Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Резюме

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Аннотация

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-представляющих клеток, прежде всего, ответственные за сбора, обработки и представления антигенов на антиген-представляющих молекул для инициирования Т-клеточного иммунитета. Дендритные клетки могут быть разделены на несколько фенотипически и функционально разнородных подмножеств. Три важных подмножества селезеночных дендритных клеток плазмоцитов, CD8α ^Pos и CD8α ^Neg клетки. В плазмоцитов бездисковые натуральные производители типа интерферона и имеют важное значение для противовирусного Т-клеточного иммунитета. Подмножество CD8α ^отр DC специализирован для MHC класса II презентации антигена и центрально участвует в грунтования CD4 Т - клеток. CD8α ^Pos контроллеры домена в первую очередь ответственны за кросс-презентации экзогенных антигенов и клеток грунтования CD8 Т. В CD8α ^Pos РС были продемонстрированы наиболее эффективным на презентации антигенов гликолипидов молекулами CD1d специализированному Т CELл население известный как инвариант естественных киллеров Т (iNKT) клеток. Введение Flt-3 лиганд увеличивает частоту миграции дендритных клеток-предшественников клеток из костного мозга, в конечном счете, приводит к расширению дендритных клеток в периферических лимфоидных органах в мышиных моделях. Мы адаптировали эту модель , чтобы очистить большое количество функциональных дендритных клеток для использования в экспериментах по передаче клеток для сравнения знания в естественных условиях различных подмножеств DC.

Введение

Дендритные клетки (ДК) были обнаружены почти сорок лет назад как "большой звездчатые (греческий дендрон) клетка" находится в лимфоидных органах ^1. Многие исследования показали , что контроллеры домена являются единственными антиген - представляющих клеток , которые могут эффективно стимулировать наивные Т - клетки ^2. Основная функция этих клеток является поглощение и презентацию антигенов и их эффективную обработку и загрузку их на антиген-представляющих молекул. В селезенке мыши, контроллеры домена могут быть разделены на плазмоцитов и обычных подмножеств. В плазмоцитов ДК характеризуются низкой экспрессии CD11c и высоких уровней B220 и Gr-1. Они также являются позитивными для поверхностного маркера mPDCA1 и секретируют типа интерферона в ответ на Толл-подобные рецепторы 9 (TLR9) лигандов. Обычные контроллеры домена являются высокими для CD11c и экспрессии МНС класса II. Они могут быть разделены на три отдельные подмножества на основе поверхностной экспрессии фенотипических маркеров, таких как CD4, CD8α, DEC205, компакт-диск11b и дендритных клеток ингибирующий рецептор 2 (DCIR2, распознается антителом 33D1) белки ^3,4. В CD8α ^Pos контроллеры домена также известны как cDC1, являются позитивными для DEC205, но отрицательный результат для миелоидных маркеров , таких как CD11b и 33D1. CD8α ^отр контроллеры домена, называемый также Cdc2, являются положительными для 33D1, CD11b и CD4 , но не имеют DEC205. Двойное отрицание подмножество (т.е. отрицательный как для CD4 и CD8α) относительно редко, и является негативной для DEC205 и 33D1. Это наименее отличающееся подмножество и может быть менее дифференцированными форма CD8α ^Neg DC.

Фенотипические различия в различных подмножеств DC также распространяются на их функции в естественных условиях. CD8α ^отр контроллеры домена обладают высокой фагоцитарной и , как полагают , чтобы представить экзогенный антиген в основном через МНС класса II к CD4 Т - клеток ^3. В противоположность этому , CD8α ^Pos контроллеры домена специализированы для представления растворимого белкового антигена на MHC класса Iв механизме называется кросс-презентации. Результаты перекрестной презентации зависит от состояния активации этих контроллеров домена ^5, и может привести либо к расширению цитотоксических Т - клеток (CTL) или развитие регуляторных Т - клеток , ^{6 2,7.} Нацеливание антигена CD8α ^Pos ГЦ с использованием анти-DEC205-антителоопосредуемый результатами доставки в основном к удалению Т - клеток , ^8, в то время как презентация антигенов , полученных из инфицированных апоптотических клеток индуцирует сильный CTL - ответ ^9.

В дополнение к признанию пептидных антигенов, иммунной системы млекопитающих эволюционировала распознавать липидный и гликолипидов антигены. Эти антигены представлены молекулами CD1, которые являются MHC класса I, как белки клеточной поверхности, которые существуют в нескольких связанных форм в различных млекопитающих. У мышей, один тип высококонсервативной молекулы CD1 называется CD1d отвечает за представление гликолипида антигенов ^10. Основным популяция Т-клеток, которые распознают CD1d / гликолипидов комплексы называют инвариантными клетки НКТ (iNKT клетки). Эти клетки экспрессируют полуинвариантом Т - клеточного рецептора (TCR) , состоящий из инвариантной TCRα цепи, которая в паре с TCR & beta ; цепи , которые имеют ограниченное разнообразие ^11. В отличие от обычных Т - клеток , которые должны размножаться и дифференцироваться , чтобы стать активированные эффекторные Т - клетки, клетки iNKT существуют как эффекторной популяции и начинают быстро отвечать на запросы после введения гликолипидов ^12. Идентификация физиологически соответствующих липидный антигенпрезентирующих клеток является активной областью исследований, а также несколько различных типов клеток, таких как В-клетки, макрофаги и ДК было предложено выполнить эту функцию. Тем не менее, было показано , что CD8α ^Pos подмножество ГЦ является первичной ячейкой опосредовать поглощение и представление липидных антигенов мыши iNKT клетки ¹³ и гликолипидов опосредованного перекрестного примирования CD8 Т - клеток ^14.

ove_content "> Для сравнения эффективности презентации антигена с помощью различных антиген-представляющих клеток, простой подход состоит в передаче различных типов очищенных АРС импульсными с эквивалентными количествами антигена в наивных хозяев. Эксперименты клеточного переноса этого типа часто выполняются для иммунологических исследований. Тем не менее, проведение исследований переноса с экс виво антиген обработанного ГЦ является сложной задачей, так как эти клетки существуют как редкие популяции в лимфоидных органах , где они составляют менее 2% от общего количества клеток ^15. поэтому необходимо усилить развитие этих клеток в животных - доноров для повышения эффективности протоколов изоляции.

Известно , что общий лимфоидной и миелоидной общие клетки - предшественники, которые необходимы для генерации Pdc, CD8 и ^Pos подмножеств CD8 ^отр DC, экспресс - FMS связанных с рецепторной тирозинкиназы 3 (Flt-3). При в естественных условиях Flt-3 лиганд (Flt-3L) введение, emigratион Flt-3 , экспрессирующих клеток - предшественников костного мозга увеличивается, что приводит к увеличению обсеменения периферических лимфоидных органах и расширение их зрелого потомстве DC ^16. Выражение FLT-3 теряется во время приверженности B, T или NK путей дифференцировки клеток. Таким образом, лишь минимальные изменения наблюдаются в этих клетках при введении Flt-3L. Подобное расширение в популяциях постоянного тока наблюдается у мышей , несущих опухоли путем имплантации клеточной линии В16-меланома , секретирующих мышиный FLT-3L, который обеспечивает простой и экономичный способ обеспечения устойчивые системные уровни FLT-3L ^17,18. Используя этот подход, мы разработали протокол, основанный на имплантации B16-клеток меланомы, секретирующих Flt-3L, чтобы стимулировать расширение всех нормальных подмножеств DC в селезенке мышей, тем самым значительно увеличивая урожаи этих клеток, которые могут быть выделены для последующих экспериментов , Мы последовательно находим, что в течение 10 - 14 дней после подкожного внутримышечноплантация опухоли, секретирующие Flt-3, мыши развивают спленомегалия с выраженным обогащением контроллеров домена составлять 40 - 60% от общего количества клеток селезенки. Из этих селезенке, различные подмножества DC могут быть выделены с высокой степенью чистоты с использованием стандартных коммерчески доступных наборов очистки клеток, которые используют подмножество специфических фенотипических маркеров.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных проводятся в соответствии с утвержденными руководящими принципами от институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Все процедуры, требующие стерильности выполняются в кабинете биологической безопасности.

1. Имплантация B16.Flt3L Меланома у мышей

1. Культура Flt-3 экспрессирующих меланомы В16 линию клеток в колбы Т25 для культуры ткани при плотности 0,5 × 10 ⁶ клеток / мл в полной среде DMEM с добавлением 10% СО ₂ при 37 ° С. Расти, пока клетки не достигают ~ 90% слияния (~ 20 ч).
2. Сбора клеток путем усвоением трипсина. Аспирируйте среды для культивирования клеток и мыть прилипшие клетки с PBS. Добавьте 5 мл 0,05% трипсина и инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С. Добавить холодную 20 мл полной среды DMEM (4 ° С), содержащую фетальной телячьей сыворотки (FCS), чтобы погасить перевариванию протеазы. Поднимите клетки от легким постукиванием с последующим осторожно пипеткой вверх и вниз.
3. Собирают клетки центрифугированием при 300XG в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматического счетчика жизнеспособности клеток. Ресуспендируют до плотности 10 ⁸ клеток / мл в PBS.
4. Имплантаты мышей (C57BL / 6 или другой гистосовместимого штамм) с опухолевыми клетками путем подкожной инъекции , как описано Machholz и др. , ¹⁹ у основания шеи с помощью 100 мкл суспензии клеток (10 ⁷ клеток).
5. Разрешить опухоль расти до осязаемых или видимых (2 - 10 мм в диаметре, обычно 7 - 12 дней) перед жертвоприношением животных для извлечения органов.

2. Получение селезеночной одноклеточной суспензии от опухоли мышей, несущих

1. Обезболить мышей с передозировкой изофлуран (отрегулировать скорость потока изофлуран к> 5% и по-прежнему экспозиции по крайней мере, через 2 мин после остановки дыхания). Жертвуют Flt-3 опухоли меланома мыши подшипника шейки дислокации в соответствии с ведомственным руководящим принципам для эвтаназии.
2. диsinfect кожу с 70% этанола и урожая селезенки с использованием асептической техники с помощью стерильных ножниц ^20.
3. Поместите селезенку в стерильную чашку Петри для транспортировки в шкафу биологической безопасности. Выполните все шаги от здесь в стерильных условиях.
4. Передача селезенку в свежую чашку Петри и промывают RPMI средой. Вырезать селезенку на мелкие (~ 0,2 см ²⁾ части , используя скальпель. Инкубировать в течение 30 мин при температуре 37 ° С с 10 мл коллагеназы / ДНКазы раствора.
5. Налейте частично переваренной суспензии ткани селезенки на клеточный фильтр 70 мкм. Сжать оставшиеся фрагменты ткани через сетку сетчатого фильтра с помощью шприца 5 мл.
6. Промыть сетчатый фильтр с 10 мл свежей среды и выбросить фильтр. Центрифуга суспензии при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
7. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов. Инкубировать при RT Fили 10 мин. Гасят буфер для лизиса эритроцитов путем добавления 10 мл полной среды RPMI.
8. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют в соответствующем объеме для достижения плотности клеток 10 ⁸ клеток / мл в буфере сортировки клеток (например, MACS) , содержащей 20 мкг / мл Fc-блока антитела (2.4G2).

3. Очистка плазмоцитов, контроллеры домена CD8α ^Pos ГЦ и CD8α ^Neg контроллеры домена от селезеночной одноклеточной суспензии

Примечание: Выделение селезеночной подмножеств DC от одной клеточной суспензии является процедура многоступенчатая , как показано на рисунке 1 Выполните все шаги с использованием предварительно охлажденного буфера и водяной бане лед для поддержания температуры на 4 - 8 ° C.. Все объемы реагента в следующем разделе протокола рассчитаны на первоначальный ввод 200 мкл суспензии клеток селезенки в 10 ⁸ клеток / мл). Это может быть увеличен илипонижаться в зависимости от Вашей потребности путем изменения объема клеточной суспензии (всегда при плотности 1 х 10 ⁸ клеток / мл) и другие реагенты пропорционально на начальном этапе (3.1.1 и 3.2.1). Отрегулируйте объемы реагентов во всех последующих этапах соответственно. Например, если , начиная с 100 мкл суспензии клеток селезенки при напряжении 1 х 10 ⁸ / мл, используют половину объемов реагентов , указанных на всех этапах.

1. Выделение плазмоцитов контроллеров домена (PDC)
   1. Добавьте 300 мкл меченных биотином коктейль антител можно найти в комплекте изоляции плазмоцитов DC к 200 мкл суспензии клеток селезенки.
   2. Тщательно перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин. Нажмите пробирку каждые 3 мин, чтобы держать клетки приостановленных и максимизировать связывание антитела.
   3. Добавить 12 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Отберите супернатант для удаления несвязанных биотинилированных антител.
   4. Ресуспендируют клеткиосадок в 500 мкл буфера для сортировки клеток. Добавьте 300 мкл анти-биотин антитела конъюгированные с бусинами. Повторите шаг 3.1.2 и 3.1.3.
   5. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера сортировки клеток. Выполните все шаги, начиная с этого момента при комнатной температуре с использованием предварительно охлажденный буферов.
   6. Поместите свежий магнитный активированный сортировки клеток колонку LS в магнитном стенде. Промыть и уравновешивают колонку с 5 мл буфера сортировки клеток.
   7. Пипетировать клеточной суспензии на колонку, применяя его осторожно к центру поверхности слоя колонны. Собирают поток через.
   8. Промыть колонку с 10 мл буфера сортировки клеток. Собирают этот поток через и объединить с потоком через с этапа 3.1.7. В PDCs обогащены в этом потоке через колонку (FT1).
   9. Гранул клетки из FT1 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С, в Ресуспендируют 2 буфере сортировочного мл клеток и проходят клетки через свежий колонки LSповторяя шаги 3.1.6 - 3.1.8. Это использование двух последовательных колонках дает повышенную чистоту изолированных клеток.
   10. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют с 2 мл полной RPMI. Место на льду, пока не понадобится.
2. Выделение CD8α ^Pos и CD8α ^Neg ГЦ
   Примечание: Первым шагом в этой процедуре является истощение B, Pdc, Т и NK-клеток.
   1. Начиная со всей суспензии клеток селезенки (1 мл 10 ⁸ клеток / мл , полученной на стадии 2.8), добавляют 100 мкл биотин-конъюгированные смесь антител можно найти в комплекте изоляции CD8α ^Поз DC.
   2. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин. Нажмите трубу на мягко через каждые 3 мин, чтобы максимизировать связывание меченного биотином антитела к их клетки-мишени.
   3. Добавить 12 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Отберите суперплавучий для удаления несвязанных биотинилированных антител.
   4. Добавьте 150 мкл буфера сортировки клеток и 100 мкл анти-биотин шариков , предусмотренных в комплекте изоляции CD8α ^Pos DC. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин.
   5. Добавляют 10 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
   6. Ресуспендируют клеток в буфере сортировки 1 мл клеток и перейти на свежую колонку LS в соответствии с процедурой, описанной в шагах 3.1.6 через 3.1.8.
   7. Соберите немеченого поток через 2 (FT2) и удалите столбец ретентата. Эта непомеченная фракция обогащена для CD8α ^Pos и CD8α ^Neg контроллеры домена.
   8. Гранул клетки в FT2 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
   9. Ресуспендируют клеток в буфере сортировки 1 мл клеток и добавляют 200 мкл анти-CD8α конъюгированных магнитных шариков можно найти в комплекте изоляции CD8α ^Pos DC.
   10. репседят шаги 3.2.2 через 3.2.6. Поток через колонку обогащена CD8α ^Neg контроллеров домена и обедненного для CD8α ^Pos контроллеров домена. Это помечена поток через 3 (FT3).
   11. Для элюирования CD8α ^Поз контроллеры домена сохраняется в колонке, удалить столбец из магнита, добавляют 5 мл буфера сортировки клеток и очистить матрицу столбцов , используя поршень , снабженный колонки LS.
   12. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Отберите супернатант и ресуспендируют в буфере сортировки 1 мл клеток. Для повышения чистоты, запустить элюированный клетки снова через свежий колонки LS, повторяя шаги 3.1.6 на 3.1.8, за исключением того, отбросить поток через и собирают нераспределенной клетки как в 3.2.11.
   13. Для очистки CD8α ^Neg контроллеры домена из FT3 подвески, осаждени FT3 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 300 мкл буфера для сортировки клеток.
   14. Добавьте 100 мкл анти-CD11c МАГмагнитные шарики. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин.
   15. Добавить 10 мл буфера сортировки клеток и гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
   16. Повторите шаги 3.1.5 через 3.1.8. CD8α ^отр ДК положительно выбраны с CD11c бус и привязаны к колонке. Поток через может быть отброшен.
   17. Элюируйте клетки , сохраняемых в колонке , как описано в шаге 3.2.11 для сбора очищенного CD8α ^Neg ДКБ.

4. Пульсирующий БТРы с антигенами и Cell Transfer

1. Подсчитывают живые клетки после очистки с использованием трипанового синего ²¹ , чтобы отличить живых и мертвых клеток.
2. Инкубируйте клетки с антигеном выбора. Используйте аналоги гликолипида антигена называется альфа-галактозил керамиды (αGalCer) при концентрации 100 нМ ^13. Как правило, пластина 10 ⁶ жизнеспособных клеток / лунку в полной среде RPMI с использованием ультра-низким АТТАКhment U-дном 96-луночные планшеты для минимизации прикрепление клеток. Инкубацию клеток в атмосфере 5% СО ₂ при 37 ° С в течение 1 - 4 ч.
3. Урожай клетки осторожно пипеткой несколько раз. Используйте широкие подсказки отверстие пипетки, чтобы минимизировать повреждения клеток от поперечных сил. Вымойте скважин с PBS и объединить эти промывок, чтобы максимизировать урожай клеток.
4. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют до желаемой плотности в PBS. Как правило, вводят 1 миллион клеток в 200 мкл на животного-реципиента. Держите клетки на льду, чтобы максимизировать жизнеспособность перед введением в животных-хозяев.
5. Вводят клетки внутривенно мышам либо через латеральную хвостовую напрасными или ретро-орбитального венозного сплетения ^19. С помощью 27 г иглы на шприц емкостью 1 мл, и вводят максимальный объем 0,1 мл на мышь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результатом этой процедуры зависит от расширения подмножеств DC мышиным Flt-3L, выраженной имплантированных клеток меланомы. Опухоль B16.Flt3L была получена из C57BL / 6 мышей, и должны быть имплантированы животным с этим штаммом фон для того, чтобы избежать выхода из строя опух?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Дендритные клетки принимаются быть основным профессиональным антигенпрезентирующая клеток, участвующих в грунтования Т-клеточных ответов. Их основная функция состоит в обследовании микросреду тканей путем принятия и обработки антигенов для презентации Т-клеткам. Для изучения функ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.