Murin isolé Modèle de Cœur de sidération myocardique liée à l'arrêt cardioplégique

Résumé

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Résumé

Le protocole suivant est d'usage pour évaluer la fonction cardiaque altérée ou des insultes ischémiques modérés suivants magnifique myocarde. La technique est utile pour la modélisation de la lésion ischémique associée à de nombreux phénomène cliniquement pertinents, y compris la chirurgie cardiaque avec arrêt cardioplégique et la circulation extracorporelle, un pontage coronarien à cœur battant, la transplantation, l'angine de poitrine, l'ischémie brève, etc. Le protocole présente un procédé général pour modéliser hypothermique arrêt cardioplégique hyperkaliémique et la reperfusion dans le cœur de rongeurs de focalisation sur la mesure de la fonction contractile du myocarde. En bref, un coeur de la souris est perfusé en mode Langendorff, instrumenté avec un ballon intraventriculaire, et les paramètres fonctionnels cardiaques de base sont enregistrées. Après la stabilisation, le cœur est ensuite soumis à informer perfusion d'une solution de cardioplégie hypothermique cardioprotecteur pour initier arrestation diastolique. Cardioplégie est livré par intermittence pendant 2 h. Le cœur est alors reperfusé et warmed à des températures normothermiques et la récupération de la fonction myocardique est surveillée. Utilisation de ce protocole les résultats de la fonction contractile cardiaque fiable déprimé exempts d'attaques de brut tissu myocardique chez les rongeurs.

Introduction

La sidération myocardique est défini comme une activité contractile réduite réversibles malgré la restauration du flux sanguin adéquat après une brève période d'ischémie ou de longues périodes de lésions ischémiques avec cardioprotection ^1,2,3,4,5. La méthode présentée est spécifiquement utilisé pour modéliser insultes ischémiques cliniquement pertinentes qui peuvent entraîner des troubles réversibles de la fonction contractile (ie, accidents ischémiques associés à la chirurgie cardiaque en utilisant un arrêt cardioplégique, de brèves périodes d'ischémie, l'angine de poitrine, etc.). Contrairement aux études d'ischémie graves (infarctus du myocarde, la nécrose) ce protocole a été développé pour évaluer la récupération fonctionnelle du myocarde et cardioprotection sans lésion tissulaire, la rénovation, et la mort cellulaire. La majorité de l'article discute un protocole d'arrêt cardioplégique standard avec des éléments similaires à une chirurgie cardiaque en utilisant l'hypothermie et la livraison de cardioplégie intermittente.

Prot myocardeection pendant la majorité des chirurgies cardiaques repose sur cardioplégie et la circulation extracorporelle. Bien cardioplégie (CP) des solutions et des stratégies varient largement (sang, cristalloïde, froid, chaud, etc.) les éléments les plus communs sont: 1) l'hyperkaliémie et / ou d'autres stratégies pour arrêter le coeur en diastole, limitant ainsi l'utilisation de l'énergie résultant de la contraction myocardique, et 2) l'hypothermie pour ralentir le métabolisme et aider à maintenir l'ATP et d'autres réserves d'énergie tout arrêté. Solutions de cardioplégie actuelles fournissent une protection au cœur contre les insultes ischémiques qui seraient autrement prouver mortel. Cependant, les stratégies cardioprotecteurs pendant insultes ischémiques chirurgicales ne sont pas parfaits, et la lésion ischémique légère résultante peuvent entraîner réversible dysfonction contractile cardiaque malgré un débit sanguin adéquat (sidération myocardique), l'acidose, dégâts des cardiomyocytes, et les effets vasculaires, y compris la perfusion coronaire réduite et vasospasme.

Ce protocole diffèreà partir de modèles d'ischémie cardiaque isolés standards d'évaluation infarctus du myocarde et ischémie sévère en ce qu'il évalue plus douces insultes ischémiques qui peut entraîner une insuffisance cardiaque après une brève ischémie ou d'accidents ischémiques associés à un arrêt cardioplégique. (Pour une revue sur les techniques de perfusion de Langendorff et I / études de R voir ^{6 - 8).} Pour les lignes directrices générales et une analyse approfondie des paramètres expérimentaux liés à la souris coeurs isolés perfusés voir Sutherland e t al., 2003 ⁹ La technique présentée ici Détails de l'équipement nécessaire, des réactifs, des mesures, des stratégies et des conseils pour induire de manière fiable magnifique dans les cœurs de souris. Des modifications mineures sont nécessaires pour appliquer la technique à des rats.

Brièvement coeurs de souris isolé de Langendorff perfusés sont environ 30 min avec un tampon physiologique de Krebs-Henseleit (KHB), suivis par un arrêt cardiaque protégé du froid par délivrance d'une hypothermie hyperkaliémiqueic solution de cardioplégie. Après l'arrestation, la récupération fonctionnelle cardiaque est surveillée pendant le réchauffement et la reperfusion du cœur avec KHB. Les changements dans le degré de récupération de la fonction contractile cardiaque peuvent être évaluées afin de déterminer agents cardioprotecteurs et différentes stratégies de cardioprotection.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité pour les Animaux institutionnel Lifespan soin et l'utilisation et tous les animaux et les procédures selon le Guide du Conseil national de recherche pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire ^10.

1. Fabrication et Balloon ventriculaire gauche surveillance de la pression Circuit

1. Construire ballons LV selon Miller et al. ¹¹ Dans un bêcher avec une barre d'agitation, mélanger 9,5 ml d'eau distillée, 14,2 ml de sirop de maïs léger et 33,8 g de saccharose, et de la chaleur sur une plaque chaude, mélanger jusqu'à ce que le sucre soit dissous . Continuer solution de chauffage jusqu'à ce qu'il atteigne environ 150 ºC.
   NOTE: De nombreuses méthodes existent pour construire des ballons BT y compris la modification de conseils de préservatifs et la construction de film étirable ^9,12. Nous trouvons la méthode ci-dessus pour être relativement facile de construire des ballons sans fuite, mais un avantage de cling ballons de films comprend la caractérisation précédente pour fré appropriéerelations cy-réponse ^9.
2. Casser brins de spaghetti secs en morceaux d'environ 5 cm de longueur et tremper un côté de chaque morceau d'environ 1 cm de profondeur dans la solution de sucre et retirer lentement.
3. Placez l'extrémité sèche de la bande de pâte dans un bloc de mousse de polystyrène et de suspendre ainsi le mélange de sucre dégouline et forme un moule en forme de larme. Laissez O / N dans un dessiccateur de sorte que le moule durcit.
4. Le lendemain, tremper les moules en gel de dispersion de silicone. Placez brins de pâtes de nouveau dans polystyrène bloc de mousse et le placer dans le four aa 37 ºC pendant 2 heures ou jusqu'à ce que sec. Répétez cette étape une fois de plus donc deux couches de silicone sont appliqués.
5. Une fois sec, le placer dans l'eau pendant plusieurs heures pour aider à l'enlèvement de ballon du moule. des ballons de magasins dans une solution de l'azide de sodium à 0,02%.
6. Utilisez une collecte de sang de 23 G mis à produire une canule à ballonnet personnalisé en coupant une aiguille pour créer une pointe émoussée et en plaçant des encoches dans l'aiguille.
7. Branchez le tuyau à une pression transproducteur et rincer avec de l'eau tout en gardant un tube et la canule complètement immergés pour empêcher l'air de pénétrer dans le système. Placez un ballon qui a été rempli avec de l'eau sur la canule et utiliser 2-0 sutures de soie à nouer sur la canule. ballon d'essai par la capacité à maintenir la pression (~ 100 mmHg pour au moins 1 heure)

2. Préparation du système de perfusion isolée Coeur

1. Initialement, laver et réchauffer le système. Tourner sur un circulateur d'eau chaude 37 ºC de bain qui a été relié à l'appareil de Langendorff, et remplir le réservoir tampon avec de l'eau distillée. Branchez un nouveau filtre en fibre de verre pour tubes circulant dans l'appareil et tourner sur la pompe à débusquer le système. Pendant le temps de préparation, de surveiller la température de l'eau expulsée à partir du bloc de Langendorff en utilisant une sonde de température, pour faire en sorte que le bain d'eau est réglée avec précision. Aussi, tourner sur un circulateur réfrigérée et mettre à 20 ºC qui sera utilisé lors de l'arrestation cardioplégique du cœur.
2. JEn attendant préparer les solutions suivantes. Préparer une L de solution de cardioplégie (NaCl 110 mM, KCl 16 mM, 16 mM de _MgCl2, 1,5 mM de _CaCl2, 10 mM de NaHCO ₃₎ et le filtre. Aussi, préparer 2 L de KHB (NaCl 118 mM, 4,8 mM de KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,7 mM MgSO _4, 2 mM de Na-pyruvate, le dextrose 6 mM, 24,9 mM NaHCO ₃ (pré-aéré avec du CO ₂₎ , 1,4 mM de _CaCl2 (ajoutée dernière). Une fois dissous, éliminer les précipités par filtration dans un flacon en utilisant un verre de 5 um entonnoir fritte. Mettre un peu dans un petit plat sur ​​la glace pour être utilisé lors de la chirurgie et de l'isolement.
3. Oxygéner le liquide de perfusion (KHB) avec 95% O _2/5% CO ₂ pendant au moins 30 min avant utilisation. Système Perfuse Langendorff avec KHB pour enlever l'eau restant dans le système et le tampon réservoir. Pour les souris, régler la vitesse de la pompe initiale à ~ 2,0 ml / min. Placez 2-0 et 4-0 sutures de soie près de perfusion canule. Faire fonctionner la pompe jusqu'à ce que le tube et l'appareil sont remplis d'esprith de perfusion et d'assurer la strup bulle est rempli de liquide de perfusion.
   NOTE: Pour de longues périodes de perfusion et de la fonction stable, il est fortement recommandé d'installer un filtre en fibre de verre en ligne (~ 1 pm) dans le circuit de perfusion pour collecter les précipités qui pourraient former des caillots dans le cœur

3. Chirurgie Souris

3.1) Souris anesthésie et de Manutention

1. Préparer seringue avec la dose anesthésique de 80 mg / kg de kétamine et 5 mg / ml de xylazine mélange, et ajouter une solution saline stérile à 0,9% pour élever le volume à 0,2 ml. Injecter IP héparine (50 pl de 1 000 U / ml de solution).
2. Placez la souris dans le contenant de transport (~ 10-20 min) et attendre de lui faire perdre la conscience que l'héparine prend effet. Périodiquement faire une pincée de pointe pour surveiller réflexe de la douleur.

3.2) Retirez le coeur

1. Une fois que la souris est totalement inconscient et ne réagit pas à pincement de l'orteil, le fixer sur une table d'opération approprié à l'aide des broches ou 25 G embouts de seringue à travers les extrémités. Effectuez une thoracotomie pour exposer le coeur. Couper un petit trou juste en dessous du sternum et d'étendre la coupe sur les côtés de la souris en évitant le diaphragme.
2. Couper rapidement le diaphragme et puis couper rapidement sur les côtés de la cage thoracique. Retourner en arrière de la cage thoracique comme une coquille de palourde pour exposer la cavité thoracique. Saisissez doucement le cœur, placer des ciseaux en dessous et retirez le cœur.
   NOTE: Il est essentiel d'éliminer rapidement le coeur une fois qu'il est exposé dans la cavité thoracique et les poumons ne sont pas fonctionnelles.

3.3) Nettoyez le cœur

1. Placez le coeur dans le plat contenant de la glace KHB froid et couper les gros morceaux de tissu pulmonaire attachés. Utilisez une pince pour ramasser le cœur et localiser l'aorte. Pressez doucement le cœur et rechercher tout sang qui apparaît, comme cela devrait être l'extrémité ouverte de l'aorte. Utilisez des pinces fines de pointe pour maintenir le coeur par l'extrémité ouverte de l'aorte.

e "> 4. Montage du Coeur, à partir de perfusion, et en plaçant le ballon

4.1) Montage et cannulating Cœur

1. Avant de transporter le cœur de l'appareil de Langendorff, tourner sur la pompe veiller à ce que la pression de perfusion est faible (~ 20 mmHg). Maintenez le cœur par l'aorte juste sous la canule. Utilisation d'un autre ensemble de fines pinces de pointe, ouvrir avec précaution l'aorte et faites glisser cardiaque sur la canule. Maintenez-le en place avec un jeu de pinces et ensuite utiliser un soft clip tranchant pour fixer temporairement à canule.
   NOTE: le montage rapidement le cœur de la canule de perfusion est critique pour une bonne préparation. Avec l'expérience, les procédures de l'ouverture de la cavité thoracique jusqu'à ce que le montage du cœur devraient prendre entre 1 et 2 min.
2. Attachez et initier perfusion comme suit, en utilisant 4-0 suture de soie aorte sécurisé à la canule directement sous le clip. Vérifiez que la cravate est également autour de la canule aortique en métal, donc l'aorte ne soit pas liée au large lors du serragele noeud. Une fois un match nul est fermement placé, retirer le clip.
3. Utilisez des sutures en soie supplémentaires pour fixer l'aorte en toute sécurité à la canule en veillant à attacher sous les branches des vaisseaux qui peuvent être à venir l'aorte. Ceux-ci peuvent souvent être repérés par les fuites de perfusion ou le tir à partir de l'aorte.
   NOTE: Durant les étapes initiales de la perfusion artérielle doit être lavait du cœur et l'ensemble du coeur devrait apparaître une couleur rose tendre. Décolorations sombres qui ne lavent indiquent les zones ischémiques probablement due à des embolies ou caillots air et le coeur ne doit pas être utilisé.

4.2) Établir perfusion et LVP mesure

1. Lentement augmenter la pression de perfusion et d'augmenter la vitesse de la pompe jusqu'à ce que la pression de perfusion atteint 70 mmHg.
   NOTE: pressions de perfusion standard pour perfusion de la souris peuvent être 70-90 mmHg, mais doit être maintenue constante d'un animal à l'intérieur d'une expérience.
2. Nettoyez le tissu restant (poumon, thyroïde, etc.) Qui peut encore être fixé à cœur. Utilisez des ciseaux pour couper les oreillettes gauche afin de créer une ouverture dans le ventricule gauche.
3. Placez le ballon sur le support et dégonfler. Positionner la canule à ballonnet à proximité de la canule aortique, directement au-dessus de l'ouverture dans le ventricule gauche. Insérez soigneusement ballon vers le bas dans le ventricule gauche tout en maintenant le cœur en place pour l'aorte ne se déchire pas.
4. Une fois qu'il est en place lentement commencer à gonfler le ballon jusqu'à ce que le LVEDP atteint ~ 8 mmHg. Placer la sonde de température contre le fond du coeur de sorte qu'il mesure la température de l'effluent.

4.3) Mesure Basal

1. Sceller le coeur dans une chambre de perfusion de chemise d'eau. Pendant ce temps perfuser constamment le cœur avec KHB, et de veiller à ce que la température continue d'augmenter. Surveiller la température et régler le bain d'eau en conséquence jusqu'à ce qu'il atteigne environ ~ 37 ºC.
   NOTE: temperat surveillanceure dans les phases initiales de perfusion est essentiel que les flux coronaires et ensuite la température peut varier de cœur à cœur. Température de l'effluent liquide de perfusion est surveillé pour la température souhaitée par l'intermédiaire d'un infarctus une sonde de température placée à l'apex du cœur. En outre, en comparaison à d'autres protocoles de perfusion de Langendorff, le cœur ne immergé dans CP ou KHB pendant la perfusion ou l'arrestation, cela est principalement fait pour régler rapidement la température ainsi que de fournir la prestation de CP efficace sans diffusion.
2. Commencer à enregistrer en continu la mesure fonctionnelle en utilisant un système d'acquisition de données attaché à des capteurs appropriés, y compris la pression de perfusion, la pression ventriculaire gauche (capteur de pression attaché à LVP ballon), de la température, et les paramètres électrophysiologiques (ECG, CARTE si équipé) (pièce jointe sera selon les constructeurs et spécifique pour les différents capteurs et le système d'acquisition de données). Une fois que le KHB effluents atteint ~ 37 ºC pendant au moins 15 min et les paramètres fonctionnels cardiaques sont stables, noter le temps pour les mesures de base.
   NOTE: critères d'inclusion / exclusion sont appliqués à chaque cœur. Un LVDP de <60 mmHg à base indique un cœur qui doit être supprimé à partir de l'analyse. En outre, le débit coronaire> 4,5 ml / min, ou de l'incapacité à maintenir la pression de perfusion au départ indique probablement une fuite ou l'aorte déchirée. Aussi des cœurs qui ont des zones claires ischémiques peuvent être confirmés visuellement (c.-à-caillot) ou des réductions d'ischémie-associé exposition de la fonction cardiaque (par exemple, l'augmentation LVEDP, extrêmement arythmique) sont retirés de l'analyse.
3. Mesurer le débit coronaire via la collecte de l'effluent coronaire dans une éprouvette graduée pendant 1 min. Fermez la chambre et laisser fonctionner la température et de revenir aux valeurs de base. Alternativement mesurer le débit coronaire en continu dans la ligne de perfusion via une sonde d'écoulement placé après le circuit de décharge de pression.

"> 5. Initiatrice cardioplégique arrestation

1. Placer 100 ml de tampon de cardioplégie froide dans un autre réservoir, et. transférer la canule KHB réservoir vers le réservoir de cardioplégie.
2. Détachez le boîtier de chemise d'eau et le circuit de réchauffement de perfusion du bain d'eau chaude et de vous connecter à l'aide de tubes circulateur réfrigérée raccords rapides. Utilisez chauffage et de refroidissement circulateurs séparés pour permettre des changements rapides de température du cœur et de perfusion.
3. Suivez la bulle d'air qui obtient introduit dans le tube pendant l'interrupteur, et une fois qu'il atteint près du coeur isolé commencer le calendrier de cardioplégie. Livrer cardioplégie pendant 2 min. Après la dose initiale arrêter la pompe. Assurez-vous d'arrêter le coeur en diastole et être proche de la température de CP souhaité.
   NOTE: Un piège à bulles suffisante est nécessaire pour éviter les embolies d'air dans le cœur. Alternativement, un système de livraison pour les deux réservoirs commutés par un robinet d'arrêt peut être facilement construit, mais nous trouvons suivreing la petite bulle d'air qui est introduit lorsque l'échange de la canule entre réservoirs, une méthode facile de la prestation de CP de synchronisation donnée vitesses de pompe potentiellement différents entre expériences (c., en raison de la souris / rat, la pression de perfusion, la résistance du filtre, etc.)
4. Garder le coeur en cardioplégie pendant 2 h à ~ 20 ° C. Chaque demi-heure au cours de CP tourner la pompe en marche pendant 1 min donc une autre dose est administrée.
   REMARQUE: des doses intermittentes de CP toutes les 30 min dans les résultats de la déficience fonctionnelle du cœur sans nécrose du tissu. Des périodes plus longues entre les doses de CP (à savoir,> 45 min) peuvent aboutir à une nécrose et contracture ischémique et serait plus approprié pour un modèle de lésion nécrotique associée à l'ischémie non protégés.

6. reperfusion

1. A la fin du CP, transférer la canule du réservoir vers le KHB oxygéné. Connecter les circuits de contrôle de la température du circulateur de chauffage et tourner la pompeà commencer reperfusion. À ce stade de la cardioplégie délave, observer la montée en température et le cœur commence à battre de nouveau après 2-4 min de reperfusion. Quand le cœur commence le battement de coeur est lent et souvent arythmique.
   NOTE: Il est généralement pas une forte hausse diastolique LVP (c.-à-≤10 hausse mmHg) qui est souvent caractéristique des modèles d'ischémie pures. Arythmies peuvent persister bien dans reperfusion et parfois le cœur devront être défibrillation. Ceci peut être obtenu avec l'utilisation d'un ensemble de stimulateur à des tensions plus élevées (~ 10 à 50 V) et des électrodes placées à la base et l'apex du cœur.
2. Laisser le cœur à la reperfusion pendant 30 minutes, et pendant cette période de temps de prendre des mesures de débit coronaires que nécessaire. Mesurer le flux coronarien en recueillant l'effluent avec une éprouvette graduée pour 30-60 sec.

7. Collecte des tissus

1. Dégonfler le ballon et le retirer du ventricule gauche. Prenez le cœur au large de lacanule et le peser. Dans des expériences initiales, au moins une tranche transversale du cœur doit être prise et TTC teinté d'évaluer la nécrose de veiller à ce que le coeur est libre de toute blessure nécrotique.
2. Recueillir tranches cardiaques pour les études de microscopie, poids humide / sec, etc. Le reste ou tout cœur doivent être congelés rapidement en plaçant dans l'azote liquide. Magasin coeurs congelés dans un congélateur -80 ºC.
   NOTE: Pour la mesure des composés de phosphate de haute énergie (c.-à-ATP, créatine phosphate), le cœur doit être congelé immédiatement.

Résultats

La figure 1 présente des résultats typiques d'une expérience de la souris. LVP (ligne rouge), dP / dt (ligne verte), et la température (ligne violette) ont été continusouly enregistré plus de ~ 3 h. Les lettres indiquent un - mesure de base, b, c, d, e - la livraison de la solution de cardioplégie, f - début de la reperfusion, g, h, i, j - mesure du débit cornary pendant la reperfusion. Remarque, LVDP déprimé et dP / dt la reperfusion par rapport au scénario de référence. Figu...

Discussion

Les détails du protocole méthodes précédentes pour évaluer la sidération myocardique secondaire à l'ischémie globale liée à l'arrêt cardioplégique. Dans nos mains ce protocole produit une participation d'environ ~ 40% de réduction de la fonction cardiaque (LVDP, +/- dP / dt) avec des changements minimes de la fréquence cardiaque à la post-reperfusion point de temps de 30 min. Comme le cœur est reperfusé et réchauffé tous les paramètres de la fonction cardiaque sont réduits à des points ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures