Мышиные Изолированные Сердце Модель инфаркта Потрясающие, связанных с кардиоплегического ареста

Резюме

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Аннотация

Следующий протокол является полезной для оценки нарушение функции сердца или инфаркта потрясающий следующие умеренные ишемические оскорбления. Метод полезен для моделирования ишемического повреждения, связанного с многочисленными клинически значимых явления в том числе кардиохирургии с кардиоплегического ареста и кровообращения, совсем насоса АКШ, пересадки, стенокардии, ишемии, краткого и т.д.. Протокол представляет собой общий метод для моделирования гипотермический hyperkalemic кардиоплегический арест и реперфузии в сердцах грызунов, посвященных измерения сократительной функции миокарда. Вкратце, сердце мыши перфузии в Langendorff режиме, приборами с внутрижелудочкового баллона, и исходные сердечные функциональные параметры записываются. После стабилизации, сердце то с учетом кратко настой кардиозащитного гипотермической решения кардиоплегии инициировать диастолического арест. Кардиоплегии поставляется с перерывами в течение 2 ч. Сердце затем реперфузии и Warmed, чтобы нормотермических температурах и восстановления функции миокарда контролируется. Использование этого протокола результатов в надежной депрессии сердечной сократительной функции свободных от валового повреждения ткани миокарда у грызунов.

Введение

Инфаркт потрясающий определяется как обратимого снижения сократительной активности, несмотря на восстановление адекватного кровотока после краткого периода ишемии или длительных периодов ишемических инсультов с Кардиопротекция ^1,2,3,4,5. Метод, представленный специально используется для моделирования клинически значимых ишемических оскорбления, которые могут привести к обратимых нарушений в сократительной функции (то есть, ишемические инсульты, связанные с использованием кардиохирургии кардиоплегический задержании, короткие периоды ишемии, стенокардии и т.д.). В отличие от тяжелых исследований ишемии (инфаркта миокарда, некроз) Этот протокол был разработан, чтобы оценить миокарда и функциональное восстановление кардиопротекцию без повреждения ткани, ремоделирование, и гибели клеток. Большинство бумаги обсуждает стандартный протокол кардиоплегический сердца с элементов, аналогичных сердечной хирургии с использованием гипотермии и прерывистый доставки кардиоплегии.

Инфаркт прототражения в течение большей части операции на сердце зависит от кардиоплегии и кровообращения. Хотя кардиоплегии (CP) решения и стратегии широко варьироваться (кровь, кристаллоидов, холодный, теплый и т.д.) наиболее общие элементы: 1) гиперкалиемия и / или другие стратегии арестовать сердце в диастолу, тем самым ограничивая использование энергии в результате сокращения миокарда, и 2) гипотермия, чтобы замедлить метаболизм и помогают поддерживать АТФ и другие запасы энергии в то время как арестованы. Современные решения для кардиоплегии обеспечивают защиту сердца от ишемических инсультов, которые могли бы оказаться смертельным. Тем не менее, кардиопротективные стратегии во время хирургических ишемических инсультов не совершенны, и результирующая мягкий ишемического повреждения могут привести к обратимой дисфункции сердечной сократительной несмотря на достаточное кровотока (инфаркт потрясающий), ацидоз, повреждение кардиомиоцитов, и сосудистые эффекты, включая снижение коронарной перфузии и разжижающие.

Этот протокол отличаетсяот стандартных моделей изолированных ишемической болезни сердца, оценивающих инфаркт миокарда и тяжелой ишемии в том, что он оценивает умеренные ишемические оскорбления, которое может привести к нарушению сердечной функции после краткого ишемии или ишемических инсультов, связанных с кардиоплегической сердца. (Для просмотра на Langendorff методов перфузии и I / R исследования см ^{6 - 8).} Для общих принципов и тщательного анализа экспериментальных параметров, связанных с мышью, изолированных перфузии сердца видеть Сазерленд электронной т др., 2003 ⁹ техника представлена ​​здесь подробности необходимым оборудованием, реагентами, шаги, стратегии и советы, чтобы надежно вызвать потрясающий в мыши сердца. Незначительные изменения необходимы, чтобы применить технику крыс.

Кратко изолированном сердце мыши имеют Лангендорфу перфузии в течение примерно 30 мин с физиологическим Кребса-буфера (КАХАБ), а затем холодной защищенной остановки сердца через доставку hyperkalemic hypothermIC кардиоплегию решение. После ареста, сердечная функциональное восстановление контролируется в процессе согревания и реперфузии сердца с КАХАБ. Изменения в степени восстановления функции сердечной мышцы могут быть оценены для оценки кардиопротективные агентов и различных стратегий Кардиопротекция.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были одобрены Продолжительность жизни учреждениях и использование комитета животных и всех животных и процедур в соответствии с национальным руководстве исследования Совета по уходу и использованию лабораторных животных ¹⁰ по.

1. шар Изготовление и левого желудочка контроля давления Circuit

1. Построить LV шары в соответствии с Miller и др. ^11, в химическом стакане с мешалкой, смешивают 9,5 мл дистиллированной воды, 14,2 мл светлого кукурузного сиропа и 33,8 г сахарозы, и тепло на горячей плите, перемешать до полного растворения сахара , Продолжить решение отопления до тех пор, пока не достигнет примерно 150 ºC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многочисленные методы существуют, чтобы построить LV шары включая модификации презервативов советы и цепляются строительства пленки ^9,12. Мы находим выше способ, чтобы быть относительно легко построить герметичное шары, однако преимущество пленкой шаров включает в себя предыдущий характеристику для соответствующего частотамиотношения CY-ответ ^9.
2. Перерыв сухие спагетти нити на куски около 5 см в длину и опустите одну сторону каждого куска около 1 см глубоко в раствор сахара и медленно удалить.
3. Поместите сухой конец нити макаронных изделий в блоке пенопласта и приостановить так сахара смесь стекает и образует форму слезинки формы. Оставить O / N в эксикаторе так плесень затвердевает.
4. На следующий день, окуните формочки в силиконовой дисперсии геля. Поместите макароны пряди назад в полистирола пеноблока и место в аа 37 ºC духовку на 2 часа или до сухой. Повторите этот шаг еще раз, чтобы два слоя силикона применяются.
5. После высыхания, место в воде в течение нескольких часов, чтобы помочь в удалении от аэростата из формы. Храните шары в 0,02% растворе азида натрия.
6. Используйте 23 г сбора крови набор производить индивидуальные шар канюли путем разрезания иглу, чтобы создать тупой кончик и размещение вырезами в иглу.
7. Подключите шланг к давлению трансзователь и промойте водой, сохраняя трубки и канюли полностью погружен, чтобы предотвратить попадание воздуха в систему. Поместите шар, который был заполнен водой на канюли и использовать 2-0 шелковые швы, чтобы связать на канюли. Тест на воздушном шаре по способности поддерживать давление (~ 100 мм рт.ст. в течение не менее 1 часа)

2. Подготовка перфузии изолированного сердца системе

1. Первоначально, вымыть и согреть системы. Включите 37 ºC теплой водой термостаты, что было связано с устройством Лангендорфа, и заполнить буфер резервуар с дистиллированной водой. Подключите новый стекловолокна фильтр трубки течет в аппарат и включить насос для промывки системы. Во время подготовительной, контролировать температуру воды исключен из блока Лангендорфа помощью датчика температуры, чтобы гарантировать, что водяной бани устанавливается точно. Кроме того, включение в охлажденном циркуляционным насосом и установлен на 20 ° С, которая будет использоваться в процессе кардиоплегической сердца сердца.
2. Яп тем временем подготовить следующие решения. Подготовка 1 л раствора для кардиоплегии (110 мм NaCl, 16 мм KCl, 16 мм MgCl _2, 1,5 мМ CaCl _2, 10 мМ NaHCO ₃₎ и фильтр. Кроме того, подготовить 2 л КАХАБ (118 мм NaCl, KCl 4,8 мм, 1,2 мм KH ₂ PO _4, 1,7 мМ MgSO _4, 2 мМ Na-пируват, 6 мМ декстрозы, 24,9 мМ NaHCO ₃ (предварительно продувают СО ₂₎ , 1,4 мМ CaCl ₂ (добавляется в прошлом). После растворения удалить осадок путем фильтрации в колбу с помощью 5 мкм стекл нный фильтр. Поместите некоторые в небольшую антенну на льду, которые будут использоваться во время операции и изоляции.
3. Кислородом перфузат (КАХАБ) с 95% O _2/5% CO ₂ в течение по крайней мере 30 мин до использования. Система Заливать Лангендорфа с КАХАБ, чтобы удалить оставшуюся воду из системы и буфер резервуар. Для мышей, установить начальную скорость насоса до ~ 2,0 мл / мин. Поместите 2-0 и 4-0 шелковые швы возле перфузии канюли. Запустите насос, пока трубы и аппарат не заполнены остроумиеч Перфузат и обеспечить пузырь strup наполнен перфузат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительных периодов перфузии и стабильного функционирования настоятельно рекомендуется установить фильтр из стекловолокна в он-лайн (~ 1 мкм) в цепи перфузии собирать любые осадки, которые могут образовывать сгустки в сердце

3. Мышь хирургии

3.1) Мышь Анестезия и регулировать

1. Приготовьте шприц анестетика дозе 80 мг / кг кетамина и 5 мг / мл ксилазина смеси, а также добавить стерильный 0,9% солевой раствор, чтобы довести до объема 0,2 мл. Вводите гепарина IP (50 мкл 1000 ед / мл раствора).
2. Поместите мышь обратно в транспортный контейнер (~ 10-20 мин) и подождите, пока она теряет сознание, как гепарин вступает в силу. Периодически делать носок щепотку контролировать боль рефлекс.

3.2) Извлеките сердце

1. После того, как мышь полностью без сознания и не реагирует на носок крайнем случае, закрепите его на соответствующем рабочем столе с помощью булавки или 25 г Советы шприца через конечностей. Выполнение торакотомии подвергать сердце. Сокращение маленькое отверстие чуть ниже грудины и расширить разрез по бокам мыши, избегая диафрагму.
2. Быстро вырезать диафрагму, а затем быстро резать бока грудной клетке. Флип обратно грудную клетку, как раковина моллюска, чтобы разоблачить грудной полости. Аккуратно придерживая сердца, поместите ножницы снизу и снять сердце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы быстро удалить сердце, когда он подвергается в грудной полости и легкие не функционируют.

3.3) Очистите сердце

1. Поместите сердце в чашку, содержащую ледяную КАХАБ и обрезать любые большие куски ткани легкого прилагается. Используйте пинцет, чтобы забрать сердце и найти аорту. Слегка сожмите сердце и искать любой крови, которое появляется, как это должно быть открытым концом аорты. Использование тонкий наконечник пинцет, чтобы удерживать сердце открытым концом аорты.

е "> 4. Монтаж Сердце, начиная перфузии и Размещение шар

4.1) Монтаж и Cannulating Сердце

1. Перед транспортировкой сердце аппарата Лангендорфа, включите насос, обеспечивающий, что давление перфузии низкий (~ 20 мм рт.ст.). Держите сердце, аорте только под канюли. Использование другой набор мелких концевых пинцетом, осторожно откройте аорты и сдвиньте сердце вверх на канюли. Держите его в месте с одним набором пинцетом, а затем использовать с мягкими краями клип временно закрепите его на канюлю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро монтажа сердце перфузии канюли имеет решающее значение для хорошей подготовки. С опытом, процедуры из не открывая грудную полость до монтажа сердце должны принимать между 1 и 2 мин.
2. Свяжите и инициировать перфузии как следует, с помощью шелковой нити 4-0 безопасной аорты с канюлей непосредственно ниже клипа. Убедитесь, галстук и вокруг металлической канюли аорты, так аорты не привязываться от при затягиванииузел. После того, как один галстук прочно заняла, снять клип.
3. Используйте дополнительные шелковые швы, чтобы закрепить аорты надежно канюли, убедившись, чтобы связать ниже любых отраслей судов, которые могут быть ближайшие от аорты. Они часто могут быть замечены перфузата утечки или съемки из аорты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На начальных этапах перфузии крови должно быть мытье от сердца и вся сердце должно появиться мягкий розовый цвет. Темные обесцвечивания, не промыть указывают ишемические участки, скорее всего из-за воздуха эмболии или сгустков и сердце не должны быть использованы.

4.2) установление перфузии и ППЖ Измерение

1. Медленно увеличивайте давление перфузии и увеличить скорость насоса до тех пор, пока давление перфузии достигает 70 мм рт.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные давление перфузии для мыши перфузии может быть 70-90 мм рт.ст., но должна оставаться постоянной от животного к животному в качестве эксперимента.
2. Очистите оставшийся ткани (легкие, щитовидная железа и т.д.), Что все еще может быть прикреплен к сердцу. Используйте ножницы, чтобы отрезать левую предсердий для того, чтобы создать отверстие в левом желудочке.
3. Поместите шар на держатель и выкачать. Поместите баллон канюли вблизи аорты канюли, непосредственно над отверстием в левый желудочек. Осторожно вставьте шар вниз в левый желудочек, удерживая сердце на месте, так аорты не оторвать.
4. После того, как на месте, медленно начинают раздувать баллон до тех пор, пока не достигнет LVEDP ~ 8 мм рт. Поместите датчик температуры от нижней части сердца, так что измеряет температуру выходящего потока.

4.3) базальной Измерение

1. Печать сердце в водяной рубашкой перфузии камеры. В течение этого времени постоянно заливать сердце КАХАБ, и убедитесь, что температура продолжает расти. Контролировать температуру и регулировать водяной бане, соответственно, до тех пор, пока не достигнет примерно 37 ~ ºC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг TEMPERATЮр на начальных этапах перфузии является критической коронарных потоков, а затем температура может варьироваться от сердца к сердцу. Температура отходящего перфузату контролируется на желаемой температуры инфаркта с помощью датчика температуры размещены на верхушке сердца. Кроме того, по сравнению с другими протоколами перфузии Langendorff, сердце не погружен в КП или КАХАБ во перфузии или ареста, это в основном делается быстро регулировать температуру, а также обеспечить эффективную доставку CP без диффузии.
2. Начните записывать непрерывно функциональную измерение с помощью системы сбора данных, прикрепленный к соответствующим датчиков, в том числе перфузии давления, давления левого желудочка (датчика давления прикреплен к LVP шар), температуры и электрофизиологических параметров (ЭКГ, MAP, если таковой имеется), (приложение будет по производителям и специфичные для отдельных датчиков и системы сбора данных). После того, как отходящий КАХАБ достигает ~ 37 ºC в течение минимум 15 мин и сердечные функциональные параметры стабильны, обратите внимание на время в исходных измерений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии включения / исключения применяются к каждому сердцу. LVDP из <60 мм рт.ст. исходно означает, что сердце должно быть удалено из анализа. Кроме того, коронарный кровоток> 4,5 мл / мин, или неспособность поддерживать давление перфузии исходно, вероятно, указывает на утечку или разорванной аорты. Кроме того, любые сердца, которые имеют четкие ишемические области, которые могут быть подтверждены визуально (то есть, сгусток) или экспонат ишемией связано сокращение сердечной функции (то есть, увеличивая LVEDP, чрезвычайно аритмии) удаляются из анализа.
3. Измерение коронарного кровотока через сбора коронарного потока, выходящего в градуированный цилиндр в течение 1 мин. Закройте камеру и позволяют температуры и функция возврата к исходным значениям. Кроме измерения коронарного кровотока непрерывно в перфузии линии через зонд потока размещены после цепи сброса давления.

"> 5. Инициативный кардиоплегического Арест

1. Поместите 100 мл холодного буфера кардиоплегии в другой резервуар, и. передать водохранилище канюли КАХАБ к кардиоплегии водохранилища.
2. Снять водяной рубашкой корпус и схему перфузии потепления из ванны теплой воды и подключиться к охлажденного циркуляционного насоса с использованием трубки быстро отсоединяется. Используйте отдельные нагревательные и охлаждающие циркуляторы, чтобы быстрые изменения температуры сердца и перфузат.
3. Следуйте пузырек воздуха, который получает введен в трубку во время переключения, и как только он достигает около изолированного сердца начать синхронизацию для кардиоплегии. Доставка кардиоплегии в течение 2 мин. После начальной дозы остановки насоса. Убедитесь, чтобы остановить сердце в диастолу и быть рядом до нужной температуры CP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: достаточно пузырь ловушка необходимо, чтобы избежать воздуха эмболии в сердце. Кроме системы доставки для обеих водоемов переключаемых краном может быть легко построены, однако мы находим следоватьING небольшой пузырек воздуха, который вводится при замене канюли между водохранилищ, легкий способ синхронизации доставки СР данную потенциально разные скорости насоса между экспериментов (т.е. из-за мыши / крысы, перфузионного давления, сопротивления фильтра и т.д.).
4. Держите сердце в кардиоплегии в течение 2 часов при температуре ~ 20 ° C. Каждые полчаса в течение CP включить насос снова в течение 1 мин, чтобы другой дозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Периодические дозы CP каждые 30 мин происходит функциональных нарушений сердца без некроза ткани. Более длительные периоды между дозами КП (то есть,> 45 мин) может привести к некрозу и ишемической контрактуры и было бы более уместным для модели некротической травмы, связанной с незащищенным ишемии.

6. Реперфузия

1. В конце CP, передачи резервуара канюли обратно в окисленной КАХАБ. Подключите контроля температуры контуров с циркуляционный насос системы отопления и поверните насосна начать реперфузии. В этот момент кардиоплегии вымывает, наблюдать повышение температуры и сердце начинает бить снова после 2-4 мин реперфузии. При запуске сердце сердцебиение медленно и часто аритмичный.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Там, как правило, не большой рост диастолического ППЖ (т.е. ≤10 мм рт.ст. нарастания), который часто характерно в чистых моделей ишемии. Аритмия может сохраняться также в реперфузии, а иногда и сердца должны быть defibrillated. Это может быть достигнуто с использованием стимулятор установлено на более высокое напряжение (~ 10-50 В) и электродов, расположенных у основания и верхушки сердца.
2. Разрешить сердце reperfuse в течение 30 мин, и в течение этого периода времени проводить измерения коронарного кровотока по мере необходимости. Измерение коронарного кровотока путем сбора эффлюента с градуированный цилиндр в течение 30-60 сек.

7. Сбор ткани

1. Выпустите шар и убрать его из левого желудочка. Возьмите сердце отканюли и взвесить его. В начальных экспериментах, по крайней мере, один поперечный срез сердца следует и окрашивали TTC оценить некроз, чтобы гарантировать, что сердце без каких-либо некротического повреждения.
2. Соберите кусочки сердца для микроскопических исследований, влажных / сухих весов, и т.д. Остальная или всем сердцем должны быть быстро заморожены размещения в жидкий азот. Хранить замороженные сердца в -80 ºC морозильник.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения фосфатных соединений высокой энергии (т.е., АТФ, креатин фосфат), сердца должны быть немедленно заморожены.

Результаты

На рисунке 1 представлены типичные результаты одного эксперимента мыши. ППЖ (красная линия), DP / DT (зеленая линия), и температура (фиолетовая линия) были continusouly записал более ~ 3 ч. Письма показывают - базовый измерения, B, C, D, E - доставка кардиоплегии раствором, F - начала реперфузии, G...

Обсуждение

Приведенные выше методы подробно протокол оценить инфаркт потрясающий вторичной ишемии, связанной с кардиоплегического ареста. В наших руках этот протокол производит приблизительное ~ сокращение сердечной функции 40% (LVDP +/- DP / DT) с минимальными изменениями частоты сердечных сокращени?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures