV, когда это доступно ^6. Использование кПЦР в обнаружении ЦМВ может привести к ранней диагностике и лечения в тех случаях, когда клинические признаки ЦМВ является высокой, но H & E и ЦМВ IHC отрицательны.

протокол

С одобрения Institutional Review Board в, поиск электронного лабораторного базе данных было проведено с целью определить формалином парафиновых (FFPE) блокирует представляющие случаи цитомегаловируса (ЦМВ) инфекции в желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) биопсии диагнозом гистопатологией (гематоксилином и эозином (H & E) и / или иммуногистохимия (IHC)).

1. Тканей Обработка от FFPE Г.И. Биопсия ткани

1. Сбор FFPE GI биопсия тканей блоки для цитомегаловируса (ЦМВ) количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). Эти блоки хранили при комнатной температуре.
2. Предварительно метка 1,7 мл микроцентрифужные пробирки с уникальным идентификационным номером блока.
3. Зафиксируйте микротоме маховик.
4. Установив блок тканей в кассетный зажим.
5. Использование абсолютно чистую лезвие, выровнять блок в угол ножа на микротоме.
6. Отрегулируйте микротом сократить толщиной 10 мкм разделы.
7. Разблокировать тыс.э маховик и заранее блок к лезвию.
8. Отрежьте 5 секций блока в 10 мкм толщиной интервалами, что позволяет каждому вырезать свернуть в свиток ткани. Убедитесь, что каждый свиток содержит адекватного представительства желаемых биопсии тканей.
9. Зафиксируйте микротоме маховик.
10. С щипцов, разместить все 5 свитки ткани в предварительно меченных трубки центрифуги, будьте осторожны, чтобы только управлять свиток на парафин, чтобы уменьшить потенциал для перекрестного загрязнения. Привязать крышку на трубе и поместить его обратно на полку.
11. Снимите блок тканей от микротоме.
12. Снимите и выбросьте лезвие.
13. Дезактивации любых поверхностей или инструментов, которые могли вступать в контакт с предыдущим ткани.
14. Наведите абсолютно чистую лезвие в держатель ножа.
15. Повторите шаги 1.4-1.14 для каждого дополнительного блока должны быть обработаны. Микроцентрифуге трубки, содержащие ткани прокручивается можно хранить при комнатной температуре до ВММе экстракции ДНК.

2. Добыча ДНК из свитков из FFPE Г.И. Биопсия ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из пакета вставки ткани ДНК извлечения комплекта FFPE (Осторожно: См. Материал Паспорт безопасности (MSDS)).

1. Добавить 1 мл ксилол (Осторожно: См. паспорт безопасности) для каждого образца пробирке. Закройте крышку и вихрь энергично в течение 10 сек.
2. Продолжайте выделения ДНК, как конкретно изложенной в вставки продукции производителя со следующими изменениями.
3. Сначала добавьте 6 мкл внутреннего контроля (IC) для каждой пробирке.
   1. После ATL / протеиназой К лизиса инкубации при 56 ° С в течение 1 ч, инкубировать при 99 ° С в течение 30 мин, а не 90 ° C в течение 1 часа.
   2. На заключительном этапе элюции ДНК, тщательно открыть крышку колонны очистки ДНК и применять 50 мкл дистиллированной ДНКазы / РНКазы свободной воды в центре мембраны, а не Buffeг ATE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Вставка пакета для соответствующего хранения и приготовления реагентов. ДНК должны быть извлечены из всех 5 FFPE свитков. Выполните все шаги центрифугирования при комнатной температуре (15-25 ° C).

3. КПЦР для ЦМВ

1. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) Процедура
   1. Создать электронную таблицу ПЦР Excel для серии анализов ЦМВ. Этот лист Excel вычисляет общее количество каждого реагента, необходимого для составляют основной смеси с Mg. Это умножает количество каждого реагента, необходимого на образец (перечислены ниже), умноженным на число образцов и контролей плюс один (для компенсации потерь, связанных с отбором,).
      1. Включить следующие реагенты в каждой реакции ПЦР в размере указано:
         Реагент0; Количество в образце
         ЦМВ LC Master Mix флакон 12,5 мкл
         Mg Решение желтые флакон 2,5 мкл
         Общий объем 15,0 мкл
   2. Включите в каждом тесте, запустить воду или нет целевой контроль (NTC), отрицательный контроль, низкий положительный контроль, высокий положительный контроль, и либо QS3 или QS4, и все образцы пациентов. Капилляры должны быть созданы в этом порядке.
   3. Получить охлаждения блокировать определенные для ПЦР в реальном времени инструмент, который хранится при температуре 4 ° C. Поместите соответствующие капиллярных трубок в охлаждающей блока. Не прикасайтесь к поверхности капилляров. Всегда используйте перчатки при работе капилляры.
   4. Устанавливает все полимеразной цепной реакции в чистом капотом не загрязненных усиления произц.
      1. Удалить правильное количество мастер-флаконах из комплекта ПЦР для проверки всех образцов пациентов, плюс 5 управления. Пусть мастер пузырьки, решение Mg и ПЦР класса оттепель вода в охлаждающей блока. Каждый мастер флакон содержит достаточно реагенты для 12 тестов.
      2. Аккуратно вихрь мастер пузырьки и быстро вращать их в центрифуге при максимальной скорости.
      3. Объединить содержимое каждого мастер флакона в одном флаконе, и мягко вихрь снова.
      4. Объедините основной смеси и раствора Mg в указанных количествах на листе ПЦР в единый стерильной пробирке.
      5. Осторожно перемешать и аликвоты по 15 мкл мастер-микс с Mg в каждый капилляр, за исключением капилляра в положении 5, который является для стандарта количественного (QS).
   5. Перемещение охлаждения блок, содержащий капиллярные трубки и мастер смеси с Mg от чистой капотом на перерабатывающую капотом.
   6. Добавить 2 мкл внутреннего контроля (ИС) на оставшиеся 30 мкл мастерасмешать с Mg. Осторожно перемешать и аликвоты по 15 мкл в капилляр в положении 5 (положение для QS).
   7. Внесите 10 мкл воды, контролировать ДНК или образец ДНК в соответствующий капиллярной трубки. Закройте капиллярные трубки, используя укупорки инструмент.
   8. Возьмите охлаждения блок / образцы в ПЦР в реальном времени инструмент.
2. Запрограммировать ПЦР в реальном времени инструмент (см. таблицу 1)
3. Амплификации и детекции выполнена на ПЦР в реальном времени инструмента
   1. Войдите в компьютер
   2. Дважды щелкните на пиктограмме инструмента и войти в программу.
   3. Включите ПЦР в реальном времени инструмент
   4. Нажмите на кнопку "CMV / EBV" от переднего экрана.
   5. Следуйте подсказкам на макро мастера.
   6. Установите флажок для запуска самотестирования при запросе с помощью программного обеспечения. Самотестирования необходимо выполнить один раз каждый день прибор находится в использовании.
   7. Назовите перспективе.
   8. Отрегулируйте количество образца, расположенную в верхнем ЛЕФт углу страницы сумме управления и пациентов, включенных в перспективе и введите идентификационный номер каждого образца пациента.
   9. Перейдите на вкладку "Абс Квант".
   10. В разделе "типа Sample", назначить соответствующий тип выборки для стандарта.
   11. Введите в ожидаемых концентраций для стандарта количественного (QS).
   12. Удалить капиллярные трубки охладительный блок и поместить их в соответствующем положении в карусели (охлаждение блока выборки № 1 должны быть помещены в позиции № 1 на карусели и т.д.).
   13. Поместите карусель в центрифуге и пресс-начала инструмента.
   14. Откройте центрифугу и снимите карусель.
   15. Поместите карусель в ПЦР в реальном времени инструмента. Закройте крышку.
   16. Нажмите кнопку "Пуск Выполнить".
   17. ПЦР в реальном времени прибор будет проверять каждую позицию для образца. Не уходи от инструмента до эта проверка не была завершена, особенно если один из капилляров не в карусели. Прибор внимание, это и спросить, если пробег должен быть продолжен. Перед отъездом Ответ да.
   18. После выполнения завершена, закройте отчет, который был создан.
   19. Нажмите на кнопку "Абсолютной количественного".
   20. Нажмите на стрелку рядом с Color компенсации.
   21. Нажмите кнопку "Выбрать цвет Компенсация" из выпадающего списка.
   22. Выберите наиболее текущий файл компенсации цвет обратиться в перспективе.
   23. Нажмите OK, когда появляется окно.
   24. Нажмите на стрелку по стандартной кривой.
   25. Выберите "использовать внешний" из меню раскрывающегося списка.
   26. Выберите самую последнюю внешний файл стандартной кривой, нажмите кнопку ОК.
   27. Посмотрите на каждой кривой в меню абсолютного количественного чтобы убедиться, что кривые присутствуют, а не плоская линия, если концентрация присваивается. Абсолютного количественного для 705/Back 530 автоматически анализируется.
4. Цюйконтроль Эк
   1. Создать новую стандартную кривую, когда новый номер партии реагентов полученную или каждые шесть месяцев, в зависимости от того является более частыми.
   2. Добавить 10 мкл каждого стандарта на мастер-микс с Mg. Рассмотрим стандарты, включенные в наборе как с ранее выделенным ДНК.
   3. Добавить 1 мкл внутреннего контроля для каждого стандарта в мастер-микс с Mg, используемого в производстве стандартной кривой для того, чтобы заверить точно оценить. Не добавляйте IC к мастер-микс с Mg для никакого контроля шаблонов (NTC).
   4. Подготовка NTC и трех повторностей количественного стандартам QS 4, 3, 2, 1 и разведении 1:10 на QS4 для выполнения, чтобы генерировать стандартной кривой, на общую сумму в 16 точек данных.
   5. Выберите "Перенос из" в выпадающем меню для повторных стандартам
   6. Выбирать канала 530/back ни и включите компенсации цвета при анализе бег,
   7. Под "калибровочной кривой (в беге)", выберите "сохранить как эксвнешнего "и назовите кривую. Введите комментарий "применяется как стандартной кривой" при сохранении.
   8. Граф результаты. В результате коэффициент линейности должны быть ≥ 0,81.
   9. Для ежедневных пробегов, включают одну копию QS3 или QS4 в качестве контроля в бегах. Нынешний внешний стандарт кривая может быть импортирован в перспективе на этапе анализа.
   10. Запуск Управление: нет контроля ДНК, отрицательный контроль, низкие и высокие положительные элементы управления. Ожидаемый вирусная нагрузка определяется и регулируется для каждого поставщика и номер партии.
   11. Добавить IC для каждого образца и контроля во время экстракции ДНК.
   12. Если любой из элементов управления выпадают из диапазона, записывать неприемлемые результаты, отсылая анализ для устранения неполадок.
5. Частота контроля
   1. Включите в каждом счете: NTC, отрицательный, слабоположительного, высокая положительная, и стандарт управления.

Внимание: допустимые пределы для контроля. Нет пики не следует заметитьг для не шаблон (NTC) и отрицательных контролей. Пики должны присутствовать в 530 канала и ожидаемые вирусные нагрузки определяются и корректируются для каждого поставщика и номер партии для низких и высоких положительных контролей.

Результаты

В общей сложности 228 блоков ткани были испытаны с помощью количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР), который состоял из 91 цитомегаловируса (CMV) положительных случаев на основе гистологии и иммуногистохимии положительной (IHC), 18 с сомнительного CMV IHC и 79 отрицательных контролей. Ка...

Обсуждение

Многие лабораторные методы доступны для диагностики цитомегаловируса (ЦМВ) инфекции, в том числе серологических, вирусной культуры, молекулярных анализов виремии, гистологии материале биопсии, и, как недавно продемонстрировали, молекулярных анализов фиксированные формалином, парафи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microfuge tubes	Costar	3620
serrated forceps	Electron Microscopy Services	62086-1S	Micro Forceps MF-1
Tabletop centrifuges (microfuge)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1 gallon
Ethanol	Fisher	Fisher Scientific: ET108	96-100%
microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR Supplement Kit	Qiagen	1031873
LightCycler centrifuge	Roche	75005087
LightCycler Cooling Block	Roche	10800058001
LightCycler Capping Tool	Roche	3357317
Color Compensation Kit	Roche	2158850
LightCycler 20 μL Capillaries	Roche	1 909 339
blades	Sakura	Fisher Scientific: 4689	Accu-Edge low profile