調製とキャラクタリゼーション個々のとマルチ薬ロード物理的に捕捉さ高分子ミセル

要約

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

要約

polyethyleneglycol- ブロック -polylactic酸（PEG-B-PLA）のような両親媒性ブロックコポリマーは、水性環境中の親水性シェルによって囲まれた疎水性コアを形成し、その臨界ミセル濃度以上のミセルに自己組織化することができます。これらのミセルのコアは、ドセタキセル（DTX）とエベロリムス（EVR）のような疎水性、水難溶性薬物をロードするために利用することができます。ミセル構造と薬物負荷能力の体系的特徴付けを行うことができ、 インビトロおよびインビボ研究の前に重要です。本明細書に記載されたプロトコルの目的は、標準化されたミセル生成物を達成するの​​に必要な特性評価手順を提供することにあります。 DTXとEVRはそれぞれ、これらのミセルの調製は、それぞれ、1.86および1.85 mg / mlの、にDTXとEVRの水溶性を増加させ、溶媒キャスティングを介して達成することができるML / 1.9と9.6μgの固有の溶解度を有します。 evalのミセル中の薬物安定性48時間にわたって室温でuatedは、薬物の97％以上が溶液中に保持されていることを示しています。ミセルのサイズは、動的光散乱法を用いて評価し、これらのミセルの大きさが50nm未満であったポリマーの分子量に依存することが示されました。ミセルからの薬物放出は、48時間にわたって37℃で^O pH7.4のシンク条件下で透析を用いて評価しました。カーブフィッティングの結果は、薬物の放出は、それが拡散が駆動されることを示す一次プロセスによって駆動されることを示します。

概要

親水性および疎水性ドメインからなる繰り返し構造を有する両親媒性ブロック共重合体は自発的に重合体ミセルとして知られている三次元の高分子集合体を形成するために自己組織化することができます。これらの構造は、親水性シェルによって囲まれた内側の疎水性コアを有します。疎水性コアは、ポリマー骨格上に疎水性相互作用を介して、または化学結合により物理的捕捉のいずれかによって疎水性薬物を組み込む能力を有している^。1、多くの利点は、薬物送達のためのミセルを形成するために、これらのブロックコポリマーを使用して存在します。これらは難溶性薬物、組み込まれた薬物の薬物動態を改善し、生体適合性および/ ​​またはポリマーの生分解性の組み込みは、従来の可溶化剤への安全な代替なり含む²高分子ミセルを使用する別の利点は、15-間に、それらのコロイド粒子のサイズであります150nmの^3、PAのためにそれらが魅力的renteral配信。このため、過去20年間にポリマーミセルは、特に、癌治療のための難水溶性薬物のための実行可能な薬物送達システムとして浮上している^。3,4

現在臨床試験を受けている癌治療のための5つの高分子ミセル製剤がある。最後にポリエチレンオキシドを含むトリブロック共重合体であるが、臨床試験中でミセルの⁴つは、PEGベースのジブロックコポリマーです。これらのミセルのサイズは、85ナノメートル、20ナノメートルから変化しました。 PEGベースのポリマーを使用することの利点は、その生体適合性であり、第二のブロックに応じて、また生分解性であることができます。 polyethyleneglycol- ブロック -polylactic酸（-pla PEG- B）高分子ミセルに基づいて、最近、新しい薬物送達システムは、複数の抗癌剤の同時送達のために開発されています。 PEG-B-PLAミセルは、生体適合性および生分解性の両方です。ロードされたミセルのように示されているこれらの多剤ynergistic インビトロおよびインビボ ^2,5,6- における異なる癌モデルの阻害および抵抗を防止するために化学療法で複数の薬物を利用し、毒性を低下させる現在のパラダイムに適合。したがって、癌および他の疾患状態において使用するためのこれらのミセルの薬物送達システムを調製し、特徴付けるにおける大きな関心があります。

私たち以下の作業では、このようなミセルが関心の疾患状態でそれらを評価する前に準備し、特徴付けすることが可能なステップバイステップのプロセスを概説しています。この研究の目的のために2難溶性の抗がん剤は、ドセタキセル（DTX）及びエベロリムス（EVR）が選択されています。 DTXとEVRの両方がそれぞれML / 1.9と9.6μgのに固有の水溶解性と難水溶性化合物である。分子量の異なる^7,8-二PEG-Bの -plaポリマーを配合、ポリマーのためのビルディングブロックとして、このプロトコルで使用されていましたミセル、-pla _1800（3800ダ）およびPEG ₄₀₀₀ B - - -pla _2200（6200 Da）でBこれらのポリマーは、PEG ₂₀₀₀です。 PEG-Bの -plaミセルは、したがって、個別に組み合わせてDTXとEVRのためのナノキャリアとしてのユニークなプラットフォームを提供することができます。必要な試薬/材料および装置は、これらのミセルを準備し、特徴づけるために必要な、表1に記載されています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

ソルベントキャスト法により個人およびマルチ薬剤ロードミセルの調製

1. デュアル薬物ミセルのために各1mg（DDM）でDTX 1 mgまたはそれEVR 1ミリグラムまたは両方の薬剤を秤量。
2. PEG ₂₀₀₀の15 mgの秤量- -pla ₁₈₀₀またはPEG ₄₀₀₀ bを - B -pla ₂₂₀₀個人またはDDMのいずれかのために。
3. 薬物/薬物や5ミリリットルの丸底フラスコ中のアセトニトリルと場所の0.5ミリリットル中にポリマーを溶解します。
4. ロータリーエバポレーターを用いて減圧下薬（S） - ポリマーアセトニトリル溶液を蒸発させて、薄い薬物分散ポリマーフィルムを形成します。 100rpmで^、40°Cのウォーターバスの温度とさらに3分間100ミリバールに還元し、5分間260ミリバールの真空圧力に回転蒸発器を設定します。
5. 50 ^O℃で脱イオン水0.5mlを有する薬物-ポリマーフィルムを再水和及び穏やかにミセルを形成するために、フラスコを振盪します。
6. 結果をフィルター1.5ミリリットル遠心管に任意の未溶解した薬物または汚染物質を除去するために0.2μmのナイロンフィルターを通してミセル溶液をる。

逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を用いてミセル中の薬物負荷と安定性の評価2。

1. 1ml /分の流速で0.1％のリン酸および1％のメタノールを含有するアセトニトリル/水の移動相（62/38）を用いてアイソクラチックモードで、40℃で平衡化C8カラムでRP-HPLC分析を行い、 10μlの注入量。
2. 初期薬物負荷を決定するために、RP-HPLCで分析する前に、移動相中の100：新たに調製したミセル（セクション1）1を希釈します。 RP-HPLCにより再評価し、24時間かけてミセル中の薬剤（複数可）の安定性を決定するために、移動相に100希釈したサンプル：ストア希釈していない個々のミセルと48時間室温（25 ^O℃）でのDDMとは、新鮮な1を準備します。
3. それぞれ227および279 nmでのDTXとEVRピークを監視1.7および5.7分の保持時間で、それぞれ。三連ですべての測定を実行します。平均±SD薬物負荷として存在するデータ。

動的光散乱によってミセル粒子サイズの3アセスメント（DLS）

1. 1.5 mg / mlの最終的なポリマー濃度を得るために、1：20の比率で脱イオン水（セクション1に記載したように）新たに調製されたミセルを希釈します。
2. 散乱を決定するために、173℃でHe-Neレーザー（633nm）の強度を測定します。 2分間プレ平衡化した後、25℃ですべての測定を実行します。
3. 三連ですべての測定を実行します。分布の多分散指数（PDI）と共に、平均値±SD Z平均サイズとして存在するデータ。

個々のミセルとDDMから4次評価でのインビトロ薬物放出

1. ミセルの1ロード2.5ミリリットルがで3ミリリットル透析カセットにセクションで説明したように、個々のミセルとDDMを準備7,000グラム/モルの分子量カットオフ（MWCO）。
   注：このMWCOは、カセットの外に自由に拡散することにより、シンク条件を確保するために関連付けられていないポリマー分子と一緒に遊離薬物（複数可）を有効にするために選ばれました。
2. （株式200 mM溶液を希釈することにより調製）10mMのpH7.4のリン酸緩衝液2.5リットルにカセットを置き、シンク条件を確保するために、バッファごとに3時間を変更します。実験期間を通じて^37°Cの時のバッファの温度を維持します。
3. 0、0.5、1、2、3、6、9、12、24、および48時間では、カセット内の溶液の150μLを撤回し、新鮮な緩衝液150μlで交換してください。
4. セクション2で確立された薬物の濃度を決定するためにRP-HPLCを用いてサンプルを分析します。薬剤（複数可）stastiticalソフトウェアを使用して、1つの位相指数関数的会合を持つ単純な拡散モデルに基づく放出データを曲線適合。
5. Eの薬物放出（T _1/2）の50％に達するのに必要な時間を算出しますフィッティング曲線に基づいて、個々のミセルまたはDDMでACH薬。四つですべての測定を実行します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

個々のDTXまたはEVRミセルおよびミセルが正常にPEG ₄₀₀₀のいずれかで処方される-pla bは PEG-でDTXとEVR DDM - B -pla ₂₂₀₀またはPEG ₂₀₀₀ - B -pla _1800（ 図1）。

48時間（ 図2）を介して-pla ₁₈₀₀ bは - -pla ₂₂₀₀またはPEG ₂₀₀₀ B - DTX、EVR、とDDMは、PEG ₄₀₀₀で同様の安定性を?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

The use of polymeric micelles for drug delivery continues to expand due to their versatility and ability to deliver hydrophobic drugs for various disease states. Therefore, the techniques needed to prepare and characterize these formulations prior to use in cell culture or animals is a critical first step to determine the best pairing between the drug and the polymer. PEG-b-PLA are excellent amphiphilic block copolymers for drug delivery purposes. However, the block length of the hydrophilic and hydrophobic s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG2000-b-PLA1800	Advanced Polymer Materials, Inc	6-01- PLA/2000	PLA MW can be specified on ordering
PEG4000-b-PLA2200	Advanced Polymer Materials, Inc	6-01- PLA/4000	PLA MW can be specified on ordering
Docetaxel	LC Laboratories	D-1000	100 mg
Everolimus	LC Laboratories	E-4040	100 mg
Acetonitrile	EMD/VWR	EM-AX0145-1	HPLC grade; 4 L
Round bottom flask	Glassco/VWR	89426-496	5 ml
RV 10 Control Rotary Evaporators	IKA Works	8025001	Rotoevaporator
Shimadzhu HPLC with DAD detector	Shimadzhu		RP-HPLC
Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000	Thermo Scientific, Inc	66370	3 ml
Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM	VWR	100190-870	500 ml
Malvern NanoZS	Malvern Instruments, UK		DLS
Nylon filter	Acrodisc/VWR	28143-242	13 mm; 0.2µM
Phosphoric acid, NF	Spectrum Chemical/VWR	700000-626	100 ml
GraphPad Prism	www.graphpad.com		Analysis software
Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge	Agilent Technologies	866953-906	4.6 ×75 mm, 3.5 μm