マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

要約

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

要約

樹状細胞（DC）は、取得処理と、T細胞媒介性免疫を開始するための分子を抗原提示細胞に抗原を提示するために主に関与プロフェッショナル抗原提示細胞です。樹状細胞は、いくつかの表現型および機能的異種のサブセットに分離することができます。脾臓樹状細胞の三つの重要なサブセットは^、CD8αPOSおよび^CD8αNegの細胞形質です。形質のDCは、型の天然の生産Iインターフェロンと抗ウイルスT細胞免疫のために重要です。 ^CD8αNegの DCサブセットは、MHCクラスII抗原提示に特化されており、中央にCD4 T細胞のプライミングに関与しています。 CD8α ^順位 DCは、外因性抗原とCD8 T細胞プライミングの交差提示を主に担います。 CD8α ^順位 DCは、特殊なTセルへのCD1d分子による糖脂質抗原の提示で最も効率的であることが実証されています不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞として知られているリットル人口。 FLT-3リガンドの投与は、最終的にマウスモデルにおける末梢リンパ器官における樹状細胞の増殖を生じる、骨髄由来の樹状細胞前駆体の遊走の頻度を増加させます。我々は、異なるDCサブセットのインビボでの能力を比較するため、細胞移入実験において使用するための機能的樹状細胞を大量に精製するために、このモデルを適応しています。

概要

「大きな星状（ギリシャデンドロン ）細胞」は、リンパ系器官¹に見られるような樹状細胞（DC）は、ほぼ40年前に発見されました。多くの研究は、DCが効果的にナイーブT細胞^2を刺激^することができる唯一の抗原提示細胞であることを示しています。これらの細胞の主要な機能は、抗原提示分子への取り込みおよび抗原の提示とその効率的な処理およびこれらのロードをです。マウスの脾臓において、DCは、形質従来のサブセットに分離することができます。形質DCはCD11cの低い発現とB220とのGr-1の高レベルによって特徴付けられます。彼らはまた、表面マーカーmPDCA1に対して陽性であると私は受容体9（TLR9）リガンドなどの通行料に応じて型インターフェロンを分泌します。従来のDCはCD11cのとMHCクラスII発現のために高いです。彼らはそのようなCD4、CD8α、DEC205、CDなどの表現型マーカーの表面発現に基づいて、三つの異なるサブセットに分割することができます11b及び（33D1抗体によって認識DCIR2、）樹状細胞阻害受容体2タンパク質^3,4。 CD8α ^順位のDCも、CDC1として知られているDEC205に陽性であるが、このようなCD11bおよび33D1などの骨髄性マーカーについて陰性です。また、CDC2呼ば^CD8αNegの DCは、33D1、CD11bおよびCD4陽性であるが、DEC205を欠いています。ダブルネガティブサブセット（CD4およびCD8αの両方のための、すなわち 、負）は、比較的まれで、DEC205および33D1のために負です。これは、少なくとも特徴づけられたサブセットであり^{、CD8αNegの} DCのあまり分化の形態であってもよいです。

様々なDCサブセットにおける表現型の違いはまた、in vivoでの機能を拡張します。 ^CD8αNegの DCは、高い食作用であり、主にCD4 T細胞³にMHCクラスIIを介して外因性抗原を提示すると考えられています。対照的に、CD8α ^順位 DCは、MHCクラスIの可溶性タンパク質抗原の提示のために特化されメカニズムに交差提示と呼ばれます。交差提示の結果は、これらのDC ⁵の活性化状態に依存し、細胞傷害性T細胞（CTL）または制御性T細胞を^{6 2,7}の開発の拡大につながることができます。感染アポトーシス細胞由来抗原の提示は、強力なCTL応答^9を誘導^するのに対し、主としてT細胞⁸の削 ​​除に抗DEC205抗体媒介送達の結果を用いて、CD8α ^順位 DCに抗原の標的。

ペプチド抗原の認識に加えて、哺乳動物の免疫系は、脂質と糖脂質抗原を認識するように進化してきました。これらの抗原は、種々の哺乳動物における関連する複数の形で存在するMHCクラスI様細胞表面タンパク質であるCD1分子によって提示されます。マウスでは、CD1dのと呼ばれる高度に保存されたCD1分子の単一型は、糖脂質抗原¹⁰のプレゼンテーションを担当しています。メジャーな CD1d /脂質複合体を認識するT細胞の集団は、インバリアントNKT細胞（iNKT細胞）と呼ばれます。これらの細胞は、多様^11が制限されているTCRβ鎖と対になっている不変のTCRα鎖からなる半不変T細胞受容体（TCR）を発現します。増殖し、活性化されたエフェクターT細胞になるように分化する必要があり、従来のT細胞とは異なり、iNKT細胞は、エフェクター集団として存在し、糖脂質、投与¹²後に迅速に対応を開始します。生理学的に関連する脂質抗原提示細胞の同定は、研究の活発な領域であり、例えば、B細胞、マクロファージ及び樹状細胞などのいくつかの異なる細胞型は、この機能を実行するために提案されています。しかし、DCのCD8α ^{順位サブセット}マウスiNKT細胞¹³およびCD8 T細胞の¹⁴の糖脂質媒介性クロスプライミングの取り込みおよび脂質抗原の提示を媒介する主要な細胞であることが実証されました。

別抗原提示細胞による抗原提示の効率を比較するためにove_content ">、直接的なアプローチは、ナイーブな宿主に抗原の等量でパルス精製APCの異なる種類を転送することである。このタイプの細胞移入実験は、多くの場合、免疫学的研究のために行われます。これらの細胞は、それらが全細胞¹⁵の2％未満を構成しているリンパ器官のような稀な集団が存在しかし、 エクスビボ抗原処理されたDCと転写研究を行うことは、困難である。ドナー動物におけるこれらの細胞の発達を強化することが必要です分離プロトコルの効率を増加させます。

それは、共通のpDC、CD8 ^POSおよびCD8 ^Negの DCサブセットの生成に必要とされるリンパ系および骨髄系共通前駆細胞、明示FMS関連受容体チロシンキナーゼ3（FLT-3）ことが知られています。 in vivoでのFlt-3リガンド（FLT-3L）投与、emigrat時に骨髄からのFlt-3を発現する前駆細胞のイオンは、末梢リンパ器官の増加播種およびそれらの成熟DCの子孫¹⁶の膨張を生じ、増加されます。 FLT-3の発現はB、TまたはNK細胞の分化経路へのコミットメントの間に失われます。したがって、最小限の変更は、FLT-3Lの投与の際に、これらの細胞で観察されます。 DC集団において同様の拡大はFLT-3L ^17,18の持続的な全身レベルを提供するための簡単で経済的な方法を提供するマウスのFlt-3Lを、分泌B16メラノーマ細胞株の注入によって生成された腫瘍を有するマウスで観察されます。このアプローチを使用して、我々は大幅その後の実験のために単離することができ、これらの細胞の収量を増加させる、マウス脾臓中のすべての通常のDCサブセットの拡大を刺激するのFlt-3Lを分泌B16黒色腫細胞の移植に基づくプロトコルを開発しました。 14日間皮下イムを次の - 私たちは常に10内にいることを見つけます総脾臓細胞の60％ - FLT-3分泌腫瘍のプランテーションは、マウス40を構成するDCの著しい富化と脾腫発症します。これらの脾臓から、異なるDCサブセットは、サブセット特異的な表現型マーカーを用いる標準的な市販の細胞精製キットを用いて高純度で単離することができます。

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プロトコル

動物実験は、制度的動物飼育と使用委員会（IACUC）から承認されたガイドラインに従って行われています。無菌性を必要とするすべての手順は、生物学的安全キャビネットの中で行われています。

マウスにおけるB16.Flt3L黒色腫の1移植

1. 培養物を37℃で10％CO ₂で、完全DMEM培地中0.5×10 ⁶細胞/ mlの密度でT25組織培養フラスコ中でFLT-3を発現するB16黒色腫細胞株。細胞は〜90％コンフルエンス（〜20時間）に到達するまでに成長。
2. トリプシン消化することによって細胞を採取します。吸引し、細胞培養培地およびPBSで付着細胞を洗浄します。 0.05％トリプシンの5 mlを加え、37℃で5分間インキュベートします。プロテアーゼ消化をクエンチ冷20 mlのを完全DMEM培地ウシ胎児血清（FCS）を含有する（4℃）を加えます。軽く優しく上下にピペッティングし、続いてタップすることで細胞を持ち上げ。
3. 300での遠心分離により細胞を回収4℃で10分間XG。血球計数器または自動化された細胞生存率カウンターを用いて細胞を数えます。 PBS中の10 ⁸細胞/ mlの密度に再懸濁します。
4. 100μlの細胞懸濁液（10 ⁷細胞）で首の基部にMachholz ら ¹⁹によって記載されるように、皮下注射により腫瘍細胞と移植したマウス（C57BL / 6または他の組織適合性株）。
5. 臓器を採取するために動物を犠牲にする前に（12日 - - 直径10ミリメートル、通常7 2）腫瘍が触知可能または可視になるまで成長することを可能にします。

腫瘍を有するマウスからの脾臓単一細胞懸濁液の調製

1. イソフルランの過剰摂取（> 5％のイソフルランの流量を調整し、停止を呼吸した後、露光、少なくとも2分を続ける）でマウスを麻酔。安楽死のための制度ガイドラインに従って、頚椎脱臼によりFLT-3黒色腫腫瘍を有するマウスを生け贄に捧げます。
2. ディ滅菌はさみ²⁰の助けを借りて、無菌技術を使用して、70％エタノールと収穫脾臓で皮膚sinfect。
3. バイオセーフティキャビネットへの輸送のための滅菌ペトリ皿に脾臓を置きます。無菌条件下で、ここからすべての手順を実行します。
4. 新鮮なペトリ皿に脾臓を移し、RPMI培地で洗浄します。メスを用いて、小さな（〜0.2センチメートル^2）個に脾臓をカット。コラゲナーゼ/ DNase溶液10mlで37℃にて30分間インキュベートします。
5. 70μmのセルストレーナーに脾臓組織の部分的に消化されたサスペンションを注ぎます。 5ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、ストレーナのメッシュを通して残りの組織片を圧縮します。
6. 新鮮な培地10mlのメッシュフィルターを洗浄し、フィルターを廃棄します。細胞をペレット化するために4℃で10分間300×gで懸濁液を遠心。
7. 上清を吸引し、RBC溶解緩衝液2ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 RT fでインキュベートまたは10分。完全RPMI培地10mlを加えることによってRBC溶解緩衝液をクエンチしました。
8. 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。適切な体積の再懸濁は、Fcブロック抗体（2.4G2）20μg/ mlを含む細胞選別緩衝液（ 例えば、MACS）に10 ⁸細胞/ mlの細胞密度を達成します。

脾臓単一細胞懸濁液からの形質のDC、CD8α ^順位 DCおよび^CD8αNegの DCの3精製

注： 図1に示すように単一細胞懸濁液からの脾臓DCサブセットの単離は、多段階の手順ですべての予め冷却した緩衝液を用いてステップ4の温度を維持するために氷水浴実行- 8°Cを。プロトコルの次のセクション内のすべての試薬 ​​容量）が10 ⁸細胞/ mlで脾臓細胞懸濁液200μlの初期入力するために計算されます。これは、スケールアップすることができますかダウン最初のステップ（3.1.1及び3.2.1）に比例して細胞懸濁液の体積（常に1×10 ⁸細胞/ mlの濃度で）および他の試薬 ​​を変更することにより、ニーズに基づきます。それに応じて、すべての後のステップで試薬容量を調整します。 1×10 ⁸ / mlの脾臓細胞懸濁液の100μlで始まる場合、たとえば、すべてのステップで半分に述べた試薬容量を使用します。

1. 形質DCの単離（PDC）
   1. 脾臓細胞懸濁液の200μlに形質DCアイソレーションキットで提供ビオチン標識抗体カクテルを300μlを追加します。
   2. 十分に混合し、15分間、氷水浴中でインキュベートします。浮遊細胞を維持するために、および抗体結合を最大化するためにチューブを3分毎にをタップします。
   3. バッファを選別12 mlのCellを加え、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。未結合ビオチン化抗体を除去するために上清を吸引。
   4. 細胞を再懸濁し細胞選別緩衝液500μlにペレット。抗ビオチン抗体結合ビーズを300μlを追加します。繰り返しステップ3.1.2と3.1.3。
   5. 上清を捨て、細胞選別の緩衝液2ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。 RTで予備冷却されたバッファを使用して、この時点から、すべての手順を実行します。
   6. 磁気スタンドにLSカラムをソートする新鮮な磁気活性化細胞を置きます。バッファを細胞選別5mlでカラムを洗浄し、平衡化します。
   7. カラムベッドの表面の中央に静かにそれを適用し、カラムに細胞懸濁液をピペットで。フロースルーを収集します。
   8. セルソーティング緩衝液10mlでカラムを洗浄します。この流れを収集し、ステップ3.1.7からのフロースルーと結合。 pDCには（FT1）を介して、このカラム流量に富んでいます。
   9. 4°C、2ミリリットルのセルソーティングバッファで再懸濁で5分間、300×gで遠心分離することによってFT1から細胞をペレット化し、新鮮なLSカラムに通して細胞を渡します3.1.8 - 、手順3.1.6を繰り返すこと。 2つの連続する列の使用は、単離された細胞の強化された純度をもたらします。
   10. ペレットを4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞、および2ミリリットルの完全RPMIで再懸濁します。必要になるまで氷上に置きます。
2. ^CD8αPOSおよび^CD8αNegの樹状細胞の単離
   注：この手順の最初のステップは、B、pDCに、TおよびNK細胞の枯渇です。
   1. 全脾臓細胞懸濁液（ステップ2.8で得られた10 ⁸細胞/ mlの1ミリリットル）で開始し、CD8α ^順位 DCアイソレーションキットで提供ビオチン結合抗体カクテルの100μlを添加します。
   2. よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。それらの標的細胞へのビオチン標識抗体の結合を最大化するために、穏やかに3分毎にチューブをタップします。
   3. バッファソートを12mlセルを追加し、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。吸引し、スーパー未結合ビオチン化抗体を除去するための浮遊性の。
   4. セルソーティング緩衝液150μlとCD8α ^順位 DC分離キットで提供される抗ビオチンビーズを100μlを加えます。よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。
   5. バッファソート10mLの細胞を加え、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
   6. 再懸濁し、1ミリリットルセルソーティングバッファ内のセルとステップ3.1.8を介して3.1.6の手順に従って、新鮮なLSカラム上を通過。
   7. 2（FT2）を介して、非標識の流れを収集し、カラムの保持物を捨てます。この標識されていない画分は^CD8αPOSおよび^CD8αNegの DCに濃縮されています。
   8. 4℃で5分間、300×gで遠心分離することによってFT2で細胞をペレット化。
   9. 1ミリリットルセルソーティングバッファ内の細胞を再懸濁し、CD8α ^順位 DC分離キットで提供される抗CD8α共役磁気ビーズを200μlを追加します。
   10. 代表ステップ3.2.6を介して3.2.2を食べます。カラムのフロースルーは^CD8αNegの樹状細胞について濃縮し、CD8α ^順位のDCのために枯渇しています。これは、3（FT3）を通る流れをラベル付けされています。
   11. CD8α ^順位 DCはカラムに保持溶出するために、磁石から列を削除し、セルソーティング緩衝液5mlを追加し、LSカラムを備えたプランジャーを使用して、列の行列をパージします。
   12. 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。 1ミリリットルセルソーティングバッファ内の上清を吸引および再懸濁。純度を高めるために、手順を繰り返して、新鮮なLSカラムに通して再び溶出細胞を実行すると、フロースルーを廃棄し、3.2.11のように保持された細胞を収集除いて、3.1.8に3.1.6。
   13. FT3懸濁液から^CD8αNegの DCを精製するために、4℃で5分間、300×gの遠心分離によってFT3をペレット化し、細胞選別緩衝液300μlで再懸濁。
   14. 抗CD11cのMAGの100μLを加えます磁ビーズ。よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。
   15. 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によってバッファー、ペレット細胞を選別10mLの細胞を加えます。
   16. 繰り返しは、3.1.8を介して3.1.5を繰り返します。 ^CD8αNegの DCは積極たCD11cビーズで選択され、カラムに結合されています。フロースルーを廃棄することができます。
   17. ステップ3.2.11で説明したように精製された^CD8αNegの DCを収集するために、カラムに保持された細胞を溶出させます。

抗原およびセル転送4.パルシングのAPC

1. 生細胞と死細胞を区別するためにトリパンブルー排除^21を使用して精製した後、生細胞を数えます。
2. 選択した抗原で細胞をインキュベートします。 100 nMの濃度¹³でアルファガラクトシルセラミド（αGalCerの）と呼ばれる糖脂質抗原の類似体を使用してください。一般的に、プレート10 ⁶生細胞/ウェルの完全RPMI培地中の超低ATTACを使用して、hment U底96ウェルプレートは、細胞接着を最小限にします。 4時間- 1、37℃で5％CO ₂雰囲気中で細胞をインキュベートします。
3. 静かに数回ピペッティングすることにより細胞を回収します。剪断力から細胞の損傷を最小限に抑えるために広い口径のピペットチップを使用してください。 PBSでウェルを洗浄し、細胞の収穫を最大化するために、これらの洗浄をプール。
4. 4℃で5分間、300×gで細胞をペレット化し、PBS中で所望の濃度に再懸濁します。一般的に、レシピエント動物あたり200μlの100万個の細胞を注入します。宿主動物への投与前に生存能力を最大化するために、細胞を氷上に保管してください。
5. マウスに静脈内のいずれかの側尾無駄や眼窩後静脈叢^19を介して細胞を注入します。 1mlシリンジに27 G針を使用し、マウス当たり0.1ミリリットルの最大容量を注入します。

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結果

この手順の結果は、移植された黒色腫細胞によって発現されるマウスのFlt-3LによるDCサブセットの拡大に​​依存しています。 B16.Flt3L腫瘍は、C57BL / 6マウス由来し、拒絶反応のために設立さになるように、腫瘍の失敗を避けるために、その株のバックグラウンドを持つ動物に移植する必要があります。場合によっては、関心のある経路または受容体シグナル伝達の既?...

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ディスカッション

樹状細胞は、T細胞応答のプライミングに関与する細胞を提示する主要なプロフェッショナル抗原であることが受け入れられています。彼らの主な機能は、T細胞に提示するための抗原を取り込み、処理することにより、組織微小環境を調査することです。特定のDCサブセットの機能を研究するために、これらは、それらの正常な表現型および機能を維持する方法を使用して、十分な数の単離す...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.