JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Аннотация

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Введение

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled 1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy 1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control9. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy 10. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease 7. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) 11. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS12. Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain 13. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria14. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Электропорация фибробласте с обоими экспрессирующие векторы EYFP-Паркин и pDsRed2-Мито

  1. Grow иммортализованных мышиных эмбриональных фибробластах клеток на 10 см ткани планшет для культивирования с использованием DMEM (модифицированная среда Игла Дульбекко) среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 ммоль / л L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицин в увлажненной атмосфере , содержащей 5% СО 2 при 37 ° с.
    1. На 80% сплошности клеток, отбрасывать полную среду DMEM с помощью стерильного отсоса и добавляют 10 мл стерильного 1x фосфатного буферного раствора (PBS) (80 г NaCl, 2,0 г KCl, 14,4 г Na 2 HPO 4 2,4 г КН 2 PO 4 и 1 л дистиллированной H 2 O, PH: 7,4).
    2. Выбросьте PBS стерильным отсасывают и добавляют 1 мл трипсина-EDTA 0,25%. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяются (2 - 3 мин). Добавляют 4 мл полной среды DMEM, ресуспендирования клеток и вынимают 10 _6; л клеточной суспензии для подсчета гемоцитометра.
      Примечание: гемоцитометре разработан таким образом , что число клеток в одном наборе из 16 угловых квадратов эквивалентно числу ячеек х 10 4 / мл.
  2. Семенной 1 х 10 6 клеток на 10 см для культуры ткани блюд за 24 часа до начала процесса электропорации.
  3. Выбросьте полной среды DMEM стерильным отсасывают и добавляют 10 мл стерильной PBS. Выбросьте PBS стерильным отсасывают и добавляют 1 мл трипсина-EDTA 0,25%. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяются (2 - 3 мин). Добавляют 4 мл полной среды DMEM и клетки вновь суспендируют в 15 мл пробирку.
  4. Спин ячейки вниз при 250 х г в течение 5 мин, используя охлаждаемую-центрифуге (4 ° С). Жидкость над осадком сливают стерильным отсоса и ресуспендируют осадок в 1 мл стерильной PBS. Спин ячейки вниз при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
  5. Удалите супернатант с помощью стерильного отсасыванием и добавляют 100 мкл Oе смесь раствор для электропорации (82 мкл электропорации Solution V + 18 мкл раствора 1 Дополнительное) к осадку клеток и осторожно ресуспендируют осадок пипеткой (Для получения более подробной информации обратитесь к руководству пользователя). Добавить 2 мкг EYFP-Паркином (возбуждения / испускания 514/527) и 1 мкг pDsRed2-Мито (возбуждение / излучение 565/620) в клеточной суспензии.
  6. Переносят раствор в стерильной кювету с использованием одноразового использования Пастера (оба инструмента снабжены комплектом) и электропорации с использованием предварительно установленной программы NIH / 3T3 U-030 (Одиночный импульс, напряжение 200 В, емкость 960 мкФ, длительность импульса 20 мс , количество импульсов: 1).
  7. Сразу после электропорации, добавьте 500 мкл свежей подогретого полной среде DMEM и семенем клетки на 6 см тканевого культурального планшета живого изображения степени злокачественности и инкубировать их в увлажненной атмосфере , содержащей 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 часа.

2. Замедленная видеомикроскопия

  1. Установите температуру камеры микроскопа при 37 ° C перед использованием.
  2. На данный момент, подготовить конкретную среду живого изображения, чтобы приступить к экспериментальным протоколом. Подготовьте носитель живого изображения следующим образом; смешивать DMEM, фенолов в с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоль / л L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина. Предварительно нагреть среду живого изображения при 37 ° С в водяной бане.
  3. Выбросите среду электропорации клетки стерильным отсоса и добавляют 1 мл подогретого среды живого изображения, используя пипетку P1000 и инкубируйте в течение 30 мин при 37 ° С.
  4. В течение периода инкубации пластины, приток 5% СО 2 в камере уже микроскопа при стабильной температуре 37 ° С.
  5. Поместите пластину с электропорации клеток в камере микроскопа, избегая крупных движений или колебаний.
  6. С помощью программного интерфейса, установите микроскоп, чтобы обнаружить как fluoreScence сигналы от слитых белков, кодируемых котрансфицируют векторами, EYFP-Паркин (диапазон возбуждения 495 до 510 нм и диапазон эмиссии от 520 до 550 нм, зеленый) и pDsRed2-Мито (Возбуждение максимум 558 нм и эмиссии максимум 583 нм, красный).
    1. Откройте замедленную видеомикроскопия программного обеспечения. В верхнем меню выберите FITC для EYFP-Паркин и родамина для pDsRed2-Мито. В верхнем меню выберите увеличение (20X).
  7. Используя программный интерфейс, обратите внимание на одну ячейку, выражающего оба котрансфицируют векторов и зарегистрировать положение. Повторите этот шаг до тех пор, как минимум 10 клеток не собирается для каждого условия эксперимента (экспериментальная группа).
    1. Выберите меню "Программы" и нажмите на многомерные Приобретения. В многомерном окна Приобретение выберите параметры, необходимые, например, количество приобретений, интервал времени между каждым приобретением и положением записанной ячейки. Нажмите на кнопку "Acquire"Чтобы начать процесс покупки.
  8. Запуск базальную приобретение как EYFP-Паркином и DsRed2-Мито флуоресцентного сигнала для сбора изображений каждые 5 мин в течение полного интервала 15 мин.
  9. Подготовка подогретого среды живого изображения с концентрацией FCCP в два раза выше, чем в окончательной рабочей концентрации (0,1 - 10 мкМ, зависящая от типа клеток).
  10. Прерывание процесса приобретения и добавьте мягко 1 мл подогретого среды живого изображения с FCCP в пластину внутри камеры микроскопа с использованием P1000 пипетку.
  11. Перезапустите процесс обнаружения, как описано выше, в течение общей сложности в течение 3-х часов, используя запомненное положение. Сохранить все полученные изображения для того, чтобы проанализировать их и создать видео из mitophagic процесса, когда приобретение закончится.

3. Анализ

  1. Соберите все полученные изображения в формате ".tiff" на персональном компьютере
  2. Откройте изображение с графическим мягкимпосуда и определяют временной интервал произошел из митохондриального наведенного деполяризации с FCCP на первое изображение, показывающий набор Паркином в митохондриальной мембране (изображения получены каждые 5 мин). Повторите этот анализ для каждой ячейки в экспериментальной группе.
  3. Добавьте первую ячейку столбца на таблицу с именем экспериментальной группы. Для каждой экспериментальной группы, измерения временных интервалов для Паркин найма минимум 10 клеток. Сделать среднее число вычисленных временных интервалов для Parkin набора и определяют стандартное отклонение для каждой экспериментальной группы (среднее ± стандартное отклонение, n = 10).
    1. Организация в столбцы отдельные расчетные временные интервалы. Каждый столбец содержит N = 10 измерений экспериментальной группы.
    2. Выберите функцию "среднее" из меню Formula Builder. Выберите данные в столбце. Выберите функцию "Стандартное отклонение" в меню Formula Builder. Селект данных в столбце.
  4. Используя статистический подход, сравнить экспериментальные группы, применяющим соответствующие статистические данные, чтобы определить значительную разницу в динамике mitophagy между экспериментальными группами. (К примеру, две группы = Стьюдента-тест, три или более групп = ANOVA плюс испытание ретроспективном)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Здесь мы покажем, как замедленная видео микроскопия является мощным методом, который может быть использован, чтобы следовать за молекулярных событий флуоресцентно-меченных белков в одной клетке. Представительные результаты также показывают, как эта методика позвол?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Покадровый микроскопии может быть определена как метод, который расширяет изображений живых клеток от одного наблюдения во времени для наблюдения за клеточной динамики в течение длительных периодов времени. Эта методика отличается от простого конфокальной микроскопии или клеток жи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported in part by NIH grants (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), the Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), a grant from the Breast Cancer Research Foundation, generous grants from the Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) and a grant from the Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). In part this work was supported by an American Italian Cancer Foundation postdoctoral fellowship (G.D.) and Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036).The Department specifically disclaims responsibility for an analysis, interpretations or conclusions. There are no conflicts of interest associated with this manuscript.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Pre-warm at 37 °C before use
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycinCorning Life Science30-002-CIPre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vectorAddgene23955
pDsRed2-Mito expression vectorClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

Ссылки

  1. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
  2. Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
  3. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
  4. Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
  6. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
  7. Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
  8. Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
  9. Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
  10. Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002(2012).
  11. Trinh, J., Farrer, M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).
  12. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  13. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
  14. Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
  15. Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
  16. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
  17. Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
  18. Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
  19. Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
  20. Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
  21. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
  22. Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
  23. Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
  24. Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
  25. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  26. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
  27. Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
  28. Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
  29. Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
  30. Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
  31. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

111MitophagyFCCP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены