심정지 체포와 심근 놀라운 연합의 쥐 절연 심장 모델

요약

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

초록

다음 프로토콜은 장애 심장 기능이나 심근 멋진 다음 적당한 허혈성 모욕을 평가하기 위해 사용이다. 이 기술은 심정지 체포와 심폐 바이 패스, 오프 펌프 관상 동맥 우회술, 이식, 협심증, 짧은 허혈 등으로 심장 수술 등 다양한 임상 적 현상과 관련된 허혈 손상을 모델링하는 데 유용합니다. 이 프로토콜은 심근 수축 기능의 측정에 초점을 맞추고 설치류 마음 저체온 hyperkalemic 심정지 체포 및 재관류 모델에 대한 일반적인 방법을 제시한다. 간단히, 마우스 마음, 랑겐 돌프 모드에서 관류하는 심 실내 풍선 계측 및 기준 심장 기능 매개 변수가 기록됩니다. 안정화 후, 심장 이완기 체포를 시작하는 심장 보호 저체온 심정지 액 주입 브리핑을 다음 될 수 있습니다. 심정지는 2 시간에 걸쳐 간헐적으로 전달된다. 심장 후 재관류 및 warme된다정상 체온 온도와 심근 기능의 회복에 d를 모니터링합니다. 설치류에서 총 심근 조직 손상이없는 안정적인 우울 심장 수축 기능이 프로토콜 결과의 사용.

서문

멋진 심근 허혈 또는 ​​심장 보호의 ^1,2,3,4,5와 허혈성 모욕의 장기간의 짧은 기간 다음 적절한 혈류의 회복에도 불구하고 가역적 인 감소 수축 활동으로 정의된다. 제시된 방법은 구체적으로 수축 기능의 가역적 인 손상을 초래할 수 임상 적으로 허혈성 모욕을 모델링하는 데 사용됩니다 (즉, 심장 수술은 심정지 체포, 허혈, 협심증 등의 짧은 기간을 이용과 관련된 허혈성 모욕). 심한 허혈 연구 (심근 경색, 괴사)와 대조적으로,이 프로토콜은 조직 손상, 개조, 및 세포 죽음없이 심근 기능 회복 및 심장 보호를 평가하기 위해 개발되었다. 종이의 대부분은 저체온증과 간헐적 심정지 전달을 사용하여 심장 수술과 유사한 성분을 가진 표준 심정지 체포 프로토콜에 대해 설명합니다.

심근 PROT심장 수술의 대부분 동안 ection은 심정지 및 심폐 바이 패스에 의존한다. 심정지 (CP) 솔루션과 전략 (혈액, 결정 성, 감기, 따뜻한 등) 다양하지만 가장 일반적인 요소는 1) 고 칼륨 혈증 및 / 또는하여 심근 수축에 의한 에너지 이용을 제한, 이완기의 마음을 체포하기 위해 다른 전략이다 2) 저체온증은 신진 대사를 느리게하고 체포하면서 ATP 및 기타 에너지 매장량을 유지하는 데 도움합니다. 현재 심정지 솔루션 그렇지 않으면 치명적인 증명 허혈성 모욕에 대한 심장 보호 기능을 제공합니다. 그러나, 수술 허혈성 모욕하는 동안 심장 보호 전략은 완벽하지 않고, 그 결과 가벼운 허혈 손상은 적절한 혈액의 흐름에도 불구하고 가역 심장 수축 기능 부전이 발생할 수 있습니다 (멋진 심근), 산성 증, 심근 손상, 감소 관상 동맥 관류와 연축을 포함하여 혈관 효과.

이 프로토콜 다르다짧은 허혈 또는 심정지 체포와 관련된 허혈성 모욕 다음 손상된 심장 기능이 발생할 수 있습니다 심근 경색하고 온화한 허혈성 모욕을 평가하는 심각한 허혈을 평가하는 표준 고립 심장 허혈 모델에서. ^{(- 8} 랑겐 돌프 관류 기술과 나는에 검토를 위해 / R 연구는 ⁶ 참조). 일반 지침 및 마우스 고립 관류 마음과 관련된 실험 매개 변수에 대한 철저한 분석을 위해 서덜랜드 전자 T는 알을 참조하십시오. 2003 여기에 제시된 기술은 안정적으로 마우스 마음에 멋진 유도하기 위해 필요한 장비, 시약, 단계, 전략 및 팁을 자세히 ^9. 약간의 수정은 쥐 기술을 적용하는 것이 필요하다.

간단히 격리 된 마우스 마음 랑겐 돌프는 hyperkalemic hypotherm의 전달을 통해 추운 보호 심장 마비로, 생리적 크렙스 - Henseleit 버퍼 ​​(KHB)와 약 30 분간 관류 준수IC 심정지 솔루션입니다. 체포 후, 심장 기능 회복은 재가 및 KHB와 마음의 재관류 동안 모니터링됩니다. 심장 수축 기능의 회복 정도의 변화는 심장 보호 에이전트 및 다른 심장 보호 전략을 평가하기 위해 평가 될 수있다.

프로토콜

참고 : 모든 절차가 수명 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 관리 및 실험 동물 ^(10)의 사용을위한 국가 연구위원회 가이드에 따라 모든 동물과 절차에 의해 승인되었다.

회로 모니터링 1. 풍선 제작 및 좌심실 압력

1. , 교반 막대와 비커에서. 밀러 등에 따라 ¹¹ LV 풍선을 구축 핫 플레이트에 9.5 ml의 증류수, 빛 옥수수 시럽의 14.2 ml의 자당의 33.8 g을 열을 혼합, 설탕 용해 될 때까지 혼합 . 그것은 약 150 ºC에 도달 할 때까지 가열을 계속 용액.
   참고 : 수많은 방법은 콘돔 팁과 집착 필름 건설 ^9,12-의 수정을 포함 LV 풍선을 구성하기 위해 존재한다. 그러나 우리는 집착 필름 풍선의 장점은 적절한 FREQUEN에 대한 이전의 특성을 포함, 위의 방법은 누출이없는 풍선을 구성 비교적 쉽게 찾을CY - 반응 관계 ^(9).
2. 길이 조각으로 약 5 센티미터 마른 스파게티 가닥 브레이크와 설탕 용액에 약 1cm 깊이 각 부분의 한 쪽을 찍어 천천히 제거합니다.
3. 스티로폼 블록으로 파스타 가닥의 건조 끝을 놓고 설탕 믹스가 떨어지고과 눈물 모양의 금형을 형성 그래서 일시 중지합니다. 금형 견고 있도록 데시 케이 터에서 O / N를 남겨주세요.
4. 다음 날, 실리콘 분산 젤로 금형을 찍어. 2 시간 동안 또는 건조 될 때까지 AA 37 ºC 오븐에서 다시 스티로폼 블록과 장소에 파스타 가닥을 놓습니다. 한 번 더 그래서 실리콘의 두 개의 층이 적용되는이 단계를 반복합니다.
5. 일단 건조, 몇 시간 동안 물에 장소는 금형에서 풍선의 제거에 도움. 0.02 % 아 지드 화 나트륨 용액에 보관 풍선.
6. 뭉툭한 끝을 만드는 절삭 바늘과 바늘에 노치를 배치함으로써 정의 풍선 뉼러를 생성하도록 설정 23 G 채혈을 사용한다.
7. 트랜스 압력으로 튜브를 연결합니다듀서 및 튜브 및 정맥을 유지하면서 물로 완전히 시스템에 들어가는 공기를 방지하기 위해 잠긴. 캐 뉼러에 물이 가득 된 풍선을 놓고 정맥에 묶어 2-0 실크 봉합사를 사용합니다. 압력을 유지하는 능력에 의해 테스트 풍선 (적어도 1 시간 동안 ~ 100 mmHg로)

고립 된 심장 관류 시스템 2. 준비

1. 우선, 세척 및 시스템을 따뜻하게. 랑겐 돌프 장치에 연결되어 37 ºC 따뜻한 물로 목욕 순환 켜고 증류수로 버퍼 탱크를 채우십시오. 장치에 흐르는 튜브 시스템을 세척하는 펌프를 켜 새로운 유리 섬유 필터를 연결합니다. 준비 시간 동안, 온도 프로브를 사용하여 블록을 Langendorff로부터 토출 물의 온도를 모니터링하는 것이 수조 정확히 설정되어 있는지 확인하기 위해. 또한, 냉각 순환 펌프를 켜고 마음의 심​​정지 체포시 사용되는 20 ºC로 설정.
2. 나는N 한편 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 1 심정지 액의 L (110 mM의 염화나트륨, 16 mM의 KCl을 16 mM의의 MgCl _2, 1.5 mM의 염화칼슘 _2, 10 mM의 _수 NaHCO3) 및 필터를 준비합니다. 또한 KHB (118 mM의 염화나트륨, 4.8 mM의 KCl을, 1.2mm의 KH ₂ PO _4, 1.7 mM의 _MgSO4로, 2 mM의 나트륨 피루 베이트, 6 mM의 덱 스트로스, 2 L를 준비 24.9 mM의 _NaHCO3를 (예비 통기 CO ₂₎ 1.4 mM의 염화칼슘 ₂ (마지막 추가). 일단 깔때기를 프릿 5 μm의 유리를 사용하여 플라스크에 여과하여 침전물을 제거합니다. 얼음에 작은 접시에 몇 가지 수술과 분리시 사용되는 장소, 용해.
3. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 95 %, _O2 / 5 % CO ₂ 관류 (KHB)를 네이트. KHB와 관류 랑겐 돌프 시스템은 시스템에서 남아있는 물을 제거하고 저수지를 버퍼링합니다. 마우스를 들어, ~ 2.0 ml / 분에 초기 펌프 속도를 설정합니다. 관류 정맥 근처 2-0과 4-0 실크 봉합사를 놓습니다. 튜브 및 장치는 재치 채워질 때까지 펌프를 실행시간 관류와 거품 strup을 보장은 관류 액으로 가득합니다.
   참고 :이 좋습니다 관류하고 안정적​​인 기능의 오랜 기간 동안은 심장에 혈전을 형성 할 수있는 침전물을 수집하기 위해 관류 회로에서 인라인 유리 섬유 필터 (~ 1 ㎛)를 설치

3. 마우스 수술

3.1) 마우스 마취 및 취급

1. 80 ㎎ / ㎏ 케타민 5 ㎎ / ㎖ 자일 라진 혼합물의 마취 용량 주사기를 준비하고, 0.2 ml의 볼륨을 가지고 멸균 0.9 % 식염수를 추가합니다. 헤파린 IP (1,000 U / ㎖ 용액 50 μL)을 주입한다.
2. 운반 용기 (~ 10 ~ 20 분)에 다시 마우스를 놓고 헤파린이 적용됩니다로 의식을 잃을 때까지 기다립니다. 주기적으로 통증이 반사를 모니터링하는 발가락 핀치을한다.

3.2) 심장을 제거

1. 마우스가 완전히 의식이 있고, 발가락 핀치에 응답 핀 또는 25 G를 사용하여 적절한 운영 테이블에 고정하지 않는되면 사지를 통해 주사기 팁. 심장을 노출하는 개흉술을 수행합니다. 바로 흉골 아래에 작은 구멍을 잘라 다이어프램을 피하는 마우스의 측면에 상처를 확장 할 수 있습니다.
2. 빠르게 다이어프램을 절단 한 후 빠르게 흉곽의 측면을 잘라. 흉강을 노출 조개 껍질처럼 흉곽를 다시 뒤집습니다. 부드럽게, 마음의 보류을 아래에 가위를 배치하고 마음을 제거합니다.
   참고 :이 흉강에 노출 폐 비 기능적되면 신속하게 마음을 제거하는 것이 필수적이다.

3.3) 마음을 청소

1. 접시 포함 차가운 얼음 KHB에 마음을 놓고 부착 된 폐 조직의 큰 조각을 잘라. 마음을 픽업하여 대동맥의 위치를​​ 집게를 사용합니다. 조심스럽게 마음을 잡아 당겼다이 대동맥의 오픈 엔드해야로서, 표시되는 혈액을 찾습니다. 대동맥의 열린 끝으로 마음을 잡고 잘 팁 핀셋을 사용합니다.

전자 "> 4. 풍선을, 심장을 장착 관류를 시작하고, 배치

4.1) 설치 및 심장 Cannulating

1. 랑겐 돌프 장치에 마음을 운반하기 전에, 관류 압력이 낮다는 것을 보장 펌프 (~ 20 mmHg로)를 켭니다. 바로 정맥에서 대동맥으로 마음을 잡고. 좋은 팁 핀셋의 또 다른 세트를 사용하여 조심스럽게 대동맥을 열고 캐 뉼러에 마음을 밀어 넣습니다. 핀셋 한 세트로 제자리에 고정 후 일시적으로 정맥에 고정 부드러운 예리 클립을 사용합니다.
   참고 : 신속하게 관류 정맥에 마음을 장착 좋은 준비를위한 중요합니다. 경험을 바탕으로, 마음을 장착 할 때까지 흉강을 여는의 절차는 1 ~ 2 분 정도 소요됩니다.
2. 직접 클립 아래의 정맥에 4-0 실크 봉합사 보안 대동맥을 사용하여 묶어 다음과 같이 관류를 시작합니다. 조일 때 대동맥의 전원 연결되지 않도록 넥타이, 금속 대동맥 캐뉼라 주위에도 확인매듭. 한 넥타이가 완전히 배치되면, 클립을 제거합니다.
3. 대동맥 떨어져 올 수있는 용기를 가지 이하로 묶을 수 확인하는 캐 뉼러에 단단히 대동맥을 고정하기 위해 추가 실크 봉합사를 사용합니다. 이들은 종종 관류 누출 또는 대동맥으로부터 총격에 의해 발견 될 수있다.
   참고 : 관류의 초기 단계 동안 혈액은 심장에서 세척해야하며, 전체 심장 부드러운 핑크 색상을 표시해야합니다. 세척하지 않는 어둠의 색소 침착은 사용할 수 없습니다 때문에 공기 색전이나 혈전과 심장 허혈 영역 가능성을 나타냅니다.

4.2) 구축 관류 및 LVP 측정

1. 천천히 관류 압을 증가시키고 관류 압력이 70 mmHg로 도달 할 때까지 펌프 속도를 증가시킨다.
   주 : 마우스 관류 표준 관류 압력은 70-90 mmHg로 할 수 있지만, 실험 동물에게 동물 내에서 일정하게 유지되어야한다.
2. 나머지 조직 (폐를 청소, 갑상선 등)는 여전히 그 중심부에 부착 될 수있다. 좌심실로 개구를 생성하기 위해 좌측 심방를 봉쇄하는 가위를 사용한다.
3. 홀더에 풍선을 넣고 수축. 직접 좌심실로 입구에, 대동맥 정맥 근처 풍선 캐 뉼러를 놓습니다. 대동맥이 찢어지지 않도록 장소에 마음을 잡고 조심스럽게 좌심실로 하향 풍선을 삽입합니다.
4. 제자리에 있으면 천천히 LVEDP가 도달 할 때까지 ~ 8 mmHg로를 풍선을 팽창하기 시작합니다. 이 폐수의 온도를 측정하도록 마음의 바닥에 온도 프로브를 놓습니다.

4.3) 기저 측정

1. 물 재킷 관류 실에 마음을 밀봉합니다. 이 시간 동안 지속적으로 KHB과 마음을 관류하고, 온도가 지속적으로 증가하고 있음을 확인합니다. 온도를 모니터링하고 약 37 ~ ºC에 도달 할 때까지 따라 수조를 조정한다.
   참고 : 모니터링 temperat온도가 마음에서 마음으로 변화 할 수있다 관상 동맥 흐름으로 그 후 관류의 초기 단계에서 URE 중요합니다. 유출 물 관류 액의 온도가 중심부의 정점에 배치 된 온도 센서를 통해 원하는 심근 온도 모니터링된다. 또한, 다른 랑겐 돌프 관류 프로토콜에 비해, 심장이 관류 또는 정지 중에 CP 또는 KHB에 빠져들되지 않으며,이는 주로 빠르게 온도를 조절뿐만 아니라 확산없이 효율적인 CP 전달을 제공하기위한 것입니다.
2. 연속적으로 관류 압력, 좌심실 압력 (LVP 풍선에 부착 압력 변환기), 온도, 전기 생리 학적 매개 변수 (EKG, 장착되어있는 경우 MAP)를 포함한 적절한 센서에 연결된 데이터 수집 시스템을 이용하여 기능의 측정을 기록하기 시작한다 (첨부가 될 것 제조사에 따른 개별 센서 및 데이터 수집 시스템)에 고유. 유출 KHB 적어도 15 ~ 37 ºC에 도달하면 최소 및 심장 기능의 파라미터가 안정적이며, 기준선 측정을위한 시간을 참고.
   참고 : 포함될 / 제외 기준은 각각의 심장에 적용됩니다. 베이스 라인에서 60 mmHg로 <의 LVDP 분석에서 제거되어야 마음을 나타냅니다. 또한,베이스 라인에서의 관류 압을 유지하기 위해 관상 동맥 흐름> 4.5 ml / 분, 또는 무능력 가능성이 누출 또는 찢어진 대동맥을 나타냅니다. 또한 심장 기능에 (즉, 매우 부정맥 LVEDP를 증가) 시각적으로 확인할 수있는 명확한 허혈 영역 (즉, 혈전) 또는 전시 허혈 관련 감축을 가지고있는 마음은 분석에서 제거됩니다.
3. 1 분 눈금 실린더에 관상 폐기물의 수집을 통해 관상 동맥의 흐름을 측정합니다. 챔버를 닫고 온도를 허용하고 기본 값으로 반환하는 기능을 수행합니다. 또는 압력 릴리프 회로 뒤에 위치 흐름 프로브를 통해 관류 라인에 지속적으로 관상 동맥의 흐름을 측정한다.

"> 5.에서 시작 심정지 체포

1. 다른 저수지에 차가운 심정지 버퍼의 100 ㎖를 넣고. 심정지 저수지에 KHB 저수지 정맥을 전송합니다.
2. 따뜻한 물을 욕조에서 물 재킷 하우징과 관류 온난화 회로를 분리하고 빠른 분리를 튜브를 사용하여 냉각 순환 장치에 연결합니다. 마음과 관류의 급격한 온도 변화를 할 수 있도록 별도의 가열 및 냉각 순환 장치를 사용합니다.
3. 스위치 동안 튜브에 도입됩니다 기포를 수행하고 고립 된 심장 근처에 도달하면 심정지에 대한 타이밍을 시작합니다. 2 분 동안 심정지를 제공합니다. 초기 투여 후 펌프를 중지합니다. 이완기의 마음을 체포하고 원하는 CP 온도에 가까운 것으로 확인합니다.
   주 : 충분한 거품 트랩 중심에 공기 색전을 방지 할 필요가있다. 대안 콕 의해 스위칭 모두 공기통위한 전달 시스템이 쉽게 구성 될 수 있지만, 우리는 다음과 발견저수지 사이의 정맥을 교환 할 때 도입되는 작은 기포, 실험 사이에 잠재적으로 다른 펌프 속도 주어진 타이밍 CP 전달의 쉬운 방법 보내고 (때문에 마우스 / 쥐, 관류 압력, 필터 저항 등으로 즉,.)
4. ~ 20 ºC에서 2 시간 동안 심정지의 마음을 유지합니다. 다른 용량 투여되도록 CP 동안 매 30 분마다 1 분 동안 다시 펌프를 켜십시오.
   참고 : 조직의 괴사없이 CP 심장의 기능 장애에서 30 분마다 결과의 간헐적 투여. CP (즉,> 45 분)의 용량 사이의 긴 기간이 괴사 및 허혈성 구축 될 수 있으며, 보호되지 않은 허혈과 관련된 괴사 부상의 모델이 더 적합 할 것이다.

6. 재관류

1. CP의 마지막 산소화 KHB 다시 리저버 뉼러 옮긴다. 가열 순환기로 온도 제어 회로를 연결하고, 펌프를 켜고에 재관류를 시작합니다. 심정지가 밖으로 세척이 시점에서, 온도 상승을 관찰하고 심장 재관류 2-4 분 후에 다시 박동을 시작합니다. 심장이 시작되면 심장 박동이 느리고 자주 부정맥이다.
   참고 : 일반적으로 자주 순수한 허혈 모델의 특징이다 이완기 LVP (즉, ≤10 mmHg로 상승)에 큰 상승이 없습니다. 부정맥은 재관류로 잘 유지하고 때때로 심장 제세동해야합니다. 이것은 심장의베이스와 정점에 배치 된 더 높은 전압 (~ 10-50 V) 및 전극에 자극 세트의 사용으로 달성 될 수있다.
2. 심장을 30 분 동안 재관류하도록 허용하고,이 기간에 필요한 혈류 측정을 수행. 30 ~ 60 초 동안 눈금 실린더로 유출 물을 수집하여 관상 동맥의 흐름을 측정합니다.

7. 조직을 수집

1. 풍선을 수축 및 좌심실에서 제거합니다. 오프 마음을 가지고정맥과 무게. 초기 실험에서, 마음의 적어도 하나의 가로 슬라이스 촬영 및 TTC는 마음이 어떤 괴사 부상이 없도록 괴사를 평가하기 위해 염색한다.
2. 등 나머지 또는 온 마음 현미경 연구, 습식 / 건식 무게, 심장 조각을 수집 빠르게 액체 질소에 넣어 냉동한다. -80 ºC 냉동고에 보관 냉동 마음입니다.
   참고 : 고 에너지 인산 화합물 (즉, ATP, 크레아틴 인산)의 측정을 위해, 마음은 즉시 냉동해야합니다.

결과

그림 1은 하나의 마우스 실험에서 전형적인 결과를 제시한다. LVP (레드 라인), DP / DT (녹색 선), 온도 (보라색 라인) continusouly ~ 3 시간에 걸쳐 기록되었다. 글자를 표시 - 기준선 측정, B, C, D, E - 재관류, g의 시작, H, I, J - - 재관류 cornary 유량 측정 심정지 액, (F)의 전달. 참고, 우울 LVDP 및 기준에 비해 재관류시 DP는 / DT는.도 1b는 이상 기록 ~ 2 초에서 데이터를 포함한다. 참고 L...

토론

위의 프로토콜 세부 방법은 심정지 체포와 관련된 글로벌 허혈 심근 멋진 차를 알아보고자 하였다. 우리의 손에이 프로토콜은 심장 기능에 ~ 대략 40 % 감소를 생산 (LVDP, + DP / DT) 30 분 후 재관류 시점에서 심장 박동에 최소한의 변화. 심장 재관류과의 재탕되면서 심장 기능의 모든 매개 변수 최소 20에서 30 사이의 안정화 전에 크게 감소 심박수와 초기 시점에서 감소된다. 관상 동맥 흐름은 30 분 재?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures