Murino Aislado Modelo Corazón de aturdimiento miocárdico asociado a paro cardioplégico

Resumen

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Resumen

El siguiente protocolo es de utilidad para evaluar la función cardiaca deteriorada o elevando insultos isquémicos moderados miocardio. La técnica es útil para el modelado de la lesión isquémica asociada con numerosas fenómeno clínicamente relevante, incluyendo cirugía cardíaca con parada cardiopléjica y bypass cardiopulmonar, la cirugía sin CEC, trasplante, angina, isquemia breve, etc. El protocolo presenta un método general para modelar hipotermia arresto cardioplégica hipercaliémica y reperfusión en los corazones de roedores que se centran en la medición de la función contráctil del miocardio. En resumen, un corazón de ratón se perfunde en el modo de Langendorff, equipado con un globo intraventricular, y se registran los parámetros funcionales cardíacos iniciales. Tras la estabilización, el corazón se somete a breves infusión de una solución de cardioplejía hipotermia cardioprotector para iniciar arresto diastólica. Cardioplegia se entrega de forma intermitente durante 2 horas. El corazón está entonces reperfundido y Warmed para las temperaturas y la recuperación de la función miocárdica normotérmicos se supervisa. El uso de este protocolo los resultados en función contráctil cardiaca deprimida confiable libres de daño en el tejido miocárdico bruto en roedores.

Introducción

Aturdimiento miocárdico se define como reversible reducción de la actividad contráctil a pesar de la restauración del flujo sanguíneo adecuado después de un breve período de isquemia o períodos prolongados de insultos isquémicos con ^1,2,3,4,5 cardioprotección. El método presentado se utiliza específicamente para modelar insultos isquémicos clínicamente relevantes que pueden resultar en alteraciones reversibles en la función contráctil (es decir, los insultos isquémicos asociados con la cirugía cardíaca utilizando parada cardiopléjica, breves períodos de isquemia, angina de pecho, etc.). En contraste con los estudios de isquemia grave (infarto de miocardio, necrosis) fue desarrollado este protocolo para evaluar la recuperación funcional del miocardio y la cardioprotección sin lesión de los tejidos, remodelación, y la muerte celular. La mayoría del trabajo se analiza un protocolo de parada cardiopléjica estándar con elementos similares a una cirugía cardíaca utilizando la hipotermia y la entrega cardioplejía intermitente.

Prot miocardioreflexión durante la mayoría de las cirugías cardíacas se basa en cardioplegia y bypass cardiopulmonar. Aunque cardioplejía soluciones y estrategias (CP) varían ampliamente (sangre, cristaloide, frío, caliente etc.) los elementos más comunes son 1) la hiperpotasemia y / u otras estrategias para detener el corazón en diástole, limitando así la utilización de energía resultante de la contracción miocárdica, y 2) la hipotermia para ralentizar el metabolismo y ayudar a mantener la ATP y otras reservas de energía mientras arrestado. Soluciones de cardioplejía actuales proporcionan protección al corazón contra los insultos isquémicos que de otro modo resultarían letales. Sin embargo, las estrategias cardioprotectoras durante insultos isquémicos quirúrgicos no son perfectos, y la lesión isquémica leve resultante puede dar lugar a una disfunción contráctil cardiaca reversible pesar de un flujo sanguíneo adecuado (aturdimiento miocárdico), acidosis, daños cardiomiocitos, y los efectos vasculares incluyendo la perfusión coronaria reducida y el vasoespasmo.

Este protocolo se diferenciaa partir de modelos de isquemia del corazón aislado estándar evaluación de infarto de miocardio e isquemia severa en que se evalúa insultos isquémicos más suaves que puede resultar en la función cardiaca deteriorada siguiente breve isquemia o insultos isquémicos asociados con la parada cardiopléjica. (Para una revisión de técnicas de perfusión Langendorff y I / R en ver ^6-8). Para obtener directrices generales y un análisis exhaustivo de los parámetros experimentales asociadas con aislados de ratones corazones perfundidos ver Sutherland e t al. 2003 ⁹ La técnica que aquí se presenta detalla el equipamiento necesario, reactivos, pasos, estrategias y consejos para inducir de manera fiable impresionante en los corazones de ratón. Pequeñas modificaciones son necesarias para aplicar la técnica a ratas.

Brevemente corazones aislados de ratones se Langendorff perfundidos durante aproximadamente 30 minutos con tampón fisiológico Krebs-Henseleit (KHB), seguidos por el frío paro cardiaco protegida a través de la entrega de una hipotermia hipercaliémicasolución de cardioplejía ic. Tras la detención, la recuperación funcional cardíaca se controla durante el recalentamiento y la reperfusión del corazón con KHB. Los cambios en el grado de recuperación de la función contráctil cardiaca pueden ser evaluados para evaluar agentes cardioprotectores y diferentes estrategias de cardioprotección.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional Animal Vida útil Cuidado y Uso y todos los animales y los procedimientos de acuerdo con la Guía Nacional Research Council para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ^10.

1. Fabricación Globo y Presión ventricular izquierda Monitoreo del Circuito

1. Construya globos LV según Miller et al. ¹¹ En un vaso de precipitados con una barra de agitación, mezcla 9,5 ml de agua destilada, 14,2 ml de jarabe de maíz de luz y 33,8 g de sacarosa, y el calor en un plato caliente, mezclar hasta que se disuelva el azúcar . Continuar solución de calefacción hasta que alcanza aproximadamente 150 ºC.
   NOTA: Muchos métodos existen para construir globos LV incluyendo modificación de consejos de condones y se aferran construcción de película ^9,12. Nos encontramos con el método anterior sea relativamente fácil de construir globos sin fugas, sin embargo una ventaja de globos papel film incluye la caracterización previa para frequen apropiadarelaciones ^CY-9 de respuesta.
2. Romper hebras de espagueti secos en trozos de unos 5 cm de largo y sumergir un lado de cada pieza alrededor de 1 cm de profundidad en la solución de azúcar y poco a poco eliminar.
3. Coloque el extremo seco de la banda de pasta en un bloque de espuma de poliestireno y suspender por lo que la mezcla de azúcar gotea y forma un molde de forma de lágrima. Deja O / N en un desecador por lo que el molde se endurece.
4. Al día siguiente, sumergir los moldes en gel de dispersión de silicona. Coloque hebras de pasta de nuevo en bloque de espuma de poliestireno y colocar en horno aa 37 ºC durante 2 horas o hasta que se seque. Repita este paso una vez más que se aplican dos capas de silicona.
5. Una vez seco, el lugar en el agua durante varias horas para ayudar en la eliminación del globo del molde. Globos en tienda a la solución de azida de sodio 0,02%.
6. Utilice una extracción de sangre 23 G configurar para producir una cánula globo personalizado cortando una aguja para crear una punta roma y la colocación de las muescas en la aguja.
7. Conecte el tubo a una presión transproductor y enjuague con agua, manteniendo la tubería y cánula completamente sumergidos para evitar que entre aire en el sistema. Coloque un globo que ha sido llenado con agua sobre la cánula y el uso de suturas de seda 2-0 para atar sobre cánula. Globos de prueba por la capacidad para mantener la presión (~ 100 mmHg durante al menos 1 hora)

2. Preparación del sistema de perfusión aislada del corazón

1. Inicialmente, lavar y calentar el sistema. Encienda un baño de agua tibia circulador 37 ºC que se ha conectado al aparato Langendorff, y rellenar depósito de regulación con agua destilada. Conecte un nuevo filtro de fibra de vidrio para tubos que desembocan en el aparato y encienda la bomba para eliminar el sistema. Durante el tiempo de preparación, controlar la temperatura del agua expulsada desde el bloque de Langendorff utilizando una sonda de temperatura, para asegurar que baño de agua se ajusta con precisión. También, encender una bomba de circulación refrigerado y se puso a 20 ºC que se utilizará durante la parada cardiopléjica del corazón.
2. YOn Mientras tanto preparar las siguientes soluciones. Preparar 1 l de solución de cardioplejía (NaCl 110 mM, 16 mM KCl, 16 mM _MgCl2, 1,5 mM CaCl _2, 10 mM _NaHCO3) y el filtro. Además, preparar 2 L de KHB (NaCl 118 mM, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,7 mM MgSO _4, 2 mM Na-piruvato, dextrosa 6 mM, 24,9 mM NaHCO ₃ (pre-aireada con CO ₂₎ , 1,4 mM CaCl ₂ (añadido pasado). Una vez disuelto, eliminar precipitados por filtración en un matraz de vidrio utilizando un embudo sinterizado 5 micras. Coloque un poco en un plato pequeño en hielo para ser utilizado durante la cirugía y el aislamiento.
3. Oxigenar el líquido de perfusión (KHB) con 95% de _O2 / 5% de CO ₂ durante al menos 30 min antes de su uso. Sistema Perfuse Langendorff con KaJaB para eliminar cualquier resto de agua del sistema y tampón de reserva. Para los ratones, ajustar la velocidad inicial de la bomba a ~ 2,0 ml / min. Coloca 2-0 y 4-0 suturas de seda cerca de cánula de perfusión. Haga funcionar la bomba hasta que el tubo y el aparato se llenan ingenioh perfundido y garantizar la strup burbuja se llena de líquido de perfusión.
   NOTA: Para largos períodos de perfusión y función estable se recomienda instalar un filtro de fibra de vidrio en línea (~ 1 m) en el circuito de perfusión, a percibir los precipitados que podrían formar coágulos en el corazón

3. Ratón Cirugía

3.1) Ratón Anestesia y Manejo

1. Prepare la jeringa con la dosis de anestesia de 80 mg / kg de ketamina y 5 mg / ml mezcla de xilazina, y añadir estéril al 0,9% de solución salina para que aparezca volumen a 0,2 ml. Inyectar heparina IP (50 l de solución de 1000 U / ml).
2. Coloca el ratón de nuevo en contenedor de transporte (~ 10 a 20 min) y esperar a que se pierda la conciencia como la heparina en vigor. Periódicamente hacer una pizca dedo del pie para controlar el dolor reflejo.

3.2) Remover el Corazón

1. Una vez que el ratón es totalmente inconsciente y no responde a pizca dedo del pie, asegurar a una mesa de operaciones apropiado usando alfileres o 25 G puntas de jeringa a través de las extremidades. Realizar una toracotomía para exponer el corazón. Corte un pequeño agujero justo debajo del esternón y extender el corte a los lados del ratón evitando el diafragma.
2. Cortar rápidamente el diafragma y luego se corta rápidamente por los lados de la caja torácica. Voltear hacia atrás de la caja torácica como una concha de almeja para exponer la cavidad torácica. Sujete con suavidad el corazón, coloque unas tijeras debajo y quitar el corazón.
   NOTA: Es esencial para eliminar rápidamente el corazón una vez que se expone en la cavidad torácica y los pulmones no son funcionales.

3.3) Limpiar el Corazón

1. Coloque el corazón en el plato que contiene hielo KaJaB frío y recortar los trozos grandes de tejido pulmonar adjuntos. Utilice pinzas para recoger el corazón y localizar la aorta. Apriete suavemente el corazón y buscar sangre que aparece, ya que este debe ser el extremo abierto de la aorta. Utilice unas pinzas de punta fina para mantener el corazón por el extremo abierto de la aorta.

e "> 4. Montaje del Corazón, A partir de perfusión, y colocar el globo

4.1) Montaje y canulación del Corazón

1. Antes de transportar el corazón al aparato Langendorff, encender la bomba de asegurar que la presión de perfusión es baja (~ 20 mmHg). Mantenga el corazón por la aorta justo debajo de la cánula. El uso de otro conjunto de pinzas de punta fina, abra cuidadosamente la aorta y deslice corazón para arriba sobre la cánula. Mantenerlo en su lugar con un juego de pinzas y luego usar un clip de bordes suaves para asegurar temporalmente a la cánula.
   NOTA: montaje rápidamente el corazón a la cánula de perfusión es crítico para una buena preparación. Con la experiencia, los procedimientos de apertura de la cavidad torácica, hasta el montaje del corazón deben tomar entre 1 y 2 minutos.
2. Ate e iniciar la perfusión de la siguiente manera, utilizando 4-0 sutura de seda aorta seguro a la cánula directamente debajo del clip. Asegúrese de que el empate es también alrededor de la cánula aórtica de metal, por lo que la aorta no quede amarrado al apretarel nudo. Una vez que un empate se coloca con firmeza, quite el clip.
3. Use suturas de seda adicionales para sujetar la aorta con seguridad a la cánula asegurándose de atar abajo las ramas de los vasos que pueden estar saliendo de la aorta. Estos a menudo se pueden observar por fugas de perfusión o disparar hacia fuera de la aorta.
   NOTA: Durante las etapas iniciales de la perfusión de la sangre debe ser lavado con el corazón y el corazón entero debería aparecer un color rosa suave. Decoloraciones oscuras que no se lavan a cabo indican áreas isquémicas probablemente debido a la embolia de aire o coágulos y el corazón no debe ser utilizado.

4.2) El establecimiento de Medición de perfusión y LVP

1. Poco a poco aumentar la presión de perfusión y aumentar la velocidad de la bomba hasta que la presión de perfusión llega a 70 mmHg.
   NOTA: Las presiones de perfusión estándar para la perfusión del ratón pueden ser 70 a 90 mmHg, pero debe mantenerse constante de animal a animal dentro de un experimento.
2. Limpiar el tejido restante (pulmón, tiroides etc.) Que todavía puede estar unido al corazón. Utilice unas tijeras para cortar la aurícula izquierda con el fin de crear una abertura en el ventrículo izquierdo.
3. Coloque el globo en el soporte y desinflar. Coloque la cánula globo cerca de la cánula aórtica, directamente sobre la abertura en el ventrículo izquierdo. Inserte cuidadosamente el globo a la baja en el ventrículo izquierdo mientras mantiene el corazón en su lugar para la aorta no se rompa.
4. Una vez que está en su lugar lentamente comenzar a inflar el globo hasta que la PTDVI alcanza ~ 8 mmHg. Coloque la sonda de temperatura contra la parte inferior del corazón por lo que mide la temperatura del efluente.

4.3) Medición Basal

1. Sellar el corazón en una cámara de perfusión con camisa de agua. Durante este tiempo perfundir continuamente el corazón con KHB, y asegúrese de que la temperatura sigue aumentando. Controlar la temperatura y ajustar el baño de agua en consecuencia hasta que alcanza aproximadamente ~ 37 ºC.
   NOTA: Control temperatUre en las fases iniciales de la perfusión es fundamental como flujos coronarios y, posteriormente, la temperatura puede variar de corazón a corazón. Temperatura del perfundido efluente se monitorizó para la temperatura deseada del miocardio a través de una sonda de temperatura colocado en el ápice del corazón. Además, en comparación con otros protocolos de perfusión Langendorff, el corazón no está sumergido en el CP o KaJaB durante la perfusión o arresto, esto se hace principalmente para ajustar rápidamente la temperatura, así como proporcionar la entrega CP eficiente sin difusión.
2. Comenzar a grabar de forma continua la medición funcional utilizando un sistema de adquisición de datos conectado a los sensores apropiados, incluyendo la presión de perfusión, la presión ventricular izquierda (transductor de presión conectado a LVP globo), la temperatura y los parámetros electrofisiológicos (EKG, MAP si está equipado) (apego será de acuerdo a los fabricantes y específica a los sensores individuales y sistema de adquisición de datos). Una vez que el efluente KHB llega a ~ 37 ºC durante al menos 15 min y parámetros funcionales cardíacos son estables, tenga en cuenta el momento de las mediciones de referencia.
   NOTA: Los criterios de inclusión / exclusión se aplican a cada corazón. Un LVDP de <60 mmHg al inicio del estudio indica un corazón que debe ser removido de su análisis. Además, el flujo coronario> 4,5 ml / min, o incapacidad para mantener la presión de perfusión al inicio del estudio probablemente indica una fuga o aorta desgarrado. También cualquier corazones que tienen áreas claras isquémicos que pueden ser confirmados visualmente (es decir, coágulos) o reducciones de isquemia asociada exhiben en la función cardiaca (es decir, el aumento de PDFVI, extremadamente arrítmico) se eliminan del análisis.
3. Medir el flujo coronario a través de la colección del efluente coronario en un cilindro graduado de 1 min. Cierre de la cámara y permitir la temperatura y función para volver a los valores basales. Alternativamente medir el flujo coronario de forma continua en la línea de perfusión a través de una sonda de flujo colocado después del circuito de descarga de presión.

"> 5. Iniciación cardioplégico Arresto

1. Colocar 100 ml de tampón de cardioplegia fría en otro depósito y. transferir el depósito cánula KHB al depósito de cardioplegia.
2. Separe la carcasa con camisa de agua y el circuito de calentamiento de la perfusión del baño de agua caliente y conectarse a la máquina refrigerante utilizando tubería desconexiones rápidas. Utilice calefacción y refrigeración circuladores independientes para permitir cambios rápidos de temperatura del corazón y perfusión.
3. Siga la burbuja de aire que consigue introduce en el tubo durante el interruptor, y una vez que alcanza cerca del corazón aislado iniciar la temporización para cardioplegia. Entregar cardioplejía durante 2 min. Después de la dosis inicial parar la bomba. Asegúrese de detener el corazón en diástole y estar cerca de la temperatura CP deseada.
   NOTA: Una trampa de burbujas suficiente es necesario para evitar embolias de aire en el corazón. Alternativamente, un sistema de suministro para ambos depósitos conmutadas por una llave de paso puede ser construido fácilmente, sin embargo encontramos seguiring la pequeña burbuja de aire que se introduce cuando el intercambio de la cánula entre los depósitos, un método fácil de la entrega CP momento dado potencialmente diferentes velocidades de la bomba entre los experimentos (es decir, debido a ratón / rata, la presión de perfusión, la resistencia del filtro, etc.)
4. Mantener el corazón en cardioplejía durante 2 horas a ~ 20 ºC. Cada media hora durante la CP encender la bomba de nuevo durante 1 minuto por lo que se administra otra dosis.
   NOTA: dosis intermitentes de CP cada 30 min resultados en el deterioro funcional del corazón sin necrosis del tejido. Los períodos más largos entre las dosis de CP (es decir,> 45 min) pueden dar lugar a la necrosis y la contractura isquémica y sería más apropiado para un modelo de lesión necrótica asociada a la isquemia sin protección.

6. La reperfusión

1. Al final de CP, transferir la cánula depósito de vuelta a la oxigenada KHB. Conectar los circuitos de control de temperatura en el termostato de calefacción y encienda la bombaa comenzar la reperfusión. En este punto el cardioplejia hace desaparecer, observar el aumento de la temperatura y el corazón comienza a latir de nuevo después de 2-4 min de reperfusión. Cuando se inicia el corazón el latido del corazón es lento ya menudo arrítmico.
   NOTA: Por lo general, no es un gran aumento de la LVP diastólica (es decir, aumento ≤10 mmHg), que suele ser característico en modelos de isquemia puros. Las arritmias pueden persistir hasta bien entrada la reperfusión y en ocasiones tendrán el corazón para ser desfibrilación. Esto se puede lograr con el uso de un conjunto estimulador a voltajes más altos (~ 10-50 V) y electrodos colocados en la base y el ápice del corazón.
2. Permitir que el corazón reperfundir durante 30 min, y durante este período de tiempo tomar mediciones del flujo coronario según sea necesario. Medir el flujo coronario por recoger el efluente con un cilindro graduado durante 30-60 seg.

7. Recolección de Tejidos

1. Desinflar el globo y retirarlo desde el ventrículo izquierdo. Tome el corazón de lacánula y pesarlo. En los experimentos iniciales, al menos una rebanada transversal del corazón debe ser tomado y TTC tiñe para evaluar necrosis para asegurar que el corazón está libre de cualquier lesión necrótica.
2. Recoger las rebanadas del corazón para los estudios de microscopía, pesos húmedo / seco, etc. El resto o todo el corazón debe congelarse rápidamente colocando en nitrógeno líquido. Tienda corazones congelados en un congelador de -80 ºC.
   NOTA: Para la medición de compuestos de fosfato de alta energía (es decir, el ATP, fosfato de creatina), los corazones se debe congelar inmediatamente.

Resultados

La Figura 1 presenta los resultados típicos de un experimento del ratón. LVP (línea roja), dP / dt (línea verde), y la temperatura (línea morada) se registraron continusouly sobre ~ 3 horas. Las letras indican a - medida de referencia, b, c, d, e - la entrega de la solución de cardioplejía, f - inicio de la reperfusión, g, h, i, j - medición de flujo cornary durante la reperfusión. Nota, LVDP deprimido y dP / dt en la reperfusión en comparación con la línea base. Figura 1B ...

Discusión

Los métodos de detalles de protocolo precedentes para evaluar el aturdimiento miocárdico secundaria a isquemia global asociado con parada cardiopléjica. En nuestras manos este protocolo produce una reducción aproximada del ~ 40% de la función cardíaca (LVDP, +/- dP / dt) con cambios mínimos en la frecuencia cardíaca en el punto de tiempo posterior a la reperfusión 30 min. A medida que el corazón está reperfunde y recalentado todos los parámetros de la función cardíaca se reducen en los puntos iniciales de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures