心臓麻痺逮捕と気絶心筋関連のマウス単離された心臓モデル

要約

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

要約

以下のプロトコルは、心臓機能障害または気絶心筋以下の中程度の虚血性傷害を評価するための使用です。技術は心臓麻痺停止および心肺バイパス、オフポンプCABG、移植、狭心症、簡単な虚血などで心臓手術を含む多くの臨床的に関連する現象に関連した虚血性損傷をモデル化するのに便利です。プロトコルは、心筋の収縮機能の測定に焦点を当て、げっ歯類心臓における低体温高カリウム血性心筋保護停止および再灌流をモデル化するための一般的な方法を提示します。簡単に説明すると、マウスの心臓は、ランゲンドルフモードで灌流される心室内バルーンが装備し、ベースラインの心臓機能のパラメータが記録されています。安定化に続いて、次に心臓を拡張期停止を開始するために、心臓保護、低体温心臓麻痺溶液の注入をブリーフィングすることがあります。心停止は、2時間かけて断続的に配信されます。心臓は、その後、再灌流およびヴェルメれます正常体温の温度及び心筋機能の回復にdが監視されます。信頼性が落ち込んで心臓収縮機能におけるこのプロトコルの結果を用いげっ歯類における総心筋組織の損傷がありません。

概要

気絶心筋は虚血又は心臓保護の^1,2,3,4,5と虚血性発作の持続期間の短い期間の後に十分な血流の回復にもかかわらず、可逆的に減少収縮活動として定義されています。提示された方法は、特に収縮機能における可逆障害をもたらすことができる臨床的に関連する虚血性傷害をモデル化するために使用される（ すなわち、心臓手術は心臓麻痺停止、虚血、狭心症などの短い期間を利用することに関連する虚血性傷害）。重度の虚血研究（心筋梗​​塞、壊死）とは対照的に、このプロトコルは、組織の損傷、リモデリングおよび細胞死なしに心筋機能回復及び心臓保護を評価するために開発されました。論文の大部分は低体温症と断続的な心停止送達を用いて心臓手術と同様の要素を持つ標準心筋保護逮捕プロトコルについて説明します。

心筋PROT心臓手術の大半中ectionは心停止と心肺バイパスに依存しています。心臓麻痺（CP）ソリューションと戦略は（血液、晶質、寒い、暖かいなど ）が広く異なりますが、最も一般的な要素は、1）高カリウム血症および/ ​​または心筋の収縮に起因するエネルギーの利用を制限し、拡張期に心臓を停止させる他の戦略であります2）低体温は、代謝を遅くし、逮捕しながらATPなどのエネルギー埋蔵量を維持するのに役立ちます。現在の心筋保護液は、そうでなければ致死的な証明する虚血性発作に対する心臓への保護を提供します。しかし、外科的虚血性発作時の心保護戦略は完全ではなく、得られた軽度の虚血性損傷は、適切な血流（見事な心筋）、アシドーシス、心筋の損傷、および減少冠動脈灌流および血管攣縮を含む血管の効果にもかかわらず、可逆心臓収縮不全をもたらすことができます。

このプロトコルが異なります簡単な虚血または心筋保護の逮捕に関連した虚血性発作、次の心臓機能障害をもたらすことができる心筋梗塞、それはより軽度の虚血性傷害を評価することで重度の虚血を評価する標準的な単離された心臓の虚血モデルから。 （ ^{- 8}ランゲンドルフ灌流技術のレビューおよびI / Rのための研究では^、6を参照します）。一般的なガイドラインとマウス単離された灌流心臓に関連した実験パラメータを徹底的に分析するためのサザーランドのE Tの文献を参照してください。2003は、ここで紹介する技術は確実にマウスの心の中で見事な誘導するのに必要な機器、試薬、手順、戦略とヒントを詳述^9。マイナーな修飾は、ラットに技術を適用する必要があります。

簡単に言えば、単離されたマウス心臓は、高カリウム血性hypothermの送達を介しコールド保護心停止に続いて、生理学的クレブス - ヘンゼライト緩衝液（KHB）で約30分間、ランゲンドルフ灌流しますIC心筋保護液。逮捕後、心臓の機能回復をKHBで再加温、心臓の再灌流中に監視されています。心臓の収縮機能の回復の程度の変化は、心臓保護剤と異なる心臓保護戦略を評価するために評価することができます。

プロトコル

注：すべての手順は、寿命施設内動物管理使用委員会によって承認され、すべての動物と手順ケアと実験動物の使用¹⁰国立研究協議会ガイドに従って。

1.バルーン作製と左心室圧の監視回路

1. 。Millerらによれば、攪拌棒を入れたビーカーに¹¹ LVバルーンを構築し、ホットプレート上で蒸留水、光コーンシロップとショ糖の33.8グラムの14.2ミリリットル、および熱の9.5ミリリットルを混ぜ、砂糖が溶けるまで混ぜます。それは約150ºCに達するまで加熱ソリューションを続けます。
   注：多くの方法がコンドームの先端と密着フィルム建設^9,12の修正を含むLVのバルーンを構築するために存在します。しかし、密着フィルム風船の利点は、適切なfrequenの以前の特徴付けを含む、上記の方法は、漏れのないバルーンを構築することは比較的容易であることが私たちを見つけますCY -反応関係^9。
2. 長さ5cm程度の断片に乾燥スパゲティ鎖を破壊し、糖液中に約1cmの深各部分の片側を浸し、ゆっくりと取り外します。
3. 発泡スチロールのブロックにパスタ鎖のドライエンドを置き、砂糖ミックスダウン滴下し、ティアドロップ形状の金型を形成するように中断。金型が硬化ようデシケーター中でO / Nのままにしておきます。
4. 次の日は、シリコーン分散ゲルに金型を浸漬します。 AAに戻って発泡スチロールのブロックと所定の位置に2時間または乾燥するまで37ºCオーブンパスタのストランドを配置します。もう一度そのシリコーンの二つの層が適用され、この手順を繰り返します。
5. 乾燥したら、金型からバルーンの除去を助けるために、いくつかの時間水に配置します。 0.02％アジ化ナトリウム溶液に保管風船。
6. 鈍い先端を作成するために、針を切断し、針にノッチを配置することにより、カスタマイズされたバルーンカニューレを生成するように設定23Gの採血を使用してください。
7. トランス圧力にチューブを接続しますデューサとチューブとカニューレを維持しながら、水でフラッシュがシステムを完全に空気が入るのを防ぐために水没します。カニューレに水で満たされたバルーンを配置し、カニューレに結びつけるために2-0絹縫合糸を使用しています。 （少なくとも1時間〜100 mmHgの）圧力を維持する能力による試験バルーン

単離された心臓灌流システムの作製

1. 最初に、システムを洗浄し、温めます。ランゲンドルフ装置に接続された37ºC温水浴循環装置の電源を入れ、蒸留水でバッファ容器を満たします。装置に流入管およびシステムをフラッシュするためにポンプをオンにするための新しいガラス繊維フィルターを接続してください。準備時間中、水浴を正確に設定されていることを確認するために、温度プローブを使用してランゲンドルフブロックから排出水の温度を監視します。また、冷蔵循環ポンプをオンにして、心臓の心筋保護停止中に使用される20ºCに設定します。
2. 私nはその間には、以下のソリューションを準備します。心筋保護液1 L（110のNaCl、16mMの塩化カリウム、16mMのMgCl _2を 、1.5 mMのCaCl ₂を、10mMの_炭酸水素ナトリウム）とフィルタを準備します。また、KHBの2 L（118のNaCl、4.8のKCl、1.2mMのKH ₂ PO _4、1.7mMのMgSO ₄を、2 mMのピルビン酸ナトリウム、6mMのブドウ糖、24.9ミリモルのNaHCO _{3（CO 2}で前通気）を調製、1.4 mMのCaCl ₂を（最後に追加されたが）。溶解後、5μmのガラスフリット漏斗を用いてフラスコ内に濾過することにより沈殿物を除去。手術および単離の間に使用する氷の上の小さな皿にいくつかを置きます。
3. 使用前に少なくとも30分間、95％O _{2/5％CO 2}での灌流液（KHB）をオキシジェ。システムから残りの水を除去し、リザーバーをバッファリングするKHBでランゲンドルフシステムを灌流。マウスの場合は、〜2.0ミリリットル/分に最初のポンプ速度を設定します。灌流カニューレの近くに2-0と4-0絹縫合糸を配置します。チューブ及び装置はウィットを満たされるまでポンプを実行します時間灌流液及び気泡strupを確保するには、灌流液が充填されています。
   注：灌流および安定した機能の長い期間のためにそれは非常に中心部に血栓を形成することができる任意の沈殿物を収集するために、灌流回路のインラインガラス繊維フィルター（〜1μm）をインストールすることをお勧めします

3.マウスの手術

3.1）マウス麻酔および取扱い

1. 80ミリグラム/ kgのケタミン及び5 mg / mlのキシラジン混合物の麻酔薬の投与量で注射器を用意し、0.2ミリリットルにボリュームを起動するために、滅菌0.9％生理食塩水を追加します。ヘパリンIP（千U / mlの溶液50μl）を注入します。
2. 輸送容器（〜10〜20分）に戻すマウスを置き、ヘパリンが有効になるように、それは意識を失うのを待ちます。定期的に痛みの反射を監視するために、つま先のピンチを行います。

3.2）ハートを削除

1. マウスが完全に無意識であると、つま先のピンチに応答するピンまたは25 Gを使用して、適切な手術台に固定していませんしたら四肢を介してシリンジのヒント。心臓を露出するために開胸術を行います。ちょうど胸骨の下に小さな穴をカットし、ダイヤフラムを避けるマウスの側面に切り込みを拡張します。
2. 素早く振動板をカットした後、急速に胸郭の側面をカット。胸腔を露出するようにクラムシェルのような胸郭をバックフリップ。優しく、心のホールドを取るの下にはさみを入れて、心を取り除きます。
   注：それはそれは胸腔内に露出されるとすぐに心を除去することが不可欠であると肺は非機能的です。

3.3）心をきれいにしてください

1. 氷冷KHBを含む皿に心を置き、取り付けられた肺組織のいずれかの大部分を切り落とします。心をピックアップし、大動脈を見つけるために鉗子を使用してください。これは大動脈の開放端でなければならないように静かに、心臓を圧迫し、表示された任意の血液を探します。大動脈の開放端によって心を保持するために、先端の細いピンセットを使用してください。

E "> 4。、ハートを取り付け灌流を開始し、バルーンを配置

4.1）ハートのマウントとカニュレーション

1. ランゲンドルフ装置に心を輸送する前に、灌流圧が低いことを保証するポンプ（〜20 mmHgの）をオンにします。ちょうどカニューレ下大動脈によって心を持ってください。先端の細いピンセットの別のセットを使用して、慎重に大動脈を開き、カニューレに心をスライドさせます。ピンセットの1セットでの場所でそれを保持した後、一時的にカニューレに固定し、ソフトエッジのクリップを使用しています。
   注：すばやく灌流カニューレに心臓を装着するには、良い準備のために重要です。経験により、心臓を装着するまで、胸腔を開いてからの手順は、1〜2分を取る必要があります。
2. タイと次のように直接クリップ以下カニューレに4-0絹縫合糸の安全な大動脈を使用して、灌流を開始します。タイは金属大動脈カニューレの周りにもあるので、締め付けの際の大動脈がオフに縛られないことを確認結び目。 1タイがしっかりと配置されると、クリップを削除します。
3. 大動脈から来ることができる任意の容器の枝の下にオフに結びつけるために確認することカニューレにしっかりと大動脈を固定す​​るために、追加の絹縫合糸を使用してください。これらは、多くの場合、灌流液漏れや大動脈から撮影して発見することができます。
   注：灌流の初期段階の間、血液が心臓から洗浄されるべきであり、心臓全体はソフトなピンクの色を表示する必要があります。洗い流していない暗い変色は、空気塞栓や血栓や心臓への可能性虚血性領域が使用するべきではありません示しています。

4.2）の確立潅流とLVP測定

1. ゆっくり灌流圧を増加させ、灌流圧が70 mmHgのに達するまで、ポンプ速度を増加させます。
   注：マウスの​​灌流のための標準的な灌流圧は70〜90 mmHgであることができるが、実験内の動物から動物に一定に維持されなければなりません。
2. 残りの組織（肺、甲状腺などを清掃してください）それはまだ心に取り付けることができます。左心室に開口部を作成するために、左心房を切断するはさみを使用してください。
3. ホルダーにバルーンを配置し、収縮させます。直接左心室に開口部の上に、大動脈カニューレの近くにバルーンカニューレを配置します。大動脈が裂けないような場所に心を保持しながら、慎重に左心室に下向きにバルーンを挿入します。
4. それが配置されるとゆっくりとLVEDPは〜8 mmHgのに到達するまで、バルーンを膨張させるために開始します。それは流出物の温度を測定するように心の底に対して温度プローブを配置します。

4.3）基礎測定

1. 水ジャケット灌流チャンバーに心を封印。この間継続的にKHBで心臓を灌流し、温度が上昇し続けることを確認してください。温度を監視し、約〜37ºCに達するまで、それに応じて水浴を調整します。
   注：監視temperat温度は、心臓から心臓に変化させることができる冠状動脈の流れのように、その後、灌流の初期段階でのUREは非常に重要です。流出液灌流液の温度は、心臓の頂点に配置された温度プローブを介して所望の心筋の温度のために監視されます。また、他のランゲンドルフ灌流プロトコールと比較して、心臓を灌流または停止の間CPまたはKHB中に浸漬されていない、これは主に迅速に温度を調整するだけでなく、拡散することなく、効率的なCPの送達を提供するために行われます。
2. 連続灌流圧、左心室圧（LVPバルーンに取り付けられた圧力変換器）、温度、および電気生理学的パラメータ（EKG、そう装備されている場合、MAP）を含む適切なセンサに接続されたデータ収集システムを使用して、機能的測定を記録し始める（添付ファイルは次のようになりますメーカーによれば、個々のセンサやデータ収集システム）に固有。流出物KHBは、少なくとも15〜37ºCに達すると分であり、心臓機能パラメータは、ベースライン測定のための時間に注意して、安定しています。
   注：包含/除外基準は、それぞれの心臓に適用されます。ベースラインでの<60 mmHgでのLVDPは、分析から削除する必要が心を示しています。さらに、ベースラインで潅流圧を維持するために冠血流> 4.5ミリリットル/分、またはできない可能性が高い漏れや破れ大動脈を示しています。また（ すなわち、非常に不整脈LVEDPを、増加）を目視確認した（ すなわち、血餅）または心機能の虚血関連削減を発揮することができる明確な虚血領域を有する任意の心臓を分析から削除されます。
3. 1分間のメスシリンダー内の冠状動脈流出物の収集を経て冠動脈の流れを測定します。室を閉じ、温度や機能がベースライン値に戻すことができます。あるいは、圧力リリーフ回路の後に配置フロープローブを介して灌流ラインに連続的に冠状動脈の流れを測定します。

"> 5。開始心停止逮捕

1. 別のリザーバに低温心緩衝液100mlを置き、。心停止リザーバーにKHBリザーバカニューレを転送します。
2. 温水浴からの水ジャケット付きハウジングと灌流温暖化回路を切断し、迅速に切断し、チューブ使用して冷蔵サーキュレータに接続します。心と灌流液の急激な温度変化を可能にするために別個の加熱と冷却サーキュレータを使用してください。
3. スイッチの間にチューブ内に導入されます気泡に従い、それは孤立した心臓の近くに到達すると、心筋保護のためのタイミングを開始します。 2分間の心停止を提供します。初回投与後にポンプを停止します。拡張期に心臓を停止し、所望のCP温度に近くなるように確認してください。
   注：十分な気泡トラップは、中心部に空気塞栓を回避するために必要です。あるいは、ストップコックによって切り替えの両方貯水池のための送達システムを容易に構築することができる、しかし、我々は従う見つけます実験間で潜在的に異なるポンプ速度を与えられた貯水池の間カニューレを交換する際に導入された小さな気泡、タイミングCP配信する簡単な方法をる（ など 、マウス/ラットに起因する、すなわち 、灌流圧、フィルタ抵抗、。）
4. 〜20ºCで2時間心臓麻痺で心を保ちます。別の用量が投与されるように、CP中のすべての半時間は1分間背面にポンプの電源を入れます。
   注：CPの断続的な用量組織の壊死のない心臓の機能障害で30分毎の結果。 CP（ すなわち、> 45分）の投与間の長い期間は、壊死および虚血性拘縮をもたらすことができるし、保護されていない虚血に関連した壊死性傷害のモデルのためのより適切であろう。

6.再灌流

1. CPの終わりには、酸素化KHBに戻すリザーバカニューレを転送します。加熱サーキュレータに温度制御回路を接続し、ポンプを回しますには、再灌流を開始します。心臓麻痺を洗い流す。この時点で、温度上昇を観察し、心臓は、再灌流の2〜4分後に再び暴行を開始します。心臓が開始されると、心拍が遅く、しばしば不整脈です。
   注：通常、多くの場合、純粋な虚血モデルにおける特徴である拡張期LVP（ すなわち、≤10mmHgの上昇）に大きな上昇がありません。不整脈は、再灌流によく持続すること、時折心臓が除細動する必要があります。これは、心臓の基部と頂部に配置された高電圧（〜10-50 V）と電極の刺激セットを使用して達成することができます。
2. 心臓を30分間再灌流することを可能にし、この期間中に、必要に応じて冠血流測定を行います。 30〜60秒間、メスシリンダーで流出物を収集することにより、冠動脈の流れを測定します。

7.組織の収集

1. バルーンを収縮し、左心室から削除します。オフの心を取りますカニューレ、それを量ります。最初の実験では、心臓の少なくとも一つの横断スライスが取られるべきであり、TTCは、心臓がどの壊死損傷がないことを確実にするために壊死を評価するために染色しました。
2. 残りまたは心臓全体が急速に液体窒素中に配置することによって凍結されるべきであるなど顕微鏡研究、ウェット/乾燥重量のために心臓のスライスを収集します。 -80ºCの冷凍庫で凍結された心を保管してください。
   注：高エネルギーリン酸化合物（ すなわち、ATP、クレアチンリン酸）の測定のために、心は直ちに凍結されるべきです。

結果

図1は、1つのマウスの実験からの典型的な結果を示します。 LVP（赤線）、DP / DT（緑色の線）、および温度（パープルライン）continusouly〜3時間にわたって記録しました。ベースライン測定、B、C、D、E - - 心臓麻痺溶液の送達、F - 再灌流の開始、G、H、I、J - 再灌流の間cornary流量の測定手紙示します。ベースラインと比較して、再灌流時の注意、落ち込んLVDPとDP / DT。 図1...

ディスカッション

前のプロトコルの詳細方法は心停止の逮捕に関連したグローバルな虚血心筋見事な二次を評価しました。我々の手では、このプロトコルは、心機能の〜約40％の減少を生じさせる（LVDP、+/- DP / dt）は30分後に再潅流時点での心拍数の最小の変化を有します。心臓が再潅流および再加温しているように、心機能のすべてのパラメータは、20〜30分の間、安定化する前に大幅に減少し、心拍数との?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures