휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

요약

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

초록

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

서문

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled ^1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy ^1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways ^6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control⁹. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy ¹⁰. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease ⁷. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) ¹¹. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS¹². Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain ¹³. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria¹⁴. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

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프로토콜

모두 발현 벡터 EYFP - 파킨과 pDsRed2 - 미토와 섬유 아세포 1. Electroporation에

1. 100 ㎎ / ㎖ DMEM (둘 베코 변형 이글 배지), 10 % 소 태아 혈청, 2 밀리몰 / ℓ L- 글루타민, 100 U / ㎖의 페니실린으로 보충 된 배지를 이용하여 10cm 조직 배양 플레이트에 불멸화 마우스 배아 섬유 아세포 성장 및 37 ℃에서 5 % CO _{2를 함유하는} 가습 분위기 스트렙토.
   1. 80 %의 세포 생장에서 HPO ₄ KH 2.4 g을 멸균 흡인 완전한 DMEM 배지를 버리고 멸균 1X 인산 완충 용액 10 ㎖ (PBS) (NaCl을 80 g, KCl을 2.0 g, _나트륨이 14.4 g을 추가 7.4) : ₂ PO ₄ 1 L은 H ₂ O, PH 증류.
   2. 멸균 흡입하여 PBS를 버리고 트립신 - EDTA 0.25 % 1 ㎖를 추가합니다. (- 3 분 2) 세포가 분리 될 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. _, 완전한 DMEM 배지 4 ML을 추가 세포를 재현 탁하고 10을 꺼내(6) 상기 혈구 계산을위한 세포 현탁액 L.
      참고 : 16 코너 사각형의 한 세트의 셀의 개수는 셀 × ¹⁰⁴ / ㎖의 수에 해당되도록 혈구가 설계된다.
2. 일렉트로 과정 24 시간 이전에 10cm의 조직 배양 접시 위에 시드 1 × ¹⁰⁶ 세포.
3. 멸균 흡입에 의해 완전한 DMEM 매체를 취소하고 멸균 PBS 10 ㎖를 추가합니다. 멸균 흡입하여 PBS를 버리고 트립신 - EDTA 0.25 % 1 ㎖를 추가합니다. (- 3 분 2) 세포가 분리 될 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 완전 DMEM 배지 4 ㎖에 첨가하고 15 ㎖의 튜브에 세포를 재현 탁.
4. 냉장 원심 분리기 (4 °에 C)를 사용하여 5 분 동안 250 XG에서 세포를 스핀 다운. 멸균 흡인에 의해 뜨는을 취소하고 멸균 PBS 1 ml의 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 5 분 동안 250 XG에서 세포를 스핀 다운.
5. 멸균 흡입하여 상층 액을 버리고, 100 μL O를 추가전기에 대한 F 솔루션 믹스 세포 펠렛에 (82 기업 솔루션 (1)의 전기 솔루션 V + 18 μL의 μL) 부드럽게 피펫 팅하여 펠렛을 재현 탁 (자세한 내용은 사용 설명서를 참조하십시오). 세포 현탁액에서 EYFP - 파킨 (여기 / 방출 527분의 514) 및 1 μg의 pDsRed2 - 미토 (여기 / 방출 620분의 565)의 2 μg의 추가.
6. 일회용 파스퇴르를 사용하여 멸균 큐벳에 대한 해결책을 (모두 도구 키트와 함께 제공)로 이동하고, 미리 설정된 프로그램 NIH / 3T3 U-030 (단일 펄스 전압을 200 V, 용량 960 μF, 펄스 시간이 20 밀리 초를 사용 electroporate , 펄스 수 : 1).
7. 37 ℃에서 5 % CO _2를 함유하는 가습 분위기 중에서 즉시 일렉트로 후 신선한 미리 예열 완전 DMEM 배지 500 ㎕를 추가하고, 6cm 조직 배양 플레이트 라이브 영상 급의 전지를 시드 및 부화 24 시간.

2. 시간 경과 비디오 현미경

사용하기 전에 37 ° C에서 현미경의 챔버의 온도를 설정합니다.
1. 이때, 실험 프로토콜을 수행 할 특정 라이브 영상 매체를 준비한다. 다음과 같이 라이브 영상 매체를 준비; 혼합 DMEM 페놀없이 10 % 소 태아 혈청, 2 밀리몰 / ℓ L- 글루타민, 100U / ml 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신으로 보충. 수욕에서 37 ° C에서 라이브 영상 매체를 미리 가온.
2. 멸균 흡인 일렉트릭 세포의 배지를 버리고 P1000 피펫을 사용하여, 미리 예열 라이브 영상 배지 1 ㎖을 추가하고, 37 ℃에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다.
3. 37 ℃의 온도에서 안정한 이미 현미경의 챔버 내의 플레이트 잠복기, 유입 5 % CO ₂ 중.
4. 주요 움직임이나 진동을 방지 현미경의 챔버로 일렉트릭 세포와 접시를 놓습니다.
5. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여, 두 fluore를 검출하기 위해서 현미경을 설정할공동 형질 벡터에 의해 코딩되는 융합 단백질에서에서 scence 신호 EYFP-파킨 및 (여진 범위 495 nm의 발광 범위 녹색 520-550 나노 미터, 510)를 pDsRed2-미토 (여진 최대 558 nm의 발광 최대 583 nm의 빨간).
   1. 시간 경과 비디오 현미경 소프트웨어를 엽니 다. 상단 메뉴에서 pDsRed2 - 미토에 대한 EYFP - 파킨과 로다 민에 대한 FITC를 선택합니다. 상단 메뉴에서 배율 (20 배)을 선택합니다.
6. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여, 두 공동 형질 발현 벡터를 단일 셀의 모양과 위치를 등록한다. 10 셀의 최소마다 실험 조건 (실험 그룹)에 대해 수집 될 때까지이 단계를 반복합니다.
   1. 메뉴 "앱"을 선택하고 멀티 차원 취득을 클릭합니다. 다중 차원 취득 창에서 이러한 인수의 수, 각 수집 및 기록 된 셀의 위치 사이의 시간 간격과 필요한 매개 변수를 선택합니다. 획득 "을 클릭합니다"인수 과정을 시작합니다.
7. EYFP - 파킨과 15 분의 총 간격 이미지마다 5 분을 수집 DsRed2 - 미토 형광 신호 모두의 기저 인수를 시작합니다.
8. 최종 작업 농도보다 두 배 높은 FCCP의 농도로 예열 라이브 영상 매체를 준비 (0.1-10 μM, 세포 유형에 따라 다름).
9. 인수 과정을 중단하고 P1000 피펫을 사용하여 현미경의 챔버 내부의 플레이트에 FCCP에 미리 예열 라이브 영상 매체의 부드럽게 1ml를 추가합니다.
10. 이전에 기록 된 위치를 이용하여 3 시간의 총 시간 동안, 한 바와 같이, 획득 프로세스를 재시작. 를 분석하고 수집이 끝날 때 mitophagic 과정의 비디오를 만들기 위해 모든 획득 된 영상을 저장합니다.

3. 분석

1. 개인용 컴퓨터의 "티파니"형식의 모든 획득 된 영상을 수집
2. 그래픽 소프트와 이미지를 엽니 다도자기와 시간 간격을 정의는 (사진 매 5 분을 취득) 미토콘드리아 막에 파킨의 채용을 보여주는 첫 번째 이미지에 FCCP와 미토콘드리아 유도 - 탈분극에서 발생했습니다. 실험 그룹의 각 셀에 대해 이러한 분석을 반복합니다.
3. 실험 그룹 이름의 스프레드 시트에 열의 첫 번째 셀을 레이블. 각 실험군의 경우, 10 셀의 최소의 파킨 모집을위한 시간 간격을 측정한다. 파킨 모집하기위한 계산 시간 간격의 평균을 각 실험군의 표준 편차를 정의하는 (평균 ± SD를, N = 10).
   1. 열 하나의 계산 된 시간 간격으로 구성합니다. 모든 열은 N = 실험군의 10 측정이 포함되어 있습니다.
   2. 수식 작성기 메뉴에서 기능 "평균"을 선택합니다. 열의 데이터를 선택합니다. 수식 작성기 메뉴에서 기능 "표준 편차"를 선택합니다. 실리열의 데이터 캐럿.
4. 통계적 방법을 사용하여, 실험군 간의 mitophagy의 동적 상당한 차이를 정의하기 위해 적절한 통계인가 실험군과 비교. (예를 들어, 두 그룹 = 스튜던트 t- 검정 세 이상의 그룹 = ANOVA 플러스 사후 시험)

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결과

여기서, 우리는 시간 경과 비디오 현미경은 단일 세포에 형광 태그 단백질의 분자 이벤트를 수행하는 데 사용할 수있는 강력한 기술이다 ​​방법을 보여줍니다. 대표 결과는 또한이 기술은 높은 품질의 이미지의 취득을 허용하는 방법을 보여줍니다. 분자 프로세스의 이미지가 획득 될 때, 우리는 다른 방법을 분석 할 수있는 기회를 가질 수있다. 여기서는 선택적 미토콘...

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토론

저속 현미경은 장시간 휴대 역학의 관​​찰 시간에 하나의 관측으로부터 생균 촬상 확장 기술로 정의 될 수있다. 그것은 관찰자 실시간 단일 형광 표지 된 단백질을 확인하고 단일 생균 내부 동적를 수행 할 수 있기 때문에이 방법은 단순 또는 공 초점 현미경 생균과 구별된다. 사실, 공 초점 현미경 쉽게 형광 항체를 이용하여 면역 표지 된 단백질을 식별하지만, 상기 셀 및 그 실제 환경에서의 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning Life Science	10-013-CV	Pre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEM	Corning Life Science	17-205-CV	Pre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	Pre-warm at 37 °C before use
L-Glutamine	Gibco	25030	Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycin	Corning Life Science	30-002-CI	Pre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vector	Addgene	23955
pDsRed2-Mito expression vector	Clontech	632421
Nucleofector 2B device	LONZA	AAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3	LONZA	VCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope	CARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
MetaMorph	Molecular Devices	Experimental Builder
ImageJ	National Institute of Health	Experimental Builder