Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle

Riepilogo

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

Abstract

Copolimeri a blocchi anfifilici come blocco polyethyleneglycol- acido -polylactic (PEG-b- PLA) possono auto-assemblarsi in micelle di sopra del loro concentrazione micellare critica che formano nuclei idrofobici circondati da gusci idrofili in ambienti acquosi. Il nucleo di queste micelle può essere utilizzato per caricare farmaci idrofobici, scarsamente idrosolubili come docetaxel (DTX) e everolimus (EVR). Caratterizzazione sistematica delle capacità della struttura micelle e droga di carico sono importanti prima in vitro e in vivo può essere effettuata. L'obiettivo del protocollo qui descritto è quello di fornire le misure di caratterizzazione necessari per realizzare prodotti micellari standardizzati. DTX e EVR hanno solubilità intrinseca di 1,9 e 9,6 mg / ml Preparazione di queste micelle può essere realizzato per fusione solvente che aumenta la solubilità in acqua di DTX e EVR a 1,86 e 1,85 mg / ml, rispettivamente. Stabilità droga in micelle evalranea a temperatura ambiente per 48 ore indica che il 97% o più dei farmaci sono mantenuti in soluzione. Dimensioni micella è stata valutata utilizzando light scattering dinamico e indicato che la dimensione di queste micelle era inferiore a 50 nm e dipendeva dal peso molecolare del polimero. Rilascio del farmaco da parte delle micelle è stata valutata utilizzando la dialisi, in condizioni sink a pH 7,4 ^a 37 ° C oltre 48 ore. Curve risultati adatti indicano che il rilascio del farmaco è guidato da un processo di primo ordine che indica che è guidato diffusione.

Introduzione

Copolimeri a blocchi anfifilici con struttura ripetendo composta da domini idrofili e idrofobi possono spontaneamente auto-assemblano a formare tre assemblee macromolecolari tridimensionali conosciuti come micelle polimeriche. Queste strutture hanno un core idrofobico interno circondato da un guscio idrofilo. Il core idrofobico ha la capacità di incorporare farmaci idrofobici mediante intrappolamento fisico attraverso interazioni idrofobiche o mediante coniugazione chimica a catena polimerica. ¹ Molti vantaggi esistono per utilizzare questi copolimeri a blocchi per formare micelle per il drug delivery. Questi includono l'incorporazione di farmaci scarsamente solubili, migliorando farmacocinetica dei farmaci incorporati, e la biocompatibilità e / o biodegradabilità dei polimeri li rende un sostituto sicuro per solubilizzanti convenzionali. ^{2 Un altro} vantaggio dell'utilizzo di micelle polimeriche è la loro granulometria colloidale, tra 15- 150 nm ^3, che li rende attraenti per paconsegna renteral. Pertanto, nel corso degli ultimi 20 anni micelle polimeriche sono emersi come sistemi di drug delivery vitali per farmaci scarsamente solubili in acqua soprattutto per la terapia del cancro. ^3,4

Attualmente ci sono cinque formulazioni micellari polimerici per la terapia del cancro in fase di sperimentazione clinica. ⁴ Quattro delle micelle negli studi clinici sono copolimeri a base di PEG diblock mentre l'ultimo è un copolimero a tre blocchi contenente polietilenossido. La dimensione di queste micelle variava da 20 nm a 85 nm. Il vantaggio di usare polimeri a base di PEG è la loro biocompatibilità e in funzione del secondo blocco può anche essere biodegradabili. Recentemente nuovi sistemi di somministrazione dei farmaci a base di acido -polylactic blocco polyethyleneglycol- (PEG-b -PLA) micelle polimeriche sono stati sviluppati per la consegna contemporanea di più farmaci antitumorali. Le micelle PEG-b- PLA sono sia biocompatibile e biodegradabile. Questi multi-farmaco micelle caricati hanno dimostrato comeinibizione ynergistic di diversi modelli di tumori in vitro e in vivo e in forma ^2,5,6 nella corrente paradigma di utilizzare più farmaci in chemioterapia per prevenire la resistenza e ridurre la tossicità. Pertanto, non vi è un grande interesse per la preparazione e la caratterizzazione di questi sistemi di drug delivery micellari per l'uso nel cancro e altre malattie.

Nel lavoro di seguito abbiamo delineato un processo step-by-step per cui tali micelle possono essere preparati e caratterizzati prima di valutare negli stati di malattia d'interesse. Ai fini di questo lavoro, docetaxel (DTX) e everolimus (EVR) sono stati scelti due agenti anti-tumorali scarsamente solubili. Sia DTX e EVR sono composti scarsamente solubili in acqua con solubilità in acqua intrinseche a 1,9 e 9,6 mg / ml. ^7,8 Due PEG-polimeri b -PLA con diversi pesi molecolari sono stati utilizzati in questo protocollo, come i mattoni per la polimerico formulato micelle,questi polimeri sono PEG _{2000 -} b -PLA _{1800 (3.800} Da) e PEG ₄₀₀₀ - b -PLA _{2200 (6.200} Da). PEG micelle b -PLA possono quindi fornire una piattaforma unica come nanocarrier per DTX e EVR individualmente e in combinazione. Le richieste Reagenti / Materiali e attrezzature necessarie per preparare e caratterizzare queste micelle sono elencati nella tabella 1.

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Protocollo

1. Preparazione di singoli e multi-droga Micelle caricate da solvente Metodo Casting

1. Pesare DTX 1 mg o EVR 1 mg o di entrambi i farmaci a 1 mg ciascuna per le micelle doppio farmaco (DDM).
2. Pesare 15 mg di PEG _{2000 -} b -PLA _{1800 e} PEG _{4000 -} b -PLA ₂₂₀₀ sia per individuali o DDM.
3. Sciogliere le droghe / farmaci e il polimero in 0,5 ml di acetonitrile e posto in un pallone a fondo tondo da 5 ml.
4. Forma un film polimerico farmaco distribuito sottile facendo evaporare il farmaco (s) soluzione acetonitrile -polymer sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Impostare l'evaporatore rotante a 100 rpm, la temperatura dell'acqua di 40 vasca ^o C e una pressione di 260 mbar di vuoto per 5 minuti, seguito da una riduzione a 100 mbar per ulteriori 3 min.
5. Reidratare il film di droga-polimero con 0,5 ml di acqua deionizzata a 50 ^{° C e} scuotere delicatamente il pallone per formare le micelle.
6. Filtrare il risultatoing soluzione micellare attraverso un filtro di nylon 0,2 micron per rimuovere qualsiasi farmaco o contaminanti un-dissolto in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.

2. Valutazione di droga Caricamento e alla stabilità nel Micelle Utilizzando Reverse-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (RP-HPLC)

1. Effettuare analisi RP-HPLC con una colonna C8 equilibriated a 40 ° C in una modalità isocratica con una fase mobile di acetonitrile / acqua (62/38) contenente 0,1% di acido fosforico e 1% di metanolo ad una portata di 1 ml / min e un volume di iniezione di 10 ml.
2. Diluire micelle preparati al momento (sezione 1) 1: 100 in fase mobile prima di analizzare da RP-HPLC per determinare caricamento iniziale della droga. Conservare diluiti individuali micelle e DDM a temperatura ambiente ⁽²⁵ ° C) per 48 ore e si preparano freschi 1: 100 campioni diluiti in fase mobile di rivalutare da RP-HPLC e determinare droga (s) stabilità in micelle oltre 24 ore.
3. Monitorare DTX e EVR picchi a 227 e 279 nm, rispettivamentecon tempi di ritenzione di 1,7 e 5,7 minuti rispettivamente. Eseguire tutte le misurazioni in triplice copia. Presentare i dati come media ± SD droga carico.

3. valutazione delle dimensioni delle particelle micelle da Dynamic Light Scattering (DLS)

1. Diluire micelle preparate (come descritto nella sezione 1) in acqua deionizzata a rapporto 1:20 per ottenere una concentrazione finale di 1,5 mg di polimero / ml.
2. Misurare l'intensità del laser He-Ne (633 nm) a 173 ° per determinare dispersione. Eseguire tutte le misurazioni a 25 ° C dopo un pre-equilibrazione per 2 minuti.
3. Eseguire tutte le misurazioni in triplice copia. Dati presente come dimensione media Z-media ± SD insieme con l'indice di polidispersità (PDI) della distribuzione.

4. Valutazione in vitro Drug uscita da Micelle individuali e DDM

1. Preparare i singoli micelle e DDM come descritto nella sezione 1. Caricare 2,5 ml di micelle in una cassetta da 3 ml con dialisiun peso molecolare di cut-off (MWCO) di 7000 g / mol.
   NOTA: Questo MWCO stato scelto per consentire al farmaco libero (s) insieme con le molecole di polimero non associate a diffondere liberamente dalla cassetta e quindi garantire condizioni sink.
2. Posizionare le cassette in 2,5 L di 10 mM pH 7,4 tampone fosfato (diluire soluzione madre 200 mm) e modificare il buffer ogni 3 ore per garantire condizioni di sink. Mantenere la temperatura del tampone ^a 37 ° C per tutta la durata dell'esperimento.
3. A 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, e 48 ore, prelevare 150 microlitri della soluzione in cassette e sostituire con 150 ml di tampone fresco.
4. Analizzare i campioni utilizzando RP-HPLC previste nella sezione 2 per determinare la concentrazione del farmaco. Curve-fit dei dati di rilascio del farmaco (s) sulla base di un modello di diffusione semplice con un'associazione esponenziale una fase utilizzando il software stastitical.
5. Calcolare il tempo necessario per raggiungere il 50% di rilascio di farmaci (t _1/2) edroga ach in singoli micelle o DDM in base alla curva raccordo. Eseguire tutte le misure in quaterna.

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Risultati

DTX individuali o micelle EVR e DTX e EVR DDM in PEG b -PLA micelle sono formulati con successo in entrambi i PEG ₄₀₀₀ - b -PLA ₂₂₀₀ o PEG _{2000 -} b -PLA _{1800 (Figura} 1).

DTX, EVR, e il DDM ha mostrato stabilità simile a PEG ₄₀₀₀ - b -PLA ₂₂₀₀ o PEG _{2000 -} b -PLA ₁₈₀₀ più di 48 ore (Figura 2). Caricamento farmacolog...

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Discussione

The use of polymeric micelles for drug delivery continues to expand due to their versatility and ability to deliver hydrophobic drugs for various disease states. Therefore, the techniques needed to prepare and characterize these formulations prior to use in cell culture or animals is a critical first step to determine the best pairing between the drug and the polymer. PEG-b-PLA are excellent amphiphilic block copolymers for drug delivery purposes. However, the block length of the hydrophilic and hydrophobic s...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG2000-b-PLA1800	Advanced Polymer Materials, Inc	6-01- PLA/2000	PLA MW can be specified on ordering
PEG4000-b-PLA2200	Advanced Polymer Materials, Inc	6-01- PLA/4000	PLA MW can be specified on ordering
Docetaxel	LC Laboratories	D-1000	100 mg
Everolimus	LC Laboratories	E-4040	100 mg
Acetonitrile	EMD/VWR	EM-AX0145-1	HPLC grade; 4 L
Round bottom flask	Glassco/VWR	89426-496	5 ml
RV 10 Control Rotary Evaporators	IKA Works	8025001	Rotoevaporator
Shimadzhu HPLC with DAD detector	Shimadzhu		RP-HPLC
Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000	Thermo Scientific, Inc	66370	3 ml
Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM	VWR	100190-870	500 ml
Malvern NanoZS	Malvern Instruments, UK		DLS
Nylon filter	Acrodisc/VWR	28143-242	13 mm; 0.2µM
Phosphoric acid, NF	Spectrum Chemical/VWR	700000-626	100 ml
GraphPad Prism	www.graphpad.com		Analysis software
Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge	Agilent Technologies	866953-906	4.6 ×75 mm, 3.5 μm