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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Resumo

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Introdução

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled 1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy 1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control9. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy 10. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease 7. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) 11. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS12. Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain 13. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria14. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

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Protocolo

1. Eletroporação de Fibroblasto com Ambos Expression Vectors EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito

  1. Cresça o rato imortalizada células de fibroblastos embrionários de 10 centímetros placa de cultura de tecidos, utilizando meio DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / mL estreptomicina, em atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C.
    1. Na confluência celular de 80%, descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de solução tampão de fosfato de 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 e 1 L de H2O destilada, pH: 7,4).
    2. Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicione 4 ml de meio DMEM completo, voltar a suspender as células e tirar 10 _6; L da suspensão de células para a contagem em hemocitómetro.
      NOTA: O hemocitómetro é concebido de modo que o número de células em um conjunto de quadrados de canto 16 é equivalente ao número de células x 10 4 / ml.
  2. Semente de 1 x 10 6 células nas placas de 10 cm de cultura de tecidos de 24 horas antes do processo de electroporação.
  3. Descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de PBS estéril. Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicionar 4 ml de meio DMEM completo e ressuspender as células em um tubo de 15 ml.
  4. Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min, utilizando a-centrifugadora refrigerada (4 ° C). Descartar o sobrenadante por aspiração estéril e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS estéril. Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
  5. Descartar o sobrenadante por aspiração estéril, e adiciona-se 100 ul Of mix solução para eletroporação (82 ul de eletroporação Solução V + 18 ml de solução Suplementar 1) para o pellet celular e delicadamente ressuspender o sedimento pipetando (Para mais detalhes, consulte o manual do utilizador). Adicionar 2 ug de EYFP-Parkin (excitação / emissão de 514/527) e 1 ug pDsRed2-Mito (excitação / emissão de 565/620) a suspensão de células.
  6. Transferir a solução para a cuvete estéril usando um pasteur descartável (ambas as ferramentas são fornecidos com o kit) e electroporate usando o programa pré-definido NIH / 3T3 U-030 (pulso único, tensão de 200 V, capacitância 960 mF, tempo de pulso de 20 milissegundos , número de pulsos: 1).
  7. Imediatamente após a electroporação, adicionar 500 uL de meio DMEM completo pré-aquecido frescos e as sementes da célula em um-processamento de imagem de grau directo de 6 centímetros de cultura de tecidos de placa e incubar-los numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 horas.

2. Time-Lapse Vídeo Microscopy

  1. Ajustar a temperatura da câmara do microscópio a 37 ° C antes de usar.
  2. Neste ponto, se preparar um meio específico de imagens ao vivo para prosseguir com o protocolo experimental. Prepare o suporte de imagens ao vivo da seguinte forma; misturar DMEM isento de fenol suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Pré-aquecer o meio de imagens ao vivo a 37 ° C num banho de água.
  3. Descartar a forma das células electroporadas por sucção estéril e adicionar 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido, usando uma pipeta P1000 e incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C.
  4. Durante o período de incubação da placa, influxo de 5% de CO 2 na câmara do microscópio já a uma temperatura estável de 37 ° C.
  5. Coloque a placa com as células electroporadas à câmara do microscópio evitar grandes movimentos ou oscilações.
  6. Utilizando o software de interface, definir o microscópio, a fim de detectar tanto fluorésinais scence de as proteínas de fusão codificadas pelos vectores co-transfectados, EYFP-Parkin (gama Excitação 495-510 nm e faixa de emissão de 520-550 nm, verde) e o pDsRed2-Mito (excitação máximo 558 nm e de emissão de máximo 583 nm, vermelho).
    1. Abra o software de vídeo microscopia de lapso de tempo. No menu superior, selecione a FITC para EYFP-Parkin e Rodamina para pDsRed2-Mito. No menu superior, selecione a ampliação (20x).
  7. Usando a interface do software, procure a única célula expressando ambos os vectores de co-transfectadas e registrar a posição. Repita este passo até um mínimo de 10 células são coletadas para cada condição experimental (grupo experimental).
    1. Selecione o menu "Aplicativos" e clique em Aquisição multi-dimensional. Nas janelas de aquisição multi dimensional seleccionar os parâmetros necessários, tais como o número de aquisições, o intervalo de tempo entre cada uma das aquisições e a posição da célula registada. Clique em "Adquirir"Para iniciar o processo de aquisição.
  8. Comece a aquisição basal de ambos EYFP-Parkin e sinal fluorescente DsRed2-Mito recolher imagens a cada 5 minutos para um intervalo total de 15 min.
  9. Prepare meio de imagem ao vivo pré-aquecido com uma concentração de FCCP duas vezes mais elevada do que a concentração final de trabalho (0,1-10 uM, dependentes de tipo de célula).
  10. Interromper o processo de aquisição e adicionar suavemente 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido com FCCP para a placa dentro da câmara do microscópio utilizando uma pipeta P1000.
  11. Reiniciar o processo de aquisição, como anteriormente descrito, para um período total de 3 horas, utilizando a posição registada. Salve todas as imagens adquiridas, a fim de analisá-los e criar um vídeo do processo mitophagic quando a aquisição é longo.

3. Análise

  1. Recolha todas as imagens adquiridas em formato "tiff" em um computador pessoal
  2. Abra as imagens com um pano macio gráficoWare e definem o intervalo de tempo ocorreu a partir da mitocondrial induzida por despolarização com FCCP para a primeira imagem que mostra o recrutamento de Parkin na membrana mitocondrial (as imagens são adquiridas a cada 5 minutos). Repetir esta análise para cada célula no grupo experimental.
  3. Rotular a primeira célula da coluna, numa folha de cálculo com o nome do grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir os intervalos temporais para Parkin recrutamento de um mínimo de 10 células. Realizar uma média dos intervalos temporais calculados para o recrutamento e Parkin definir o desvio padrão para cada grupo experimental (Média ± DP, n = 10).
    1. Organizar-se em colunas os intervalos temporais calculados individuais. Cada coluna contém o n = 10 medidas do grupo experimental.
    2. Seleccione a função de "médio" a partir do menu Formula Builder. Seleccionar os dados na coluna. Seleccione a função "Desvio Padrão" no menu Formula Builder. SeleCT os dados na coluna.
  4. Usando uma abordagem estatística, comparar os grupos experimentais que aplicam a estatística apropriada, a fim de definir uma diferença significativa na dinâmica de mitophagy entre os grupos experimentais. (Por exemplo, dois grupos = t de Student, três ou mais grupos = ANOVA além de um teste post-hoc)

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Resultados

Aqui, mostramos como microscopia de lapso de tempo vídeo é uma técnica poderosa que pode ser usado para acompanhar os acontecimentos moleculares de proteínas fluorescentes-marcado em uma única célula. Os resultados representativos também mostram como esta técnica permite a aquisição de imagens de alta qualidade. Quando as imagens dos processos moleculares, são obtidas, que têm a oportunidade de analisá-los de modos diferentes. Aqui, analisamos o intervalo de tempo entre o in...

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Discussão

microscopia de lapso de tempo pode ser definido como a técnica que se estende imagem de células vivas a partir de uma única observação em tempo para a observação da dinâmica celular durante longos períodos de tempo. Esta metodologia é distinguida de uma simples confocal ou microscopia de células vivas porque permite que o observador identificar em tempo real, com uma única proteína fluorescente marcado com e seguir a sua dinâmica dentro de uma única célula viva. Na verdade, a microscopia confocal pode fa...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

This work was supported in part by NIH grants (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), the Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), a grant from the Breast Cancer Research Foundation, generous grants from the Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) and a grant from the Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). In part this work was supported by an American Italian Cancer Foundation postdoctoral fellowship (G.D.) and Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036).The Department specifically disclaims responsibility for an analysis, interpretations or conclusions. There are no conflicts of interest associated with this manuscript.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Pre-warm at 37 °C before use
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycinCorning Life Science30-002-CIPre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vectorAddgene23955
pDsRed2-Mito expression vectorClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

Referências

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  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
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