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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Abstract

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Introduzione

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled 1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy 1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control9. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy 10. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease 7. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) 11. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS12. Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain 13. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria14. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

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Protocollo

1. elettroporazione di fibroblasti con entrambi vettori di espressione EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito

  1. Far crescere le cellule di fibroblasti embrionali di topo immortalato su 10 centimetri piatto di tessuto-cultura con DMEM (modificata mezzo di Eagle di Dulbecco) medio supplementato con 10% di siero fetale bovino, 2 mmol / l L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml streptomicina in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 a 37 ° C.
    1. Alla confluenza cella 80%, scartare il mezzo DMEM completo per aspirazione sterile e aggiungere 10 ml di 1x sterile tampone fosfato (PBS) (80 g di NaCl, 2,0 g di KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g di KH 2 PO 4 e 1 L distillata H 2 O, PH: 7.4).
    2. Eliminare il PBS mediante aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (2 - 3 min). Aggiungere 4 ml di terreno DMEM completo, sospendere nuovamente le cellule ed estrarre 10 _6; l di sospensione cellulare per il conteggio emocitometro.
      NOTA: Il emocitometro è progettato in modo che il numero di cellule in un set di 16 quadrati angolo è equivalente al numero di cellule x 10 4 / ml.
  2. Seed 1 x 10 6 cellule su 10 cm piatti di coltura di tessuti 24 ore prima del processo di elettroporazione.
  3. Eliminare il terreno completo DMEM per aspirazione sterile e aggiungere 10 ml di PBS sterile. Eliminare il PBS mediante aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (2 - 3 min). Aggiungere 4 ml di terreno DMEM completo e risospendere le cellule in una provetta da 15 ml.
  4. Spin le celle in basso a 250 xg per 5 minuti usando un-centrifuga refrigerata (4 ° C). Eliminare il supernatante mediante aspirazione sterile e risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile. Spin le cellule giù a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  5. Eliminare il surnatante tramite aspirazione sterili, e aggiungere 100 ml of soluzione mix per l'elettroporazione (82 ml di soluzione elettroporazione V + 18 ml di soluzione supplementare 1) al pellet e risospendere delicatamente il pellet pipettando (Per maggiori dettagli fare riferimento alla guida per l'utente). Aggiungere 2 mg di EYFP-Parkin (eccitazione / emissione 514/527) e 1 mg pDsRed2-Mito (eccitazione / emissione 565/620) alla sospensione cellulare.
  6. Trasferire la soluzione nella cuvetta sterile utilizzando una Pasteur monouso (entrambi gli strumenti sono forniti con il kit) e l'elettroporazione utilizzando il programma di pre-set NIH / 3T3 U-030 (impulso singolo, tensione a 200 V, capacità 960 uF, tempo di impulso 20 millisecondi , numero di impulsi: 1).
  7. Subito dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 ml di mezzo fresco pre-riscaldato DMEM completo e inseminare la cella in 6 cm Piatto tessuto-coltura live-imaging grado e incubate in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 a 37 ° C per 24 ore.

2. Time-Lapse Video Microscopia

  1. impostare la temperatura della camera del microscopio a 37 ° C prima dell'uso.
  2. A questo punto, preparare un supporto specifico imaging dal vivo di procedere con il protocollo sperimentale. Preparare il supporto di immagini dal vivo come segue; miscela DMEM privo di fenolo supplementato con 10% di siero fetale bovino, 2 mmol / l L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina. Pre-riscaldare il mezzo di imaging in tempo reale a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  3. Eliminare il medium delle cellule elettroporate di aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di terreno di immagini dal vivo pre-riscaldato, con una pipetta P1000 e incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C.
  4. Durante il periodo di incubazione piatto, afflusso 5% di CO 2 nella camera già del microscopio ad una temperatura stabile di 37 ° C.
  5. Posizionare la piastra con le cellule elettroporate nella camera del microscopio evitando i principali movimenti o oscillazioni.
  6. Utilizzando l'interfaccia software, impostare il microscopio per rilevare sia fluoresegnali scence dalle proteine ​​di fusione codificate dai vettori co-trasfettate, EYFP-Parkin (range eccitazione 495-510 nm e la gamma di emissione 520-550 nm, verde) e il pDsRed2-Mito (eccitazione massima 558 nm ed emissione massima 583 nm, rosso).
    1. Aprire il software di video microscopia time-lapse. Nel menu superiore selezionare il FITC per EYFP-Parkin e rodamina per pDsRed2-Mito. Nel menu superiore selezionare l'ingrandimento (20X).
  7. Utilizzando l'interfaccia del software, cercare la singola cellula che esprime entrambi i vettori co-trasfettate e registrare la posizione. Ripetere questa operazione fino a quando viene raccolto un minimo di 10 cellule per ogni condizione sperimentale (gruppo sperimentale).
    1. Selezionare il menu "Applicazioni" e cliccare su Multi Dimensional acquisizione. Nelle finestre Multi Dimensional Acquisizione selezionare i parametri necessari, quali il numero di acquisizioni, l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione e la posizione della cella registrata. Clicca su "Acquisisci"Per avviare il processo di acquisizione.
  8. Avviare l'acquisizione basale sia EYFP-Parkin e segnale fluorescente DsRed2-Mito raccolta immagini ogni 5 min per un intervallo totale di 15 min.
  9. Preparare pre-riscaldato mezzo di imaging in tempo reale con una concentrazione di FCCP due volte superiore alla concentrazione finale di lavoro (0,1 - 10 pM, dipendente dal tipo cellulare).
  10. Interrompere il processo di acquisizione e aggiungere delicatamente 1 ml di pre-riscaldato medie immagini dal vivo con FCCP nella piastra all'interno della camera del microscopio con una pipetta P1000.
  11. Riavviare il processo di acquisizione come precedentemente descritto, per un periodo totale di 3 ore, utilizzando la posizione registrata. Salvare tutte le immagini acquisite per analizzare e creare un video del processo mitophagic quando l'acquisizione è finita.

3. Analisi

  1. Raccogliere tutte le immagini acquisite in formato ".tiff" su un personal computer
  2. Aprire le immagini con una grafica morbidaware e definire l'intervallo temporale si è verificato dal mitocondriale indotta depolarizzazione con FCCP alla prima immagine che mostra il reclutamento di Parkin nella membrana mitocondriale (Le immagini sono acquisite ogni 5 minuti). Ripetere questa analisi per ogni cella nel gruppo sperimentale.
  3. Etichettare la prima cella della colonna su un foglio con il nome sperimentale gruppo. Per ogni gruppo sperimentale, misurare gli intervalli temporali per Parkin assunzione di un minimo di 10 cellule. Fare una media degli intervalli temporali calcolati per Parkin reclutamento e definire la deviazione standard per ciascun gruppo sperimentale (Media ± SD, N = 10).
    1. Organizzare in colonne singoli intervalli temporali calcolati. Ogni colonna contiene il n = 10 misurazioni del gruppo sperimentale.
    2. Selezionare la "media" funzione dal menu Formula Builder. Selezionare i dati nella colonna. Selezionare la funzione "deviazione standard" dal menu Formula Builder. Select i dati nella colonna.
  4. Usando un approccio statistico, confrontare i gruppi sperimentali che applicano la statistica appropriata per definire una differenza significativa nella dinamica mitophagy tra i gruppi sperimentali. (Per esempio, due gruppi = di Student t-test, tre o più gruppi = ANOVA più un test post-hoc)

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Risultati

Qui, si mostra come il video time-lapse microscopia è una tecnica potente che può essere utilizzato per seguire gli eventi molecolari di proteine ​​fluorescenti-taggato in una singola cella. I risultati rappresentativi mostrano anche come questa tecnica permette l'acquisizione di immagini di alta qualità. Quando le immagini del processo molecolare, si ottengono, abbiamo la possibilità di analizzare in modi diversi. Qui, analizziamo l'intervallo di tempo tra l'inizio d...

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Discussione

microscopia time-lapse può essere definita come la tecnica che si estende cellule vive da una singola osservazione in tempo per l'osservazione delle dinamiche cellulari per lunghi periodi di tempo. Questa metodologia è distinto da un semplice confocale microscopia cellule in vivo perché permette all'osservatore di identificare in tempo reale una singola proteina fluorescente-tag e seguire la sua dinamica all'interno di una singola cella vivo. Infatti, la microscopia confocale può facilmente identifica pr...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

This work was supported in part by NIH grants (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), the Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), a grant from the Breast Cancer Research Foundation, generous grants from the Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) and a grant from the Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). In part this work was supported by an American Italian Cancer Foundation postdoctoral fellowship (G.D.) and Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036).The Department specifically disclaims responsibility for an analysis, interpretations or conclusions. There are no conflicts of interest associated with this manuscript.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Pre-warm at 37 °C before use
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycinCorning Life Science30-002-CIPre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vectorAddgene23955
pDsRed2-Mito expression vectorClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

Riferimenti

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