携帯マイトファジーのマーカーとしてEYFP-パーキン集計の評価のためのタイムラプスビデオ顕微鏡

要約

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

要約

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

概要

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled ^1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy ^1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways ^6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control⁹. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy ¹⁰. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease ⁷. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) ¹¹. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS¹². Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain ¹³. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria¹⁴. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

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プロトコル

両発現ベクターEYFP-パーキンとpDsRed2-水戸での線維芽細胞の1エレクトロポ

1. 100 mg / mlでDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、10％ウシ胎児血清、2ミリモル/リットルのL-グルタミン、100 U / mlペニシリンを添加した培地を用いて10センチメートルの組織培養プレートに不死化マウス胚性線維芽細胞成長、および37℃、5％CO _2を含む加湿雰囲気中ストレプトマイシン。
   1. 80％の細胞集密度で、無菌吸引によって完全DMEM培地を捨て、滅菌1×リン酸緩衝溶液（PBS）10 mLを加え（塩化ナトリウム80gを、塩化カリウム2.0gを、のNa ₂ HPO ₄ 14.4 gのKH 2.4gの_7.4）2 PO _4、1 LのH ₂ O、PHを蒸留しました。
   2. 無菌吸引によってPBSを捨て、トリプシンEDTA、0.25％の1ミリリットルを追加します。 （ - 3分2）細胞が分離されるまで、37℃でプレートをインキュベートします。 _、完全DMEM培地の4ミリリットルを加え、細胞を再懸濁し、10を取り出します6;血球計カウントのための細胞懸濁液リットル。
      注：16角の正方形の一組のセルの数は、細胞×10 ⁴ / mlの数に相当するように、血球計数器を設計します。
2. エレクトロポレーションプロセスの24時間前に10cmの組織培養皿上にシード1×10 ⁶細胞。
3. 無菌吸引によって完全DMEM培地を捨て、滅菌PBSの10ミリリットルを追加します。無菌吸引によってPBSを捨て、トリプシンEDTA、0.25％の1ミリリットルを追加します。 （ - 3分2）細胞が分離されるまで、37℃でプレートをインキュベートします。完全DMEM培地4mlを加え、15 mlチューブに細胞を再懸濁。
4. 冷蔵遠心分離（4℃）を用いて5分間250×gで細胞をスピンダウン。無菌吸引によって上清を捨て、滅菌PBS 1 mlにペレットを再懸濁。 4℃で5分間、250×gで細胞をスピンダウン。
5. 無菌吸引によって上清を捨て、そして100μlのOを追加エレクトロポレーションのためのF溶液ミックス細胞ペレットに（82補足ソリューション1のエレクトロポレーションソリューションV + 18マイクロリットルのμl）を、穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁（詳細については、ユーザーのガイドを参照してください）​​。 EYFP-パーキン（励起/発光527分の514）2μgのを追加し、細胞懸濁液で1μgのpDsRed2-水戸（励起/発光620分の565）。
6. 使い捨てのパスツールを使用して、無菌のキュベットへの解決策を（両方のツールは、キットで提供されています）転送し、予め設定されたプログラムNIH / 3T3 U-030（シングルパルス、電圧200 V、容量960μF、パルス時間20ミリ秒を使用して、エレクトロポパルス番号：1）。
7. 電気穿孔直後に、予め温めておいた新鮮な完全DMEM培地500μlのを追加し、6センチメートル組織培養プレートライブイメージンググレード上の細胞に接種し、37℃で5％CO ₂を含む加湿雰囲気中でそれらをインキュベート24時間。

2.タイムラプスビデオ顕微鏡

1. は使用前に37℃での顕微鏡のチャンバーの温度を設定します。
2. この時点で、実験手順を続行するために特定のライブイメージング媒体を準備します。次のようにライブイメージング媒体を準備します。混合DMEMフェノール不含の10％ウシ胎児血清、2ミリモル/リットルのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、および100mg / mlストレプトマイシンを補充しました。水浴中で37℃でライブイメージング媒体を事前に温めます。
3. 無菌吸引によってエレクトロポレーションした細胞の培地を捨て、予め温めておいたライブイメージング媒体の1ミリリットルを追加し、P1000ピペットを用いて、37℃で30分間静置します。
4. プレートのインキュベーション期間中に流入、5％CO ₂顕微鏡のチャンバ内にすでに37℃で安定した温度で実施されます。
5. 主要な動きや振動を避けて、顕微鏡のチャンバ内へのエレクトロポレーションした細胞でプレートを置きます。
6. ソフトウェア・インターフェースを使用して、両方のfluoreを検出するために顕微鏡を設定します同時トランスフェクトするベクター、EYFP-パーキン（510 nmおよび放射範囲520〜550 nmの励起範囲495、緑）、pDsRed2-水戸（励起最大558 nmおよび放出によって、最大583 nmでのコードされた融合タンパク質からのscence信号、赤）。
   1. タイムラプスビデオ顕微鏡ソフトウェアを開きます。上部のメニューでpDsRed2-水戸のためのEYFP-パーキンおよびローダミンのためのFITCを選択します。上部のメニューで倍率（20X）を選択します。
7. ソフトウェアインターフェイスを使用して、両方の同時トランスフェクトするベクターを発現する単一のセルを探し、位置を登録します。 10細胞の最小値は、すべての実験条件（実験群）のために収集されるまで、この手順を繰り返します。
   1. メニュー「アプリ」を選択し、多次元の取得をクリックしてください。多次元取得ウィンドウでは、このような買収の数、それぞれ取得し、記録セルの位置との間の時間間隔として必要なパラメータを選択します。取得」をクリックします。「取得プロセスを開始します。
8. EYFP-パーキンと15分の合計の間隔で5分ごとに画像を収集DsRed2の-水戸蛍光信号の両方の基底取得を開始します。
9. 最終的な作業濃度の2倍FCCPの濃度で予熱したライブイメージング媒体を準備する（0.1から10μM、細胞型に依存します）。
10. 取得処理を中断し、P1000ピペットを用いて顕微鏡のチャンバ内のプレートにFCCPで予め温めておいたライブイメージング媒体の優しく1ミリリットルを追加します。
11. 以前に記録された位置を使用して、3時間の全期間のために、説明したように取得プロセスを再起動します。それらを分析し、買収が終わったときmitophagicプロセスのビデオを作成するために取得したすべての画像を保存します。

3.分析

1. パソコン上で「.TIFF」の形式で取得したすべての画像を収集
2. グラフィックソフトで画像を開きます。ウェアおよび時間的間隔を定義するには（画像は5分ごとに取得される）ミトコンドリア膜にパーキンの動員を示す第1の画像にFCCPとミトコンドリア誘起脱分極から発生しました。実験群内の各セルのために、この分析を繰り返します。
3. 実験グループ名を持つスプレッドシート上の列の最初のセルにラベルを付けます。各実験群について、10セルの最小のパーキン募集のための時間的間隔を測定します。 Parkinの募集のための計算された時間的間隔の平均を作成し、各実験群の標準偏差定義（平均値±SDを、N = 10）。
   1. 列に単一の計算された時間的間隔を整理します。すべての列は、n =実験群の10の測定値が含まれています。
   2. 数式パレットメニューから「平均」機能を選択します。列のデータを選択します。関数式ビルダのメニューから「標準偏差」を選択します。セレ列内のデータのct。
4. 統計的手法を用いて、実験群間マイトファジーを動的に有意な差を定義するために適切な統計値を適用し、実験群を比較します。 （例えば、二つのグループ= スチューデントのt検定 、3つまたはそれ以上の基= ANOVAプラスポストホック検定）

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結果

ここで、我々は、タイムラプスビデオ顕微鏡は、単一のセル内の蛍光標識タンパク質の分子のイベントを追跡するために使用することができる強力な技術である方法を示しています。代表的な結果はまた、この技術は、高品質な画像の取得を可能にする方法を示します。分子過程の画像が得られると、我々は、さまざまな方法でそれらを分析する機会を持ちます。こ?...

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ディスカッション

タイムラプス顕微鏡は、長期間にわたって携帯ダイナミクスの観察に時間的に1つの観測からのライブセルイメージングを拡張する技術として定義することができます。それは観察者がリアルタイムで単一の蛍光標識タンパク質を同定し、単一生細胞内でそのダイナミックに追従することができますので、この方法は、単純な共焦点または生細胞顕微鏡と区別されます。実際には、共焦点顕微...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning Life Science	10-013-CV	Pre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEM	Corning Life Science	17-205-CV	Pre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	Pre-warm at 37 °C before use
L-Glutamine	Gibco	25030	Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycin	Corning Life Science	30-002-CI	Pre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vector	Addgene	23955
pDsRed2-Mito expression vector	Clontech	632421
Nucleofector 2B device	LONZA	AAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3	LONZA	VCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope	CARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
MetaMorph	Molecular Devices	Experimental Builder
ImageJ	National Institute of Health	Experimental Builder