Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Zusammenfassung

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Zusammenfassung

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, in erster Linie verantwortlich für die Erfassung, Verarbeitung und Antigenen auf Antigen-präsentierenden Molekülen präsentiert T-Zellen vermittelte Immunität zu initiieren. Dendritische Zellen können in mehrere phänotypisch und funktionell heterogenen Untergruppen getrennt werden. Drei wichtige Untergruppen von Milz- dendritischen Zellen sind plasmazytoiden, CD8a ^Pos und CD8a ^Neg Zellen. Die plasmazytoiden DCs sind natürliche Produzenten von Typ I Interferon und sind wichtig für die anti-virale T-Zell-Immunität. Die CD8a ^Neg DC Teilmenge wird für MHC - Klasse - II - Antigen - Präsentation spezialisiert und ist in Priming CD4 - T - Zellen zentral beteiligt. Die CD8a ^Pos DCs sind in erster Linie verantwortlich für die Kreuzpräsentation von exogenen Antigenen und CD8 T - Zellen - Priming. Die CD8a ^Pos DCs nachgewiesen wurden bei der Präsentation von Glycolipid - Antigenen durch CD1d Moleküle an eine spezialisierte T cel am effizientestenl Bevölkerung als unveränderliche natürliche Killer-T (iNKT) Zellen bekannt. Verabreichung von Flt-3-Ligand erhöht die Frequenz der Migration der dendritischen Zellvorläuferzellen aus Knochenmark, letztendlich in Expansion der dendritischen Zellen in peripheren lymphoiden Organen in murinen Modellen resultiert. Wir haben dieses Modell angepasst für eine große Anzahl von funktionellen dendritischen Zellen zu reinigen , die Verwendung in der Zellübertragung Experimente in vivo Fähigkeits verschiedener DC Untergruppen zu vergleichen.

Einleitung

Dendritische Zellen (DC) wurden vor fast vierzig Jahren entdeckt , als die "große stel (griechisch Dendron) Zelle" ¹ in lymphatischen Organen. Viele Studien haben gezeigt , dass DCs die einzigen Antigen - präsentierende Zellen sind , die effektiv naiver T - Zellen zu stimulieren ^2. Eine wichtige Funktion dieser Zellen ist die Aufnahme und Präsentation von Antigenen und deren effiziente Verarbeitung und Laden derselben auf Antigen-präsentierenden Molekülen. In der Milz der Maus können DCs in plasmazytoiden und konventionelle Subsets getrennt werden. Die plasmazytoiden DCs zeichnen sich durch niedrige Expression von CD11c und ein hohes Maß an B220 und Gr-1 aus. Sie sind auch positiv für die Oberflächenmarker mPDCA1 und absondern Typ I in Reaktion auf maut Interferon like Rezeptor 9 (TLR9) Liganden. Die herkömmlichen DCs sind hoch für CD11c und MHC-Klasse-II-Expression. Sie können auf der Grundlage der Oberflächenexpression von phänotypischen Markern wie CD4, CD8a, DEC205, CD in drei verschiedene Untergruppen aufgeteilt werden,11b und dendritischen Zellen hemmenden Rezeptor 2 (DCIR2, anerkannt durch den 33D1 - Antikörper) Proteine ^​​3,4. Die CD8a ^Pos DCs sind auch als CDC1 bekannt ist , sind positiv für DEC205, aber negativ für myeloische Marker wie CD11b und 33D1. Die CD8a ^Neg DCs, auch cdc2 genannt, sind positiv für 33D1, CD11b und CD4 aber es fehlt DEC205. Die doppelt negative Untergruppe (dh negativ für beide CD4 und CD8a) ist relativ selten, und ist negativ für DEC205 und 33D1. Es ist die am wenigsten charakterisierten Teilmenge und kann eine weniger differenzierte Form von CD8a ^Neg DC sein.

Phänotypischen Unterschiede in den verschiedenen Teilmengen DC auch auf ihre in vivo - Funktionen erweitern. Die CD8a ^Neg DCs sind stark phagozytierenden und werden gedacht , exogene Antigen zu präsentieren hauptsächlich über MHC - Klasse - II an CD4 - T - Zellen ^3. Im Gegensatz dazu sind die CD8a ^Pos DCs Fach zur Präsentation von löslichem Protein - Antigen auf MHC - Klasse Iin einem Mechanismus Kreuzpräsentation genannt. Das Ergebnis der Kreuzpräsentation hängt von der Aktivierungsstatus dieser DCs ^5, und kann entweder zur Expansion von zytotoxischen T - Zellen (CTL) oder die Entwicklung von regulatorischen T - Zellen ^{6 2,7} führen. Targeting von Antigen an CD8a ^Pos DCs unter Verwendung von Anti-DEC205-Antikörper-vermittelte Abgabe resultiert im Wesentlichen in der Streichung von T - Zellen ^8, während Präsentation von infizierten apoptotischen Zellen abgeleiteten Antigenen induziert eine starke CTL - Antwort ^9.

Zusätzlich zur Erkennung von Peptidantigenen, hat das Immunsystem von Säugetieren entwickelt Lipid und Glycolipid-Antigene zu erkennen. Diese Antigene werden von CD1-Molekülen präsentiert werden, welche MHC-Klasse-I-like Zelloberflächenproteine, die in mehreren verwandten Formen in verschiedenen Säugetieren existieren. Bei Mäusen, die so genannte eine einzige Art von hochkonservierten CD1 - Molekül ist CD1d verantwortlich für die Präsentation von Glycolipid - Antigenen ^10. Der Bürgermeister Population von T-Zellen, die CD1d / Glykolipid Komplexe erkennen ist invariant NKT-Zellen (iNKT Zellen) genannt. Diese Zellen exprimieren ein semi-invariant T - Zell - Rezeptor (TCR) einer invariant TCR & agr; Kette zusammengesetzt , die mit TCR & bgr; Ketten gekoppelt ist , die ¹¹ Vielfalt begrenzt haben. Im Gegensatz zu herkömmlichen T - Zellen , die aktiviert Effektor - T - Zellen zu vermehren und zu differenzieren müssen zu werden, existieren iNKT Zellen als Effektor Bevölkerung und beginnen schnell nach Glykolipid Verwaltung ¹² reagiert. Identifizierung von physiologisch relevanten präsentierenden Zellen Lipid-Antigen ist ein aktives Forschungsgebiet, und mehrere verschiedene Zelltypen, wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen und DCs wurden vorgeschlagen, um diese Funktion auszuführen. Es wurde jedoch gezeigt , dass die CD8a ^Pos Teilmenge von DCs die primäre Zelle ist vermittelnde Aufnahme und Präsentation von Antigenen auf Lipid Maus iNKT Zellen ¹³ und Glycolipid - vermittelten cross-Priming von CD8 - T - Zellen ^14.

ove_content "> Um die Effizienz der Antigen-Präsentation durch verschiedene Antigen-präsentierende Zellen zu vergleichen, ein einfacher Ansatz ist, verschiedene Arten von gereinigten APCs gepulst mit äquivalenten Mengen an Antigen in naiven hosts. Cell Transfer Experimente dieses Typs übertragen werden häufig für immunologische Untersuchungen durchgeführt. Allerdings Durchführen eines Transferstudien mit ex vivo Antigen behandelt DCs ist eine Herausforderung, da diese Zellen so selten Populationen in lymphatischen Organen bestehen , wo sie machen weniger als 2% der gesamten Zellen ^15. daher ist es notwendig , die Entwicklung dieser Zellen in Spendertiere zu verbessern die Effizienz der Isolation Protokolle zu erhöhen.

Es ist bekannt , dass die gemeinsame lymphoiden und myeloiden Vorläufern gemeinsamen, die zur Erzeugung von pDC, CD8 ^Pos und CD8 ^Neg DC Subsets express fms-verwandte Rezeptor - Tyrosinkinase 3 (Flt-3) erforderlich sind. Bei der In - vivo - Flt-3 - Ligand (Flt-3L) Verwaltung, emigratIon von Flt-3 - Vorläuferzellen aus dem Knochenmark exprimiert , wird erhöht, ¹⁶ in der erhöhten Aussaat von peripheren lymphatischen Organen und den Ausbau ihrer reifen DC Nachkommen zur Folge hat . Die Expression von Flt-3 wird während der Verpflichtung zur B, T oder NK-Zell-Differenzierungswege verloren. Daher ist nur eine minimale Veränderungen in diesen Zellen auf Flt-3L Verabreichung beobachtet. Ähnliche Expansion in DC - Populationen in Mäusen beobachtet tragenden Tumoren , die durch Implantation eines B16-Melanomzelllinie sekretierenden murinen Flt-3L, die für die Bereitstellung anhalt systemische Spiegel von Flt-3L ^17,18 , ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Verfügung stellt. Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir ein Protokoll basiert auf der Implantation von B16-Melanomzellen sezer Flt-3L entwickelt, um die Expansion aller normalen DC Untergruppen in der Milz der Maus zu stimulieren und somit erheblich die Ausbeuten dieser Zellen zu erhöhen, die für die nachfolgenden Experimenten isoliert werden kann . Wir finden immer wieder, dass innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach subkutaner imPlantage des Tumors Flt-3 sezernierenden, Mäuse entwickeln Splenomegalie mit deutlichen Anreicherung von DCs 40 zu bilden - 60% der gesamten Milz-Zellen. Aus diesen Milzen können verschiedene DC Untergruppen mit hoher Reinheit unter Verwendung von handelsüblichen Zellreinigung Kits isoliert werden, die Teilmenge spezifischen phänotypischen Marker verwenden.

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Protokoll

Tierversuche werden in Übereinstimmung mit genehmigten Richtlinien der institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss (IACUC) durchgeführt. Alle Verfahren erfordern Sterilität sind in einem Bio-Sicherheitsschrank durchgeführt.

1. Die Implantation von B16.Flt3L Melanom bei Mäusen

1. Kultur der Flt-3 exprimierenden B16 - Melanomzelllinie in T25 - Gewebekulturkolben in einer Dichte von 0,5 x 10 ⁶ Zellen / ml in komplettem DMEM - Medium mit 10% CO ₂ bei 37 ° C. Wachsen, bis die Zellen erreichen ~ 90% Konfluenz (~ 20 h).
2. Ernte der Zellen durch Trypsin-Verdau. Absaugen Zellkulturmedien und waschen Sie die anhaftenden Zellen mit PBS. 5 ml 0,05% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Cold 20 ml komplettes DMEM-Medium (4 ° C) fötalem Kälberserum (FCS), enthaltend die Protease-Verdauung zu quenchen. Heben Sie die Zellen aus, indem Sie leicht durch sanftes Auf- und Abpipettieren gefolgt tippen.
3. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300xg für 10 min bei 4 ° C. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zelllebensfähigkeit Zähler. Resuspendieren zu einer Dichte von 10 ⁸ Zellen / ml in PBS.
4. Implantat - Mäuse (C57BL / 6 oder ein anderes histokompatiblen Stamm) mit Tumorzellen durch subkutane Injektion , wie beschrieben von Machholz et al. ¹⁹ an der Basis des Halses mit 100 ul Zellsuspension (10 ⁷ Zellen).
5. Lassen Sie den Tumor bis greifbar oder sichtbar zu wachsen (2 bis 10 mm im Durchmesser, in der Regel 7 bis 12 Tage), bevor die Tiere für Organentnahmen zu opfern.

2. Herstellung von Splenic Einzelzellsuspension von Tumor-tragenden Mäusen

1. Anesthetize Mäuse mit einer Überdosis von Isofluran (Flussrate von Isofluran auf> 5% einstellen und weiterhin Anschläge Exposition mindestens 2 Minuten nach der Atmung). Opfere die Flt-3-Melanomtumoren tragenden Mäusen durch Genickbruch gemäß gültiger Richtlinien für Sterbehilfe.
2. Disinfect die Haut mit 70% Ethanol und Ernte Milz unter aseptischen Bedingungen mit Hilfe einer sterilen Schere ^20.
3. Legen Sie die Milz in eine sterile Petrischale für den Transport zur Biosicherheit Schrank. Führen Sie alle Schritte von hier auf unter sterilen Bedingungen.
4. Übertragen Milz auf eine frische Petrischale und waschen mit RPMI-Medium. Schneiden Sie die Milz in kleine (~ 0,2 cm ²⁾ Stücke mit einem Skalpell. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C mit 10 ml Kollagenase / DNase-Lösung.
5. Gießen Sie die teilweise verdaute Suspension von Milzgewebe auf eine 70 um Zelle Sieb. Komprimieren der verbleibenden Gewebefragmente durch die Maschen des Siebs eine 5 ml Spritzenkolben verwendet.
6. Waschen Sie den Netzfilter mit 10 ml frischem Medium und entsorgen Sie den Filter. Zentrifugiere die Suspension bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C um die Zellen zu pelletieren.
7. Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 2 ml Puffer RBC-Lyse. Inkubieren bei RT foder 10 min. Quench den Puffer RBC-Lyse von 10 ml komplettem RPMI-Medium hinzugefügt wird.
8. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren in geeigneten Volumen Zelldichte von 10 ⁸ Zellen / ml in Zellsortierungspuffer (beispielsweise MACS) , enthaltend 20 ug / ml Fc-block - Antikörper (2.4G2) zu erreichen.

3. Reinigung von Plasmazytoide DCs, CD8a ^Pos DCs und CD8a ^Neg DCs von Splenic Einzelzellsuspension

Hinweis: Isolierung der splenic DC Untergruppen von Einzelzellsuspension ist ein mehrstufiges Verfahren , wie in 1 dargestellt Führen alle Schritte unter Verwendung von vorgekühlten Puffer und einem Eiswasserbad Temperatur bei 4 zu halten - 8 ° C.. Alle Reagenzienvolumina in dem folgenden Abschnitt des Protokolls für eine anfängliche Eingabe von 200 ul splenic Zellsuspension bei 10 ⁸ Zellen / ml) berechnet. Dies kann skaliert werden odernach Bedarf auf nach unten durch das Volumen der Zellsuspension Ändern (immer bei einer Dichte von 1 × 10 ⁸ Zellen / ml) und andere Reagenzien proportional in dem Anfangsschritt (3.1.1 und 3.2.1). Stellen Sie Reagenzvolumina in allen späteren Schritten entsprechend. Wenn beginnend mit 100 & mgr; l von Milz- Zellsuspension zum Beispiel bei 1 x 10 ⁸ / ml, verwenden Sie die Hälfte der angegebenen Reagenzienvolumina in allen Schritten.

1. Isolierung von Plasmazytoide DCs (PDC)
   1. In 300 ul Biotin-markierte Antikörper-Cocktail in der plasmazytoiden DC-Extraktions-Kit zu 200 ul splenic Zellsuspension zur Verfügung gestellt.
   2. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen Sie das Röhrchen alle 3 min zu halten Zellen suspendiert und zu maximieren Antikörperbindung.
   3. Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen.
   4. Resuspendieren der Zellein 500 ul Zellsortierpuffer pelletieren. In 300 ul Anti-Biotin-Antikörper-konjugierten Perlen. Wiederholen Sie Schritt 3.1.2 und 3.1.3.
   5. Überstand verwerfen und Zellpellet in 2 ml Zellsortierungspuffer. Führen Sie alle Schritte von diesem Zeitpunkt an bei RT mit vorgekühlten Puffer.
   6. Legen Sie eine frische magnetische activated cell sorting LS Spalte im magnetischen stehen. Waschen und equilibrieren Säule mit 5 ml Zellsortierpuffer.
   7. Pipette die Zellsuspension auf die Säule, Aufbringen sie sanft in die Mitte der Oberfläche des Säulenbettes. Sammeln Sie die Strömung durch.
   8. Die Säule wird mit 10 ml Zellsortierungspuffer. Sammeln Sie diese Strömung durch und verbinden sich mit dem Strom durch von Schritt 3.1.7. Die pDCs werden in dieser Spalte Fluss durch (FT1) angereichert.
   9. Pelletierung der Zellen von FT1 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C, Resuspendieren in 2 ml Zellsortierungspuffer und die Zellen durch eine frische LS Säule passierendurch die Schritte 3.1.6 Wiederholung - 3.1.8. Diese Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Spalten ergibt eine verbesserte Reinheit der isolierten Zellen.
   10. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspension mit 2 ml komplettem RPMI. Auf Eis, bis sie benötigt.
2. Isolierung von CD8a ^Pos und CD8a ^Neg DCs
   Hinweis: Der erste Schritt in diesem Verfahren ist Depletion von B, pDC, T und NK-Zellen.
   1. Beginnend mit der ganzen Milz - Zellsuspension (1 ml von 10 ml ⁸ Zellen / in Schritt 2.8), 100 & mgr; l Biotin-konjugiertem Antikörper - Cocktail im Kit ^Pos DC Isolations CD8a vorgesehen.
   2. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen das Röhrchen sanft alle 3 min Bindung von Biotin-markiertem Antikörper an ihre Zielzellen zu maximieren.
   3. Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. absaugen Supernatant ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen.
   4. Zugabe von 150 ul Zellsortierpuffer und 100 ul anti-Biotin versehen Kügelchen in der CD8a ^Pos DC - Extraktions - Kit. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min.
   5. 10 ml Zellpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
   6. Die Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und eine neue LS-Säule übergehen nach dem Verfahren in den Schritten 3.1.6 bis 3.1.8.
   7. Sammeln Sie die unbeschriftete Fluss durch 2 (FT2) und die Spalte Retentat verwerfen. Diese unmarkierten Fraktion wird für CD8a ^Pos und CD8a ^Neg DCs angereichert.
   8. Pelletieren Sie die Zellen in FT2 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
   9. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und mit 200 & mgr; l anti-CD8a konjugierten magnetischen Kügelchen im Kit ^Pos DC Isolation CD8a zur Verfügung gestellt.
   10. Vertreteressen Schritte 3.2.2 bis 3.2.6. Der Fluß durch die Säule wird für CD8a ^Neg DCs angereichert und CD8a ^Pos DCs abgereichert. Dies wird Fluss durch 3 (FT3) markiert.
   11. Um die CD8a ^Pos DCs in der Säule zurückgehalten, entfernen Sie die Säule aus dem Magneten eluieren, 5 ml Zellsortierpuffer und spülen Sie die Spaltenmatrix mit den Kolben mit dem LS - Säule zur Verfügung gestellt.
   12. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Absaugen Überstand und resuspendieren in 1 ml Zellsortierpuffer. Um die Reinheit zu erhöhen, laufen wieder die eluierten Zellen durch eine frische LS-Säule durch die Schritte 3.1.6 bis 3.1.8: Wiederholung, mit Ausnahme der Strömung durch verwerfen und sammeln beibehalten Zellen wie in 3.2.11.
   13. Um die CD8a ^Neg DCs aus der FT3 Suspension reinigen, pelletieren Sie die FT3 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren in 300 & mgr; l Zellsortierungspuffer.
   14. 100 l anti-CD11c magmagnetischen Perlen. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min.
   15. 10 ml Zellsortierungspuffer und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
   16. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5 bis 3.1.8. Die CD8a ^Neg DCs sind positiv mit CD11c beads ausgewählt und an die Säule gebunden. Die Strömung kann durch verworfen werden.
   17. Eluieren in der Säule zurückgehalten Zellen als 3.2.11 in Schritt beschrieben , die das gereinigte CD8a ^Neg DCs zu sammeln.

4. Pulsing APCs mit Antigenen und Zelltransfer

1. Zählen Sie die lebenden Zellen nach der Reinigung Trypanblauausschluß ²¹ zu unterscheiden lebenden und toten Zellen.
2. Inkubieren der Zellen mit dem Antigen der Wahl. Verwenden Sie Analoga von Glycolipid - Antigen genannt alpha-Galactosyl - Ceramid (αGalCer) bei 100 nM Konzentration ^13. Typischerweise Platte 10 ⁶ lebensfähigen Zellen / Vertiefung in komplettem RPMI - Medium unter Verwendung von Ultra-Low - attachment U-Boden-96-Well-Platten Zellanhaftung zu minimieren. Inkubieren der Zellen in einem 5% CO ₂ -Atmosphäre bei 37 ° C für 1 - 4 Stunden.
3. Ernten Sie die Zellen durch mehrere Male sanft Pipettieren. Verwenden Sie weite Bohrung Pipettenspitzen Zellschäden durch Scherkräfte zu minimieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und bündeln diese Wäschen Zellernte zu maximieren.
4. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und Resuspendierung in gewünschte Dichte in PBS. Typischerweise injizieren 1 Million Zellen in 200 ul pro Empfängertier. Halten Sie die Zellen auf Eis zu maximieren Lebensfähigkeit vor der Verabreichung in Wirtstiere.
5. Injizieren Zellen intravenös in Mäuse entweder durch den seitlichen Schwanz vergeblich oder dem retroorbitalen Venenplexus ^19. Verwenden Sie eine 27 G-Nadel auf einer 1-ml-Spritze und injizieren ein maximales Volumen von 0,1 ml pro Maus.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse dieses Verfahrens beruht auf der Expansion des DC Untergruppen durch murine Flt-3L durch die implantierten Melanomzellen exprimiert wird. Der B16.Flt3L Tumor wurde aus einer C57BL / 6-Maus abgeleitet und sollte mit diesem Stamm Hintergrund, um in Tiere implantiert werden Versagen des Tumors zu vermeiden wegen Ablehnung zu etablieren. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, genetisch veränderte Mäuse verwenden DCs mit bekannten Defekten in Signalwege oder Rezeptor...

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Diskussion

Dendritische Zellen werden akzeptiert die wichtigsten professionellen Antigen zu sein Zellen beteiligt in der Priming von T-Zell-Antworten zu präsentieren. Ihre Hauptfunktion ist es, die Gewebe-Mikroumgebung Umfrage durch die Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen für die Präsentation an T-Zellen. Um die Funktion von spezifischen DC Untergruppen zu untersuchen, müssen diese in ausreichender Zahl isoliert werden, um einen Ansatz, der ihren normalen Phänotyp und Funktionen beibehält. Die meisten Protokolle basieren...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.