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Resumen

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Resumen

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Introducción

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled 1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy 1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control9. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy 10. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease 7. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) 11. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS12. Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain 13. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria14. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

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Protocolo

1. La electroporación de fibroblastos con ambos vectores de expresión EYFP-Parkin y pDsRed2-Mito

  1. Cultivar las células de fibroblastos de embriones de ratón inmortalizada en 10 centímetro placa de cultivo de tejidos utilizando DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C.
    1. En la confluencia de células 80%, desechar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de solución tampón de fosfato 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 y 1 L de H2O destilada, pH: 7,4).
    2. Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio DMEM completo, volver a suspender las células y sacar 10 _6; l de la suspensión celular para el recuento hemocitómetro.
      NOTA: El hemocitómetro está diseñado de modo que el número de células en un conjunto de 16 cuadrados de las esquinas es equivalente al número de células x 10 4 / ml.
  2. Seed 1 x 10 6 células en 10 cm placas de cultivo de tejidos de 24 horas antes del proceso de electroporación.
  3. Descartar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de PBS estéril. Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio completo DMEM y resuspender las células en un tubo de 15 ml.
  4. Girar las células hacia abajo a 250 xg durante 5 min usando una centrífuga refrigerada (4 ° C). Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril y resuspender el precipitado en 1 ml de PBS estéril. Girar las células hacia abajo a 250 g durante 5 min a 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril, y añadir 100 l Of mezcla de solución para la electroporación (82 l de solución de electroporación V + 18 l de solución Suplementaria 1) al sedimento celular y resuspender suavemente el precipitado pipeteando (Para más detalles, consulte el Manual del usuario). Añadir 2 g de EYFP-Parkin (excitación / emisión 514/527) y 1 g pDsRed2-Mito (excitación / emisión 565/620) a la suspensión celular.
  6. Transferir la solución a la cubeta estéril utilizando un pasteur desechable (ambas herramientas se proporcionan con el kit) y electroporación utilizando el programa pre-establecido NIH / 3T3 T-030 (solo pulso, tensión de 200 V, la capacitancia 960 mF, tiempo de pulso de 20 milisegundos , el número de impulsos: 1).
  7. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 500 l de medio DMEM completo pre-calentado fresco y sembrar la célula en un 6 cm de la placa de cultivo de tejidos en vivo de imágenes de grado y los incuban en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.

2. Tiempo-Lapso de microscopía de vídeo

  1. Ajuste la temperatura de la cámara del microscopio a 37 ° C antes de su uso.
  2. En este punto, preparar un medio específico de formación de imágenes en vivo de proceder con el protocolo experimental. Prepare el soporte de imágenes en vivo de la siguiente manera; mezclar DMEM-fenol libre suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Pre-calentar el medio de imágenes en vivo a 37 ° C en un baño de agua.
  3. Descartar el medio de las células sometidas a electroporación por aspiración estéril y añadir 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado, utilizando una pipeta P1000 e incubar la placa durante 30 minutos a 37 ° C.
  4. Durante el período de placa de incubación, afluencia 5% de CO 2 en la cámara del microscopio ya a una temperatura estable de 37 ° C.
  5. Coloque la placa con las células a electroporación en la cámara del microscopio evitando movimientos u oscilaciones importantes.
  6. Mediante la interfaz de software, configurar el microscopio con el fin de detectar tanto Fluoreseñales scence de las proteínas de fusión codificadas por los vectores de co-transfectadas, EYFP-Parkin (rango de excitación de 495 a la 510 nm y el rango de emisión 520 a la 550 nm, verde) y el pDsRed2-Mito (máximo de excitación 558 nm y emisión máxima de 583 nm, rojo).
    1. Abra el software de microscopía de vídeo de lapso de tiempo. En el menú superior seleccionar el FITC para EYFP-Parkin y rodamina para pDsRed2-Mito. En el menú superior seleccionar el aumento (20X).
  7. El uso de la interfaz de software, buscar la única célula que expresa ambos vectores co-transfectadas y registrar la posición. Repita este paso hasta un mínimo de 10 células se recoge para cada condición experimental (grupo experimental).
    1. Seleccione el menú "Aplicaciones" y haga clic en Multi Adquisición dimensional. En las ventanas de adquisición multidimensional seleccionar los parámetros necesarios, tales como el número de adquisiciones, el intervalo de tiempo entre cada adquisición y la posición de la célula registrada. Haga clic en "Adquirir"Para iniciar el proceso de adquisición.
  8. Iniciar la adquisición basal de ambos EYFP-Parkin y la señal fluorescente DsRed2-Mito recogida de imágenes cada 5 min durante un intervalo total de 15 min.
  9. Para preparar el medio de imágenes en vivo pre-calentado con una concentración de FCCP dos veces mayor que la concentración final de trabajo (0,1 - 10 mM, dependiente del tipo de célula).
  10. Interrumpir el proceso de adquisición y añadir suavemente 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado con FCCP en la placa dentro de la cámara del microscopio utilizando una pipeta P1000.
  11. Reiniciar el proceso de adquisición, como se describe anteriormente, durante un periodo total de 3 horas, utilizando la posición de grabado. Guardar todas las imágenes adquiridas con el fin de analizarlas y crear un video del proceso mitophagic cuando la adquisición se ha terminado.

3. Análisis

  1. Recoge todas las imágenes adquiridas en formato "tiff" en un ordenador personal
  2. Abrir las imágenes con un suave gráficoWare y definir el intervalo temporal se produjeron de la mitocondrial inducida por despolarización con FCCP a la primera imagen que muestra el reclutamiento de Parkin en la membrana mitocondrial (Las imágenes se adquieren cada 5 min). Repita este análisis para cada celda en el grupo experimental.
  3. Etiquetar la primera celda de la columna en una hoja de cálculo con el nombre del grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir los intervalos temporales para Parkin reclutamiento de un mínimo de 10 células. Hacer un promedio de los intervalos temporales calculadas para el reclutamiento Parkin y definir la desviación estándar para cada grupo experimental (media ± SD, n = 10).
    1. Organizar en columnas individuales de los intervalos temporales calculados. Cada columna contiene el n = 10 mediciones del grupo experimental.
    2. Seleccione el "promedio" de la función en el menú de fórmulas. Seleccionar los datos de la columna. Seleccione la función "desviación estándar" en el menú de fórmulas. select los datos de la columna.
  4. El uso de un enfoque estadístico, comparar los grupos experimentales aplicando el estadístico apropiado con el fin de definir una diferencia significativa en la dinámica de mitofagia entre los grupos experimentales. (Por ejemplo, dos grupos = t de Student prueba, tres o más grupos = ANOVA más un test post-hoc)

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Resultados

Aquí, nos muestran cómo la microscopía de vídeo de lapso de tiempo es una técnica poderosa que puede ser utilizado para seguir los acontecimientos moleculares de las proteínas con fluorescencia etiquetado en una sola célula. Los resultados representativos también muestran cómo esta técnica permite la adquisición de imágenes de alta calidad. Cuando las imágenes del proceso molecular, se obtienen, tenemos la oportunidad de analizar de diferentes maneras. Aquí, se analizan el ...

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Discusión

La microscopía de lapso de tiempo se puede definir como la técnica que se extiende imágenes de células vivas de una sola observación en el tiempo a la observación de la dinámica celular durante largos períodos de tiempo. Esta metodología se distingue de un simple o confocal microscopia de células vivas, ya que permite al observador identificar en tiempo real una sola proteína fluorescente con etiquetas y siga su dinámica dentro de una sola célula viva. De hecho, la microscopía confocal puede identifica fá...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was supported in part by NIH grants (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), the Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), a grant from the Breast Cancer Research Foundation, generous grants from the Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) and a grant from the Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). In part this work was supported by an American Italian Cancer Foundation postdoctoral fellowship (G.D.) and Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036).The Department specifically disclaims responsibility for an analysis, interpretations or conclusions. There are no conflicts of interest associated with this manuscript.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Pre-warm at 37 °C before use
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycinCorning Life Science30-002-CIPre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vectorAddgene23955
pDsRed2-Mito expression vectorClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

Referencias

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