Murino Isolato Cuore modello di infarto stordimento associati con arresto cardioplegica

Riepilogo

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Abstract

Il protocollo seguito è utile per valutare la funzione cardiaca compromessa o miocardiche splendida seguenti moderati insulti ischemici. La tecnica è utile per modellare danno ischemico associato con numerosi fenomeno clinicamente rilevanti tra cui la chirurgia cardiaca con arresto cardioplegica e bypass cardiopolmonare, CABG off-pump, trapianto, angina, breve ischemia, ecc. Il protocollo presenta un metodo generale per modellare ipotermico arresto cardioplegico hyperkalemic e riperfusione nei cuori roditori concentrandosi su misura della funzione contrattile miocardica. In breve, un cuore mouse è perfuso in modalità Langendorff, strumentato con un palloncino intraventricolare, e parametri funzionali cardiaci di base sono registrate. Dopo la stabilizzazione, il cuore è quindi soggetta a brevi infusione di una soluzione cardioprotettivo cardioplegia ipotermico di avviare arresto diastolica. Cardioplegia viene consegnato in modo intermittente su 2 ore. Il cuore è quindi riperfuso e warmed a temperature normotermici e recupero della funzione miocardica è monitorata. L'uso di questo protocollo si traduce in affidabilità funzione contrattile cardiaca depressa esenti da danni ai tessuti del miocardio lordo nei roditori.

Introduzione

Miocardico stordimento è definito come reversibile attività contrattile ridotto nonostante il ripristino di un adeguato flusso di sangue dopo un breve periodo di ischemia o periodi prolungati di insulti ischemici con cardioprotezione ^1,2,3,4,5. Il metodo presentato è specificamente utilizzato per modellare clinicamente rilevanti insulti ischemici che possono provocare alterazioni reversibili in funzione contrattile (vale a dire, gli insulti ischemici associati alla chirurgia cardiaca utilizzando arresto cardioplegico, brevi periodi di ischemia, angina, ecc). In contrasto con gli studi di ischemia gravi (infarto miocardico, necrosi) questo protocollo è stato sviluppato per valutare il recupero funzionale del miocardio e cardioprotezione senza danno tissutale, rimodellamento, e la morte cellulare. La maggior parte della carta discute un protocollo standard arresto cardioplegic con elementi simili a un cardiochirurgia utilizzando ipotermia e consegna cardioplegia intermittente.

Prot miocardicaezione durante la maggior parte di interventi chirurgici cardiaci si basa su cardioplegia e bypass cardiopolmonare. Sebbene cardioplegia soluzioni e strategie (CP) sono molto variabili (sangue, crystalloid, freddo, caldo, ecc) gli elementi più comuni sono 1) iperkaliemia e / o altre strategie per arrestare il cuore in diastole, limitando così l'utilizzo di energia derivante dalla contrazione del miocardio, e 2) l'ipotermia per rallentare il metabolismo e aiutano a mantenere ATP e altre riserve di energia mentre arrestato. Le soluzioni cardioplegia attuali offrono protezione per il cuore contro gli insulti ischemici che altrimenti rivelarsi letale. Tuttavia, le strategie cardioprotettivi durante insulti ischemici chirurgici non sono perfetti, e la conseguente lieve danno ischemico può provocare reversibile disfunzione contrattile cardiaca nonostante un adeguato flusso di sangue (stunning miocardico), l'acidosi, danni cardiomiociti, e gli effetti vascolari, tra cui ridotta perfusione coronarica e vasospasmo.

Questo protocollo è diversoda modelli standard di ischemia cardiaca isolati valutazione infarto miocardico e ischemia grave in quanto valuta più lievi insulti ischemici che può portare a insufficienza cardiaca seguente breve ischemia o insulti ischemici associati con l'arresto cardioplegic. (Per la revisione sulle tecniche di perfusione Langendorff e I / studi R vedi ^6-8). Per linee guida generali e un'analisi approfondita dei parametri sperimentali connessi con il mouse isolato cuori perfusi vedere Sutherland e t al., 2003 ⁹ La tecnica qui presentata dettagli l'attrezzatura necessaria, reagenti, gradini, strategie e suggerimenti per indurre affidabile mozzafiato in cuori del mouse. Modifiche minori sono necessarie per applicare la tecnica a ratti.

Brevemente cuori isolato mouse sono Langendorff perfusi per circa 30 minuti con fisiologica tampone Krebs-Henseleit (KHB), seguiti da freddo protetta arresto cardiaco mediante consegna di un hypotherm hyperkalemicsoluzione cardioplegia ic. Dopo l'arresto, il recupero funzionale cardiaca viene monitorato nel corso rewarming e riperfusione del cuore con KHB. Le variazioni del grado di recupero della funzione contrattile cardiaca può essere valutata per valutare agenti cardioprotettivi e strategie cardioprotezione differenti.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali durata della vita e di tutti gli animali e le procedure secondo la Nazionale Guide Consiglio di ricerca per la cura e l'uso di animali da laboratorio ^10.

1. Balloon Fabbricazione e ventricolare sinistra Pressure Monitoring Circuit

1. Costruire palloni LV secondo Miller et al. ¹¹ in un bicchiere con un ancoretta, miscelare 9.5 ml di acqua distillata, 14,2 ml di sciroppo di mais luce e 33,8 g di saccarosio, e il calore su un piatto caldo, mescolare fino a quando lo zucchero si scioglie . Continuare soluzione di riscaldamento fino a raggiungere circa 150 ºC.
   NOTA: esistono numerosi metodi per la costruzione di palloncini BT, tra cui la modifica di consigli preservativo e trasparente pellicola di costruzione ^9,12. Troviamo il metodo di cui sopra sia relativamente facile da costruire palloni perdite liberi, ma un vantaggio di aggrapparsi palloncini pellicola comprende caratterizzazione precedente un'adeguata frerelazioni cy-risposta ^9.
2. Rompere fili di spaghetti secchi in pezzi di circa 5 cm di lunghezza e immergere un lato di ogni pezzo di circa 1 cm di profondità nella soluzione di zucchero e rimuovere lentamente.
3. Posizionare la parte secca del filo di pasta in un blocco di schiuma di polistirene e sospendere così il mix di zucchero gocciola verso il basso e forma uno stampo forma a goccia. Lasciare O / N in un essiccatore così stampo indurisce.
4. Il giorno seguente, immergere gli stampi in gel di silicone dispersione. Posizionare fili di pasta di nuovo in polistirene blocco di schiuma e il luogo in aa 37 ºC forno per 2 ore o fino a secco. Ripetere questo passaggio una volta di più vengono applicati due strati di silicone.
5. Una volta asciutto, posto in acqua per diverse ore per aiutare nella rimozione di pallone dallo stampo. Conservare palloncini in 0,02% soluzione di sodio azide.
6. Utilizzare una raccolta di sangue 23 G impostata per produrre una cannula balloon personalizzato tagliando un ago per creare una punta smussata e mettendo tacche nell'ago.
7. Collegare il tubo ad una pressione transduttore e sciacquare con acqua mantenendo tubi e cannule completamente sommerse per impedire l'ingresso di aria nel sistema. Posizionare un palloncino che è stato riempito con acqua sulla cannula e utilizzare 2-0 punti di sutura in seta per legare sulla cannula. Prova palloncino capacità di mantenere la pressione (~ 100 mmHg per almeno 1 ora)

2. Preparazione del sistema di perfusione del cuore isolato

1. Inizialmente, lavare e riscaldare il sistema. Accendere un 37 ºC acqua calda bagno circolatore che è stato collegato all'apparato Langendorff, e riempire il serbatoio tampone con acqua distillata. Collegare un nuovo filtro in fibra di vetro dei tubi scorre in apparati e accenda la pompa per scovare il sistema. Durante il tempo di preparazione, il controllo della temperatura dell'acqua espulsa dal blocco Langendorff usando una sonda di temperatura, per garantire che bagnomaria è impostato correttamente. Inoltre, accendere una pompa di circolazione refrigerato e impostare a 20 ° C che verrà utilizzata durante l'arresto cardioplegico del cuore.
2. IOn frattempo preparare le seguenti soluzioni. Preparare 1 L di soluzione di cardioplegia (NaCl 110 mM, KCl 16 mM, 16 mM MgCl _2, 1.5 mM CaCl _2, 10 mM _NaHCO3) e filtrare. Inoltre, preparare 2 litri di KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mm KH ₂ PO _4, 1.7 MgSO mm _4, 2 mM Na-piruvato, destrosio 6 mm 24,9 NaHCO mm ₃ (pre-cellulare con il CO ₂₎ , 1.4 mM CaCl ₂ (aggiunto ultima). Una volta sciolto, rimuovere precipitati filtrando in un pallone con una lente 5 micron imbuto sinterizzato. Porre un in un piccolo piatto su ghiaccio per essere usato durante la chirurgia e isolamento.
3. Ossigenare il perfusato (KHB) con 95% O _2/5% CO ₂ per almeno 30 minuti prima dell'uso. Sistema Perfuse Langendorff con KHB per rimuovere eventuale acqua residua dal sistema e tampone serbatoio. Per i topi, impostare la velocità iniziale della pompa a ~ 2,0 ml / min. Mettere 2-0 e 4-0 punti di sutura in seta vicino perfusione cannula. Eseguire la pompa fino a quando il tubo e l'apparecchiatura sono pieni di spiritoh perfusato e garantire la strup bolla è pieno di perfusato.
   NOTA: per lunghi periodi di perfusione e la funzione stabile si raccomanda di installare un filtro in linea in fibra di vetro (~ 1 micron) nel circuito di perfusione a raccogliere eventuali precipitati che potrebbero costituire la formazione di coaguli nel cuore

3. mouse Chirurgia

3.1) Topo Anestesia e trattare

1. Preparare siringa con la dose di anestetico di 80 mg / kg di ketamina e 5 mg / ml miscela xilazina e aggiungere 0,9% soluzione salina sterile per richiamare il volume di 0,2 ml. Iniettare eparina IP (50 ml di 1.000 U / ml soluzione).
2. Posizionare il mouse di nuovo nel contenitore per il trasporto (~ 10-20 min) e attendere che si perda la coscienza come l'eparina ha effetto. Periodicamente fare un pizzico punta a monitorare il dolore riflesso.

3.2) Rimuovere il Cuore

1. Una volta che il mouse è completamente privo di sensi e non risponde a pizzico piedi, fissarla ad un tavolo operatorio adeguato con perni o 25 G puntali attraverso le arti. Eseguire una toracotomia per esporre il cuore. Tagliare un piccolo foro appena sotto lo sterno ed estendere il taglio ai lati del mouse evitando il diaframma.
2. Tagliare rapidamente il diaframma e poi rapidamente tagliare i lati della gabbia toracica. Capovolgere indietro la gabbia toracica come una conchiglia per esporre la cavità toracica. Afferrare delicatamente cuore, posizionare sotto le forbici e togliere il cuore.
   NOTA: E 'indispensabile per rimuovere rapidamente il cuore una volta che è esposto nella cavità toracica e polmoni sono non-funzionali.

3.3) Pulire il Cuore

1. Mettere il cuore nel piatto contenente ghiaccio KHB freddo e tagliare eventuali grossi pezzi di tessuto polmonare allegati. Utilizzare pinze a prendere il cuore e individuare l'aorta. Premere delicatamente il cuore e cercare il sangue che viene visualizzata, come questo dovrebbe essere l'estremità aperta dell'aorta. Utilizzare pinzette punta fine di tenere cuore dalla estremità aperta dell'aorta.

e "> 4. Montaggio del Cuore, partenza perfusione, e Posizionamento del palloncino

4.1) Montaggio e Cannulating Cuore

1. Prima di trasportare il cuore all'apparato Langendorff, accendere la pompa assicurandosi che la pressione di perfusione è bassa (~ 20 mmHg). Tenere cuore dall'aorta appena sotto la cannula. Utilizzando un altro set di pinzette punta fine, aprire con cautela l'aorta e far scorrere cardiaca sulla cannula. Tenerlo in posizione con una serie di pinzette e poi usare un clip morbido bordi per fissare temporaneamente a cannula.
   NOTA: montare rapidamente il cuore alla cannula di perfusione è fondamentale per una buona preparazione. Con l'esperienza, le procedure di apertura della cavità toracica fino montare il cuore dovrebbe prendere tra 1 e 2 min.
2. Legare e avviare perfusione come segue, con 4-0 sutura di seta aorta sicuro alla cannula direttamente sotto il clip. Assicurarsi che la cravatta è anche intorno alla cannula aortica metallo, così l'aorta non ottenere legati off durante il serraggioil nodo. Una volta che una cravatta è ben posizionato, rimuovere la clip.
3. Utilizzare punti di sutura in seta aggiuntivi per fissare l'aorta saldamente alla cannula facendo attenzione a legare sotto i rami dei vasi che possono essere venuta fuori l'aorta. Questi possono spesso essere individuati da perdite perfusato o tiro fuori dall'aorta.
   NOTA: Durante le fasi iniziali della perfusione del sangue deve essere lavando dal cuore e l'intero cuore dovrebbe apparire di un colore rosa tenue. Decolorazioni scure che non si lavano fuori indicano le aree ischemiche probabilmente a causa di emboli o coaguli di aria e il cuore non deve essere utilizzato.

4.2) Stabilire perfusione e LVP misura

1. Aumentare lentamente la pressione di perfusione e aumentare la velocità della pompa fino a che la pressione di perfusione raggiunge i 70 mmHg.
   NOTA: la pressione di perfusione standard per il mouse perfusione possono essere 70-90 mmHg, ma devono essere tenuti costanti da un animale all'altro all'interno di un esperimento.
2. Pulire il residuo di tessuto (polmone, tiroide ecc) Che potrebbe essere ancora fissato al cuore. Utilizzare le forbici per tagliare gli atri sinistra per creare un'apertura nel ventricolo sinistro.
3. Posizionare il palloncino sul supporto e sgonfiare. Posizionare la cannula pallone vicino la cannula aortica, direttamente sopra l'apertura nel ventricolo sinistro. Inserire con cautela pallone verso il basso nel ventricolo sinistro tenendo il cuore in atto in modo aorta non si strappi.
4. Una volta che è a posto lentamente inizia a gonfiare il palloncino fino a quando il LVEDP raggiunge ~ 8 mmHg. Posizionare la sonda di temperatura contro il fondo del cuore in modo che misura la temperatura dell'effluente.

4.3) Misura basale

1. Sigillare il cuore in una camicia d'acqua camera di perfusione. Durante questo periodo profumato continuamente il cuore con KHB, e assicurarsi che la temperatura continua a salire. Monitorare la temperatura e regolare il bagno di acqua di conseguenza, fino a raggiungere circa ~ 37 ºC.
   NOTA: temperat Monitoraggioure nelle fasi iniziali di perfusione è critica come flussi coronariche e successivamente temperatura può variare da cuore a cuore. Temperatura del perfusato effluente viene monitorato per temperature infarto desiderata tramite una sonda di temperatura posta all'apice del cuore. Inoltre, in confronto ad altri protocolli di perfusione Langendorff, cuore non è immerso in CP o KHB durante la perfusione o arresto, questo è fatto principalmente di regolare rapidamente la temperatura, oltre a fornire la consegna CP efficiente senza diffusione.
2. Inizia a registrare continuamente misurazione funzionale utilizzando un sistema di acquisizione dati collegato ai sensori appropriati, compresa la pressione di perfusione, pressione ventricolare sinistra (trasduttore di pressione collegato al palloncino LVP), la temperatura, e parametri elettrofisiologici (EKG, MAP se presente) (allegato sarà I fabbricanti e le specifiche ai singoli sensori e sistema di acquisizione dati). Una volta che l'effluente KHB raggiunge ~ 37 ° C per almeno 15 min e parametri funzionali cardiaci sono stabili, prendere nota del tempo per misurazioni di riferimento.
   NOTA: i criteri di inclusione / esclusione vengono applicate a ogni cuore. Un LVDP di <60 mmHg al basale indica un cuore che deve essere rimosso dall'analisi. Inoltre, il flusso coronarico> 4,5 ml / min, o l'incapacità di mantenere la pressione di perfusione al basale probabilmente indica una perdite o dell'aorta strappati. Anche eventuali cuori che hanno chiare le aree ischemiche che possono essere confermati visivamente (ad esempio, coagulo) o riduzioni di ischemia associata espositive della funzione cardiaca (ad esempio, l'aumento LVEDP, estremamente aritmici) vengono rimossi dall'analisi.
3. Misurare flusso coronarico mediante raccolta dell'effluente coronaria in un cilindro graduato per 1 min. Chiudere la camera e consentire la temperatura e la funzione di ritorno ai valori basali. Alternativamente misurare il flusso coronarico continuo nella linea di perfusione con una sonda di flusso posto dopo il circuito di scarico della pressione.

"> 5. Avvio cardioplegica arresto

1. Mettere 100 ml di tampone cardioplegia fredda in un altro serbatoio e. trasferire il serbatoio cannula KHB al serbatoio cardioplegia.
2. Staccare il corpo rivestito acqua e il circuito di riscaldamento di perfusione dal bagno di acqua calda e connettersi al circolatore refrigerato utilizzando tubi sgancio rapido. Utilizzare circolatori di riscaldamento e raffreddamento separati per consentire rapidi cambiamenti di temperatura del cuore e perfusato.
3. Seguire la bolla d'aria che viene introdotto nel tubo durante la commutazione, e una volta raggiunta vicino al cuore isolato avviare la temporizzazione per cardioplegia. Consegnare cardioplegia per 2 minuti. Dopo la dose iniziale di fermare la pompa. Assicurarsi di arrestare cuore in diastole ed essere vicino alla temperatura desiderata CP.
   NOTA: Una trappola bolla sufficiente è necessario per evitare emboli aria nel cuore. In alternativa un sistema di erogazione per entrambi i serbatoi commutate da un rubinetto può essere facilmente costruito, tuttavia troviamo seguirezione la piccola bolla d'aria che viene introdotto quando cambi la cannula tra bacini, un metodo facile di tempistiche di consegna, CP dato potenzialmente differenti velocità della pompa tra esperimenti (ad esempio, a causa di topo / ratto, pressione di perfusione, resistenza del filtro, ecc.)
4. Mantenere il cuore in cardioplegia per 2 ore a ~ 20 ° C. Ogni mezz'ora durante CP accendere la pompa nuovamente per 1 minuto in modo da un'altra dose viene somministrata.
   NOTA: dosi intermittenti di CP ogni 30 min comporta compromissione funzionale del cuore, senza la necrosi del tessuto. Periodi più lunghi tra le dosi di CP (cioè,> 45 min) possono provocare necrosi e contrattura ischemica e sarebbe più appropriato per un modello di danno necrotico associato con ischemia non protetto.

6. riperfusione

1. Alla fine del CP, trasferire la cannula serbatoio indietro al ossigenato KHB. Collegare i circuiti di controllo della temperatura per il circolatore riscaldamento e spegnere la pompasu per iniziare riperfusione. A questo punto la cardioplegia lava fuori, osservare l'aumento di temperatura e il cuore inizia a battere dopo 2-4 minuti di riperfusione. Quando il cuore inizia a battere il cuore è lento e spesso aritmica.
   NOTA: di solito non è un grande aumento diastolica LVP (vale a dire, ≤10 mmHg aumento), che spesso è caratteristico in modelli di ischemia puri. Le aritmie possono persistere anche nel riperfusione e di tanto in tanto il cuore dovranno essere defibrillato. Ciò può essere ottenuto con l'uso di un insieme stimolatore a tensioni superiori (~ 10-50 V) ed elettrodi posti alla base e apice del cuore.
2. Lasciare cuore per reperfuse per 30 minuti, e durante questo periodo di tempo prendere misure di flusso coronarico come necessario. Misurare il flusso coronarico raccogliendo l'effluente con un cilindro graduato per 30-60 secondi.

7. Raccolta Tissue

1. Sgonfiare il palloncino e rimuoverlo dal ventricolo sinistro. Prendete il cuore fuori dalcannula e si pesa. In esperimenti iniziali, almeno una porzione trasversale del cuore dovrebbe essere presa e TTC macchiato valutare la necrosi per garantire che il cuore è libero di lesioni necrotiche.
2. Raccogliere le fette di cuore per gli studi di microscopia, pesi wet / dry, ecc Il resto o tutto il cuore dovrebbe essere rapidamente congelati mettendo in azoto liquido. Conservare cuori congelati in un freezer -80 ° C.
   NOTA: Per la misurazione di composti fosfato ad alta energia (cioè, l'ATP, fosfato creatina), il cuore deve essere congelato immediatamente.

Risultati

La Figura 1 presenta i risultati tipici da un esperimento del mouse. LVP (linea rossa), dP / dt (linea verde), e la temperatura (linea viola) sono state continusouly registrato oltre ~ 3 ore. Lettere indicano un - misurazione di base, b, c, d, e - consegna di soluzione cardioplegia, f - inizio della riperfusione, g, h, i, j - misurazione del flusso cornary durante la riperfusione. Nota, LVDP depresso e dP / dt su riperfusione rispetto al basale. Figura 1B include i dati da un registrato...

Discussione

I particolari del protocollo precedenti metodi per valutare stunning miocardico secondario all'ischemia globale associato con l'arresto cardioplegic. Nelle nostre mani questo protocollo produce un approssimativo ~ riduzione del 40% della funzione cardiaca (LVDP, +/- dP / dt) con modifiche minime della frequenza cardiaca al 30 min punto tempo di post-riperfusione. Mentre il cuore è riperfuso e rewarmed tutti i parametri di funzionalità cardiaca sono ridotte in momenti iniziali con una frequenza cardiaca molto r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures