Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l'isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Riepilogo

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule professionali presentanti l'antigene principalmente responsabili per l'acquisizione, l'elaborazione e la presentazione di antigeni sulla presentanti l'antigene molecole di avviare l'immunità T-cellulo-mediata. Le cellule dendritiche possono essere separati in diversi sottoinsiemi fenotipico e funzionalmente eterogenee. Tre sottogruppi importanti delle cellule dendritiche della milza sono plasmacitoidi, cellule CD8α ^Pos e CD8α ^Neg. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono produttori naturali di interferone di tipo I e sono importanti per l'anti-virale immunità cellulo T. Il sottoinsieme CD8α ^Neg DC è specializzata per MHC di classe II presentazione dell'antigene ed è coinvolto nel centro di adescamento cellule T CD4. Il CD8α ^Pos DC sono i principali responsabili per la cross-presentazione di antigeni esogeni e priming delle cellule T CD8. I CD8α ^Pos DC hanno dimostrato di essere più efficace in occasione della presentazione degli antigeni glicolipidici da molecole CD1d ad un cel T specializzataL popolazione noto come T (iNKT), le cellule natural killer invarianti. La somministrazione di Flt-3 ligando aumenta la frequenza della migrazione dei progenitori delle cellule dendritiche dal midollo osseo, in ultima analisi, con conseguente espansione delle cellule dendritiche in organi linfoidi periferici in modelli murini. Abbiamo adattato questo modello per purificare un gran numero di cellule dendritiche funzionali per l'utilizzo in esperimenti di trasferimento di cellule per confrontare competenza in vivo di diversi sottoinsiemi DC.

Introduzione

Le cellule dendritiche (DC) sono stati scoperti quasi quarant'anni fa come il "grande stellate (dendron greco) cella" trovata negli organi linfoidi ^1. Molti studi hanno dimostrato che le cellule dendritiche sono le uniche cellule che presentano l'antigene in grado di stimolare efficacemente le cellule T naive ^2. Una delle principali funzioni di queste cellule è l'assorbimento e la presentazione di antigeni e la loro elaborazione efficiente e carico di questi su molecole presentanti l'antigene. In milza del mouse, DC può essere separato in plasmacitoidi e sottoinsiemi convenzionali. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono caratterizzati da una bassa espressione di CD11c e alti livelli di B220 e Gr-1. Essi sono anche positivo per il marcatore mPDCA1 superficie ed interferone di tipo I in risposta a pedaggio like receptor 9 (TLR9) ligandi secernono. I DC convenzionali sono alti per CD11c e MHC di classe II espressione. Essi possono essere suddivisi in tre sottogruppi distinti in base alla superficie espressione di marcatori fenotipici quali CD4, CD8α, DEC205, CD11b e delle cellule dendritiche del recettore inibitorio 2 (DCIR2, riconosciuto dal anticorpo 33D1) proteine ^​​3,4. I CD8α ^Pos DC sono noti anche come CDC1, sono positivi per DEC205, ma negativo per i marcatori mieloidi, come CD11b e 33D1. Il CD8α ^Neg DC, chiamato anche CDC2, sono positivi per 33D1, CD11b e CD4, ma mancano DEC205. Il sottoinsieme negativo doppio (vale a dire, negativo sia per CD4 e CD8α) è relativamente rara, ed è negativo per DEC205 e 33D1. È il sottoinsieme almeno caratterizzati e può essere una forma meno differenziata di CD8α ^Neg DC.

Differenze fenotipiche nei diversi sottoinsiemi DC estendono anche alle loro funzioni in vivo. Il CD8α ^Neg DC sono altamente fagocitosi e si pensa di presentare l'antigene esogeno principalmente attraverso MHC di classe II a cellule T CD4 ^3. Al contrario, i CD8α ^Pos DC sono specializzati per la presentazione dell'antigene proteina solubile in MHC di classe Iin un meccanismo chiamato cross-presentazione. Il risultato di cross-presentazione dipende dallo stato di attivazione di queste cellule dendritiche ^5, e può sia portare alla espansione delle cellule T citotossiche (CTL) o lo sviluppo di cellule T regolatorie ^{6 2,7.} Targeting di antigene di CD8α ^Pos DC utilizzando i risultati di consegna anti-DEC205-mediata da anticorpi in gran parte nella eliminazione delle cellule T ^8, mentre la presentazione di antigeni derivati ​​da cellule apoptotiche infettate induce una forte risposta CTL ^9.

Oltre al riconoscimento di antigeni peptidici, il sistema immunitario dei mammiferi è evoluto per riconoscere lipidico e antigeni glicolipidi. Questi antigeni sono presentati da molecole CD1, che sono MHC di classe proteine ​​di superficie cellulare i-like che esistono in molteplici forme legate in vari mammiferi. Nei topi, un unico tipo di molecola altamente conservata CD1 chiamato CD1d è responsabile per la presentazione di antigeni glicolipidi ^10. Il sindaco popolazione di cellule T che riconoscono CD1d / complessi glicolipidici è chiamato cellule NKT invarianti (cellule iNKT). Queste cellule esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T (TCR) composto da una catena TCRα invariante che è associato con catene TCRβ che hanno limitato la diversità ^11. A differenza delle cellule T convenzionali che hanno bisogno di proliferare e differenziarsi per diventare cellule T effettrici attivate, le cellule iNKT esistono come una popolazione effettrici e iniziano a reagire rapidamente dopo la somministrazione glycolipid ^12. L'identificazione di cellule che presentano l'antigene fisiologicamente rilevanti dei lipidi è un'area attiva di ricerca, e di diversi tipi di cellule distinte, come B cellule, i macrofagi e le cellule dendritiche sono state proposte per svolgere questa funzione. Tuttavia, è stato dimostrato che il sottoinsieme CD8α ^Pos delle DC è la cellula primaria mediazione captazione e presentazione di antigeni lipidici alle cellule del mouse iNKT ¹³ e glycolipid mediata cross-priming di cellule T CD8 ^14.

ove_content "> Per confrontare l'efficienza di presentazione dell'antigene da diverse cellule presentanti l'antigene, un approccio semplice è quello di trasferire diversi tipi di APC purificate pulsate con quantità equivalenti di antigene in host naive. esperimenti di trasferimento cellulare di questo tipo sono spesso eseguite per studi immunologici. Tuttavia, l'esecuzione di studi trasferimento con ex vivo antigene trattata DC è impegnativo, poiché queste cellule esistono popolazioni come rare in organi linfoidi in cui costituiscono meno del 2% delle cellule totali ^15. è pertanto necessario migliorare lo sviluppo di queste cellule in animali donatori per aumentare l'efficienza di protocolli di isolamento.

E 'noto che il linfoide comune e progenitori mieloidi comuni, che sono necessari per la generazione di PDC CD8 ^Pos e sottoinsiemi CD8 ^Neg DC, fms legati espresso recettore tirosin-chinasi 3 (Flt-3). Al momento in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) amministrazione, emigratione di Flt-3 che esprimono cellule progenitrici del midollo osseo è aumentato, con conseguente aumento della semina organi linfoidi periferici e l'espansione della loro progenie matura DC ^16. L'espressione di Flt-3 è perso durante impegno per la B, i percorsi di differenziazione delle cellule T o NK. Pertanto, solo alterazioni minime sono osservati in queste cellule con la somministrazione Flt-3L. Espansione simile nelle popolazioni DC è osservata in topi portatori di tumori generati da impianto di una linea di cellule di melanoma B16-secernenti murino Flt-3L, che fornisce un metodo semplice ed economico per fornire livelli sistemici sostenuti di Flt-3L ^17,18. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato un protocollo basato su l'impianto di cellule B16-melanoma secernenti Flt-3L per stimolare l'espansione di tutte le normali sottoinsiemi DC nella milza del mouse, quindi aumentando notevolmente le rese di queste cellule che possono essere isolate per esperimenti successivi . Abbiamo costantemente troviamo che entro 10 - 14 giorni dopo im sottocutaneopiantagione del tumore secernente Flt-3, i topi sviluppano splenomegalia con marcata arricchimento delle DC per costituire 40 - 60% delle cellule totali milza. Da queste milza, diversi sottoinsiemi DC possono essere isolati con elevata purezza utilizzando standard di kit di purificazione delle cellule disponibili in commercio che utilizzano marcatori fenotipici specifici sottoinsieme.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono fatte secondo le linee guida approvate dal comitato istituzionale cura e l'uso di animali (IACUC). Tutte le procedure che richiedono la sterilità sono eseguite in un armadio biosicurezza.

1. Impianto di B16.Flt3L melanoma nei topi

1. Culture l'espressione B16 linea cellulare di melanoma Flt-3 in T25 fiasche di coltura tissutale con una densità di 0,5 x 10 ⁶ cellule / ml in terreno DMEM completo con il 10% di CO ₂ a 37 ° C. Crescere fino a quando le cellule raggiungono ~ 90% di confluenza (~ 20 ore).
2. Raccogliere le cellule dalla tripsina digestione. terreni di coltura delle cellule Aspirare e lavare le cellule aderenti con PBS. Aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina e incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere freddo 20 ml completo DMEM (4 ° C) contenente siero fetale di vitello (FCS) per spegnere la digestione proteasi. Sollevare le cellule off battendo leggermente seguita pipettando gentilmente su e giù.
3. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300xg per 10 min a 4 ° C. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore vitalità cellulare automatizzata. Risospendere ad una densità di 10 ⁸ cellule / ml in PBS.
4. Topi Implant (C57BL / 6 o altro ceppo istocompatibili) con cellule tumorali per via sottocutanea come descritto da Machholz et al. ¹⁹ alla base del collo con 100 ml di sospensione cellulare (10 ⁷ cellule).
5. Lasciare che il tumore di crescere fino palpabili o visibili (2 - 10 mm di diametro, solitamente 7 - 12 giorni) prima di sacrificare animali per l'espianto di organi.

2. Preparazione di splenica cellulare Sospensione Singola da tumore Bearing Mice

1. Anestetizzare i topi con una dose eccessiva di isoflurano (regolare flusso di isoflurano a> 5% e continuare l'esposizione di almeno 2 minuti dopo smette di respirare). Sacrificare il melanoma tumore del mouse Flt-3 cuscinetti da dislocazione cervicale secondo le linee guida istituzionali per l'eutanasia.
2. disinfect la pelle con il 70% di etanolo e la raccolta della milza con tecnica asettica con l'ausilio di forbici sterili ^20.
3. Posizionare la milza in una piastra di Petri sterile per il trasporto al cabinet biosicurezza. Eseguire tutti i passi da qui in condizioni sterili.
4. Trasferimento milza per un piatto fresco di Petri e lavare con RPMI. Tagliare la milza in piccoli pezzi (~ 0,2 centimetri ²⁾ utilizzando un bisturi. Incubare per 30 minuti a 37 ° C con 10 ml di soluzione di collagenasi / DNasi.
5. Versare la sospensione parzialmente digerito del tessuto della milza su un colino cella di 70 micron. Comprimere i frammenti di tessuto rimanenti attraverso le maglie del filtro utilizzando una siringa da 5 ml stantuffo.
6. Lavare il filtro a rete con 10 ml di mezzo fresco e gettare il filtro. Centrifugare la sospensione a 300 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare le cellule.
7. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di lisi RBC. Incubare a RT Fo 10 min. Placare il tampone di lisi RBC con l'aggiunta di 10 ml di terreno completo RPMI.
8. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere in volume adeguato per raggiungere densità cellulare di 10 ⁸ cellule / ml nella cella di smistamento tampone (ad esempio, MACS) contenente 20 mg / ml di anticorpi Fc-blocco (2.4G2).

3. Purificazione di plasmacitoidi DC, CD8α ^Pos DC e CD8α ^Neg DC da milza cellulare Sospensione Singola

Nota: Isolamento dei sottoinsiemi DC spleniche di sospensione singola cellula è una procedura multi-step come illustrato in figura 1 eseguire tutte le fasi utilizzando tampone pre-raffreddato e un bagno di acqua ghiacciata per mantenere la temperatura a 4 - 8 ° C.. Tutti i volumi di reagenti nella sezione seguente del protocollo sono calcolati per un ingresso iniziale di 200 ml di sospensione cellulare della milza a 10 ⁸ cellule / ml). Questo può essere scalata verso l'alto ogiù in base alle proprie esigenze modificando il volume di sospensione cellulare (sempre ad una densità di 1 x 10 ⁸ cellule / ml) e altri reagenti proporzionalmente nella fase iniziale (3.1.1 e 3.2.1). Regolare i volumi di reagenti in tutte le fasi successive di conseguenza. Ad esempio, se si parte con 100 ml di sospensione cellulare splenica a 1 x 10 ⁸ / ml, utilizzare metà dei volumi di reagente indicati in tutti i passaggi.

1. L'isolamento di plasmacitoidi DC (PDC)
   1. Aggiungere 300 ml di cocktail di anticorpi biotina marcata con fornito nel plasmacitoidi Kit di isolamento DC a 200 ml di sospensione cellulare della milza.
   2. Mescolare accuratamente e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo ogni 3 minuti per mantenere le cellule in sospensione, e per massimizzare legame dell'anticorpo.
   3. Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante per rimuovere gli anticorpi biotinilati non legati.
   4. Risospendere cellapellet in 500 ml di buffer di ordinamento delle cellule. Aggiungere 300 ml di anti-biotina perline anticorpo-coniugato. Ripetere il passaggio 3.1.2 e 3.1.3.
   5. Gettare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Eseguire tutti i passaggi da questo punto in poi a temperatura ambiente usando tamponi pre-raffreddato.
   6. Posizionare una nuova cella di attivazione magnetico ordinamento colonna LS nel supporto magnetico. Lavare ed equilibrare colonna con 5 ml di tampone di ordinamento delle cellule.
   7. Pipetta la sospensione cellulare in colonna, applicando delicatamente al centro della superficie del letto della colonna. Raccogliere il flusso attraverso.
   8. Lavare la colonna con 10 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Raccogliere questo flusso attraverso e si combinano con il flusso attraverso dal punto 3.1.7. PDC sono arricchiti in questo flusso della colonna attraverso (FT1).
   9. Agglomerare le cellule da FT1 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, risospendere in 2 ml di cellule tampone di smistamento e passare le cellule attraverso una colonna LS frescaripetendo i punti 3.1.6 - 3.1.8. Questo uso di due colonne sequenziali produce una maggiore purezza delle cellule isolate.
   10. Cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 2 ml di RPMI completo. Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. Isolamento di CD8α ^Pos e CD8α ^Neg DC
   Nota: Il primo passo in questa procedura è la deplezione delle cellule B, PDC, T e NK.
   1. A partire con tutta la sospensione di cellule della milza (1 ml di 10 ⁸ cellule / ml ottenuti nella fase 2.8), aggiungere 100 ml di cocktail di anticorpi biotina coniugato fornito nel kit di isolamento CD8α ^Pos DC.
   2. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo delicatamente ogni 3 min per massimizzare il legame degli anticorpi biotina marcata con le loro cellule bersaglio.
   3. Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare eccellentenatant per rimuovere gli anticorpi biotinilati legati.
   4. Aggiungere 150 ml di tampone di smistamento delle cellule e 100 ml di perline anti-biotina forniti nel kit di isolamento CD8α ^Pos DC. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti.
   5. Aggiungere 10 ml di cellule di smistamento tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   6. Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 ml di cellule e passare sopra una colonna LS fresco in base alla procedura dei passi 3.1.6 tramite 3.1.8.
   7. Raccogliere il flusso senza etichetta attraverso 2 (FT2) ed eliminare il retentato colonna. Questa frazione senza etichetta si arricchisce per CD8α ^Pos e CD8α ^Neg DC.
   8. Agglomerare le cellule in FT2 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   9. Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 cella ml e aggiungere 200 ml di-CD8α anti-sfere magnetiche coniugate forniti nel kit di isolamento CD8α ^Pos DC.
   10. rappresentantemangiare passi 3.2.2 tramite 3.2.6. Il flusso attraverso la colonna si arricchisce per CD8α ^Neg DC e impoverito per CD8α ^Pos DC. Questo è etichettato flusso attraverso 3 (FT3).
   11. Per eluire il CD8α ^Pos PVS trattenuto in colonna, rimuovere la colonna dal magnete, aggiungere 5 ml di tampone di smistamento cellulare e spurgare la matrice colonna utilizzando lo stantuffo fornito con la colonna LS.
   12. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere in tampone di smistamento 1 ml di cellule. Per aumentare la purezza, eseguire le cellule eluiti nuovo attraverso una colonna LS fresca ripetendo i punti da 3.1.6 a 3.1.8, ad eccezione di scartare il flusso attraverso e raccogliere le cellule conservate come in 3.2.11.
   13. Per purificare il CD8α ^Neg DC dalla sospensione FT3, pellet la FT3 mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere in 300 microlitri di tampone di ordinamento delle cellule.
   14. Aggiungere 100 ml di anti-CD11c MAGperline tiche. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti.
   15. Aggiungere smistamento cellule tampone e pellet 10 ml di cellule mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   16. Ripetere i passaggi 3.1.5 tramite 3.1.8. Il CD8α ^Neg DC vengono selezionati positivamente con perline CD11c e sono legato alla colonna. Il flusso attraverso può essere scartato.
   17. Eluire le cellule conservate nella colonna come descritto al punto 3.2.11 per raccogliere il purificato CD8α ^Neg DC.

4. Pulsing APC con gli antigeni e trasferimento di cellule

1. Contare le cellule vive dopo la purificazione mediante trypan esclusione blu ^{da 21} a distinguere le cellule vive e morte.
2. Incubare le cellule con l'antigene di scelta. Utilizzare analoghi di antigene glycolipid chiamato alfa-galactosyl ceramide (αGalCer) a 100 concentrazioni nM ^13. In genere, la piastra 10 ⁶ cellule vitali / bene in mezzo completo RPMI con ultra-low Attachment U-bottom piastre da 96 pozzetti per ridurre al minimo l'adesione cellulare. Incubare le cellule in CO ₂ atmosphere 5% a 37 ° C per 1 - 4 hr.
3. Celle di raccolta pipettando delicatamente diverse volte. Utilizzare ampi suggerimenti foro pipette per ridurre al minimo i danni cellulari da forze di taglio. Lavare i pozzetti con PBS e in comune questi lavaggi per massimizzare la raccolta delle cellule.
4. Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere alla densità desiderata in PBS. In genere, iniettare 1 milione di cellule in 200 microlitri per destinatario degli animali. Mantenere le cellule in ghiaccio per massimizzare la redditività prima della somministrazione in animali ospiti.
5. Iniettare cellule per via endovenosa in topi sia attraverso il vano coda laterale o il plesso venoso retro-orbitale ^19. Utilizzare un ago G 27 su una siringa da 1 ml e iniettare un volume massimo di 0,1 ml per topo.

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Risultati

L'esito di questa procedura si basa sull'espansione di sottoinsiemi DC da murino Flt-3L espressa dalle cellule di melanoma impiantati. Il tumore B16.Flt3L è stato derivato da un C57BL / 6 del mouse, e dovrebbe essere impiantato in animali con quello sfondo sforzo al fine di evitare il fallimento del tumore per stabilirsi a causa di rifiuto. In alcuni casi, può essere desiderabile utilizzare topi geneticamente modificati per derivare DC con difetti noti vie di segnalazione o rec...

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Discussione

Le cellule dendritiche sono accettati per essere il principale antigene professionale, presentando le cellule coinvolte nella adescamento di risposte delle cellule T. La loro funzione principale è quella di rilevare il microambiente del tessuto riprendendo e l'elaborazione di antigeni per la presentazione di cellule T. Al fine di studiare la funzione di specifiche sottopopolazioni DC, questi devono essere isolati in numero sufficiente usando un approccio che mantiene loro normale fenotipo e funzioni. La maggior par...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.