Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Özet

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Özet

Dendritik hücreler (DC), elde etme işlemi ve T-hücresi-aracılı bağışıklık başlatma molekülleri antijen antijenler sunmak için başta sorumlu profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Dendritik hücreler çeşitli fenotipik ve fonksiyonel heterojen alt kümeleri ayrılabilir. Dalak dendritik hücrelerin üç önemli alt grupları, CD8α ^Pos ve CD8α ^Neg hücreleri plasmasitoid vardır. plazmasitoid DCler tip I interferon doğal üreticileri ve anti-viral T hücre bağışıklık için önemlidir. CD8α ^Neg DC alt MHC sınıf II antijen sunumu için özel olan ve merkezi bir CD4 T hücrelerini priming yer almaktadır. CD8α ^Pos DH'ler eksojen antijenler ve CD8 T hücresi priming çapraz sunumu için öncelikle sorumludur. CD8α ^Pos DC'ler özel bir T cel için CD1d moleküller glycolipid antijenlerin sunumu en verimli olduğu ortaya konmuşturdeğişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri olarak bilinen l nüfus. FLT-3 ligand uygulanması sonuçta murin modellerinde periferal lemfoid organlarda, dendritik hücrelerin genişlemesi ile sonuçlanır kemik iliğinden dendritik hücre progenitörlerinin göç sıklığını artırmaktadır. Farklı DC alt gruplarının in vivo yeterliliğini karşılaştırma hücre transferi deneylerinde kullanılmak için fonksiyonel dendritik hücrelerin çok sayıda saflaştırmak için bu model adapte edilmiştir.

Giriş

"Büyük yıldızsı (Yunan dendron) hücre" lenfoid organlara ¹ bulunduğu gibi dendritik hücreler (DC) neredeyse kırk yıl önce keşfedildi. Birçok çalışma, DH'ler etkili naif T hücreleri, ² stimüle tek antijen sunan hücreler olduğunu göstermiştir. Bu hücrelerin önemli bir fonksiyonu, antijen molekülleri üzerine alımı ve antijenlerin sunumu ve verimli işlem ve bunların yüklenmesidir. fare dalağı içinde DH'ler plazmasitoid geleneksel alt-grup halinde ayrılabilir. plazmasitoid DH'ler CD11c düşük ekspresyon ve B220 ve GR-1'in yüksek düzeyleri ile karakterize edilir. Onlar da yüzey işaretleyici mPDCA1 için pozitif ve reseptör 9 (TLR9) ligandların gibi ücretli cevaben interferon türü salgılar. Geleneksel DH'ler CD11c ve MHC sınıf II ekspresyonu için yüksektir. Bunlar, CD4, CD8α, DEC205, CD fenotipik işaretleyiciler yüzey ekspresyonu göre üç farklı alt-grup halinde ayrılabilen11b ve (33D1 antikoru tarafından tanınan DCIR2) dendritik hücre inhibitör reseptör 2 proteinleri ^3,4. CD8α ^Pos DH'ler da CDC1 olarak bilinir, bu tür CD11b ve 33D1 olarak miyeloid belirteçler için DEC205 için olumlu, ama olumsuzdur. Ayrıca Cdc2 denilen CD8α ^Neg DC'ler, 33D1, CD11b ve CD4 pozitif ama DEC205 yoksundur. Çift negatif alt kümesi (CD4 ve CD8α hem yani negatif) nadirdir ve DEC205 ve 33D1 için negatiftir. Bu en karakterize alt kümesi ve CD8α ^Neg DC daha az farklılaşmış formu olabilir.

Çeşitli DC alt gruplarında Fenotipik farklılıklar da in vivo fonksiyonları uzanır. CD8α ^Neg DH'ler yüksek fagositik ve esas olarak CD4 T hücrelerinin ³ MHC sınıf II ile ekzojen antijen mevcut olduğu düşünülmektedir. Bunun aksine, CD8α ^Pos DH'ler MHC sınıf I çözünür protein antijeni için özel olanbir mekanizma çapraz sunum denir. Çapraz sunum sonucu bu DCler ⁵ aktivasyon durumuna bağlıdır, ve sitotoksik T hücrelerinin (CTL'ler) veya düzenleyici T hücrelerinin ^{6 2,7} gelişimi genişlemesine neden olabilir ya da. Enfekte apoptotik hücrelerinden türetilen antijen sunumu kuvvetli bir CTL karşılığı ⁹ indükler ise, büyük ölçüde ^{T-hücreleri, 8} silme anti-DEC205-antikor-aracılı teslim sonuçları kullanılarak CD8α ^Sıra DH'lere antijenin hedefleme.

Peptit antijenlerinin tanınması ek olarak, bir memeli bağışıklık sistemi lipid ve glikolipit antijenler tanımak gelişmiştir. Bu antijenler, çeşitli memelilerdeki çok benzer formlarda mevcut MHC sınıf I-benzeri hücre yüzeyi proteinleridir CD1 molekülleri tarafından sunulmaktadır. Farelerde, CD1d adlandırılan yüksek derecede korunmuş CD1 molekülünün tek tip glikolipit antijenler ¹⁰ sunumundan sorumludur. büyük CD1d / glikolipid kompleksleri tanıyan T hücre popülasyonu değişmeyen NKT hücreleri (iNKT hücre) adı verilir. Bu hücreler, çeşitlilik ¹¹ sınırlı TCRβ zincirleri ile eşleştirilmiş bir değişmeyen TCRα zinciri oluşan bir yarı-değişmez T hücresi reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Çoğalmak ve aktive efektör T hücreleri olmak için ayırt etmek gerekir geleneksel T hücrelerinin aksine, iNKT hücreleri efektör nüfus olarak var ve glikolipid idaresi ¹² sonra hızla yanıt başlar. fizyolojik olarak uygun yağ antigen sunan hücrelerin tanımlanması, aktif bir araştırma alanıdır ve bu tip B hücreleri, makrofajlar ve DCler olarak birkaç farklı hücre tipleri bu işlemi gerçekleştirmek için önerilmiştir. Bununla birlikte, DC'lerin CD8α ^Pos grubu fare iNKT hücreleri ¹³ ve CD8 T hücreleri ¹⁴ glikolipid aracılı çapraz astarlama alımını ve lipid antijenlerin sunumu aracılık birincil hücre olduğu gösterilmiştir.

farklı antijen sunan hücreler tarafından antijen oluşumunun verimliliğini karşılaştırmak için,> "ove_content, basit bir yaklaşım, bu tür hücre transfer deneyleri genellikle immünolojik çalışmalar yapılmaktadır naif ana Antigenin eşdeğer miktarlarda ile doldurulan. saflaştınlmış APC 'lerin farklı transfer etmektir. bu hücreler, toplam hücrelerin ^15% 2'sinden azını oluşturan lenfoid organlarda olduğu gibi nadir nüfusu var çünkü Ancak, ex vivo antijen tedavi DC'ler transfer çalışmalarını gerçekleştirirken, zordur. donör hayvanlarda bu hücrelerin gelişimini arttırmak için bu nedenle gereklidir izole etme protokolleri şu etkinliğini geliştirmek için.

Bilindiği gibi, PDC, CD8 ^Pos ve CD8 ^Neg DC alt kümeleri, ekspres fms bağlantılı reseptör tirosin kinaz 3 (Flt-3) oluşturulması için gerekli olan genel lenfoid ve ortak miyeloid progenitör. In vivo FLT-3 ligandı üzerine (Flt-3L) uygulama, emigratFlt-3, kemik iliği projenitör hücrelerin eksprese iyon periferal lemfoid organlarının artan tohum ve olgun DC döl ¹⁶ genişlemesi ile sonuçlanır artar. Flt-3 ifadesi B, T ve NK hücre farklılaşması yollara işlenmesi sırasında kaybolur. Bu nedenle, çok az değişiklikler Flt-3L uygulanması üzerine bu hücrelerde görülmektedir. DC popülasyonları benzer genişletme Flt-3L ^17,18 sürekli sistemik düzeylerde temin edilmesi için basit ve ekonomik bir yöntem sağlar murin Flt-3L, salgılayan bir B16-melanom hücre hattı implantasyonu ile oluşturulan tümörleri taşıyan farelerde gözlenmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bu şekilde büyük ölçüde daha sonraki deneyler için izole edilebilir, bu hücrelerin verimlerini büyük ölçüde artırmak, fare dalağı içinde normal DC alt-genişlemesini uyarmak için Flt-3L salgılayan B16 melanom hücreleri implantasyonundan göre bir protokol geliştirilmiştir . 14 gün deri altı im aşağıdaki - Biz sürekli 10 içinde bulmaktoplam dalak hücrelerinin% 60 - Flt-3 salgılayan tümör ekimi, fareler 40 oluşturacak DH'lerin belirgin zenginleşme ile splenomegali gelişebilir. Bu dalaklarından farklı DC alt-gruplar yüksek saflıkta Standard Bu alt-spesifik fenotipik işaretleyiciler kullanan ticari olarak temin edilebilen hücre saflaştırma kitleri kullanılarak izole edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış esaslara uygun olarak yapılır. sterilite gerektiren tüm işlemler bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmaktadır.

Farelerde B16.Flt3L Melanom 1. implantasyonu

1. Kültür, 37 ° C'de% 10 _CO2 ile birlikte DMEM ortamı içinde 0.5 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir yoğunlukta T25 doku kültürü şişelerinde Flt-3 eksprese eden B16 melanoma hücre soyu. Hücreler ulaşana kadar ~% 90 izdiham (~ 20 saat) büyütün.
2. sindirim tripsin hücreleri hasat. Aspire hücre kültür ortamı ve PBS ile yapışık hücrelere yıkayın. % 0.05 tripsin 5 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir. Proteaz hazmı sönmesi için soğuk 20 ml bitmiş DMEM ortamı fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden (4 ° C) ekleyin. hafifçe hücreleri kaldırın nazikçe yukarı ve aşağı pipetleme takip vurma.
3. 300 santrifüj hücreleri toplamak4 ° C'de 10 dakika boyunca x g. Hemasitometre veya otomatik hücre canlılığı sayacı kullanarak hücreleri sayın. PBS içinde 10 ⁸ hücre / ml'lik bir yoğunluğa yeniden süspanse edin.
4. Deri altına enjeksiyon ile tümör hücreleri ile implant fareleri (C57BL / 6 ya da başka bir histo suşu) hücre süspansiyonu, 100 ul (10 ⁷ hücre) ile boyun tabanına Machholz ve ark., ¹⁹ tarafından tarif edildiği gibi.
5. organ için hayvanlar kurban edilmeden önce (12 gün - - çapı 10 mm, genellikle 7 2) tümör palpe veya görünür kadar büyümeye izin verin.

Tümör taşıyan fareler ile Dalak Tek Hücre Süspansiyon 2. Hazırlık

1. izofluran aşırı dozda (>% 5 izofluran akış hızını ayarlamak ve durur nefes sonra poz en az 2 dakika devam) ile fareler anestezi. Ötenazi için kurumsal kurallarına göre servikal dislokasyon ile Flt-3 melanom tümör taşıyan fare Kurban.
2. diSteril makas ²⁰ yardımı ile aseptik teknik kullanılarak,% 70 etanol ve hasat dalak ile cilt sinfect.
3. Biyogüvenlik kabini taşınması için steril bir Petri kabı içine dalak yerleştirin. steril koşullar altında burada tüm adımları uygulayın.
4. taze Petri kabı dalak aktarın ve RPMI ortamı ile yıkayın. Bir neşter kullanılarak küçük (~ 0.2 cm ²⁾ parçalar halinde dalak kesin. kolajenaz / DNaz çözeltisinin 10 ml'si ile 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
5. 70 mikron hücre süzgecinden üzerine dalak dokusunun kısmen sindirilmiş süspansiyon dökün. 5 ml şırınga pistonu kullanarak süzgeçten ağı boyunca kalan doku parçaları sıkıştırın.
6. taze ortam 10 ml örgü filtre yıkayın ve filtreyi atın. pelet hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de süspansiyon santrifüjleyin.
7. Süpernatant aspire ve RBC parçalama tamponu 2 ml hücre pelletini. RT f inkübeya da 10 dakika. tam RPMI ortamında 10 ml ekleyerek RBC parçalama tamponu Quench.
8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. Uygun hacimde yeniden süspanse Fc Block antikoru (2.4G2) 20 ug / ml içeren bir hücre ayırma tamponu (örneğin, MACS) içinde 10 ⁸ hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için.

Dalak Tek Hücre Süspansiyon gelen plasmasitoid DC'ler, CD8α ^Pos DC'lerin ve CD8α ^Neg DH'lerin 3. saflaştırılması

., Tek bir hücre süspansiyonu dalak DC alt-izolasyonu, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bir çok-aşamalı bir işlemdir 4 bir ısıyı sürdürmek için önceden soğutulmuş tampon ve bir buzlu su banyosu kullanılarak, tüm adımları - 8 ° C: Not. Protokol aşağıdaki bölümde tüm reajan hacimleri 10 ⁸ hücre / ml), dalak hücre süspansiyonu 200 ul bir ilk giriş için hesaplanır. Bu kadar ölçeklendirilebilir veyaaşağı ve orantılı ilk adım (3.1.1 ve 3.2.1) diğer reaktif (her zaman 1 x 10 ⁸ hücre / ml yoğunlukta) hücre süspansiyonu hacmini değiştirerek ihtiyaca dayalı. buna göre tüm sonraki adımda reaktif hacimlerini ayarlayın. Örneğin, 1, ⁸ x 10 / ml dalak hücre süspansiyonu 100 ul ile başlayan tüm adımlarda yarısı belirtilen reaktif hacimlerini kullanımı.

1. Plasmasitoid DC'ler izolasyonu (PDC)
   1. dalak hücre süspansiyonu 200 ul plazmasitoid DC İzolasyon kiti temin biyotin etiketli antikor kokteyli 300 ul ekle.
   2. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. askıya hücreleri korumak için, ve bağlayıcı antikor maksimize etmek için tüpü her 3 dakikada dokunun.
   3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. Süpernatant aspire bağlanmamış biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için.
   4. hücreyi yeniden süspansehücre sıralama tampon 500 ul pelet. anti-biyotin antikor eşlenik boncuklar 300 ul ekle. Adımı tekrarlayın 3.1.2 ve 3.1.3.
   5. Süpernatant atılır ve hücre ayırma tamponu, 2 ml hücre pelletini. önceden soğutulmuş tamponlar kullanılarak oda sıcaklığında bu noktada tüm adımları.
   6. manyetik stand LS sütun sıralama taze manyetik aktive hücre yerleştirin. Yıkama ve hücre ayırma tamponu, 5 ml ile kolon dengeye.
   7. Sütun üzerine hücre süspansiyonu pipetle kolon yatağın yüzeyinin ortasına yavaşça uygulanması. akışı toplayın.
   8. hücre sıralama 10 ml tampon ile kolon yıkayın. gerçekleşen bu akışa toplamak ve adım 3.1.7 geçen akış ile birleştirir. PDC (FT1) aracılığıyla bu sütun akışında zenginleştirilmiştir.
   9. 2 ml hücre ayırma tamponu içinde 4 ° C, tekrar süspansiyon, 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FT1 hücreleri pelet ve taze LS kolonu boyunca hücrelere geçme3.1.8 - adımları 3.1.6 tekrarlayarak. İki ardışık sütun bu kullanımı izole hücrelerin gelişmiş saflığını verir.
   10. 2 ml tam RPMI ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve tekrar süspansiyon Pelet hücreleri. gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirin.
2. CD8α ^POS ve CD8α ^Neg DC'lerin izolasyonu
   Not: Bu prosedürde ilk adım B, pDC, T ve NK hücrelerinin tükenmesi olduğunu.
   1. Bütün dalak hücresi süspansiyonuna (adım 2.8 'de elde edilen 10 ⁸ hücre / ml'lik 1 mi) ile başlayarak, CD8α ^Pos DC yalıtımı kitinde verilen biyotin-konjuge antikor kokteyli 100 ul ilave edin.
   2. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. hedef hücrelere biotin etiketli antikorların bağlanma maksimize etmek için tüp hafifçe her 3 dakikada dokunun.
   3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. aspire süperilişkisiz biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için yüzen.
   4. Hücre sıralama tampon 150 ul ve CD8α ^Pos DC yalıtımı kitinde verilen anti-biyotin boncuk 100 ul ekle. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir.
   5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 10 mi hücre ekleyin ve pelet.
   6. Yeniden süspanse 1 ml hücre ayırma tamponu içinde hücreler ve adımlar 3.1.8 boyunca 3.1.6 prosedüre uygun olarak taze bir LS kolonu üzerinden geçer.
   7. 2 (FT2) aracılığıyla işaretlenmemiş akışını toplamak ve sütun bakiyenin atın. Bu etiketsiz fraksiyon CD8α ^Pos ve CD8α ^Neg DC'ler için zenginleştirilmiştir.
   8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FT2 hücreleri Pelet.
   9. 1 ml hücre sıralama tampon hücreleri tekrar süspansiyon ve CD8α ^Pos DC izolasyon kiti sağlanan anti-CD8α konjuge manyetik boncuk 200 ul ekleyin.
   10. temsilci3.2.6 arasındaki adımları 3.2.2 yemek. Sütunun geçen akış CD8α ^Neg DC'ler için zenginleştirilmiş ve CD8α ^Pos DC'ler için tükenmiştir. Bu 3 (FT3) akışı etiketli.
   11. CD8α ^Pos DC'ler sütununda muhafaza Zehir için, mıknatıstan sütunu kaldırmak hücre sıralama tampon 5 ml ekleyin ve LS kolonu ile temin edilen bir piston kullanarak kolon matrisi temizlemek.
   12. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. 1 ml hücre ayırma tamponu içinde aspire supernatant ve tekrar süspansiyon. akış atmak ve 3.2.11 gibi muhafaza hücreleri toplamak dışında, saflığını artırmak 3.1.8 için adımları 3.1.6 tekrarlayarak yeni bir LS sütun aracılığıyla yeniden yıkandı hücreleri çalıştırmak için.
   13. ST3 süspansiyondan CD8α ^Neg DC'ler arıtmak için, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FT3 pelet ve hücre ayırma tamponu, 300 ul süspansiyon haline getirin.
   14. Anti-CD11c mag 100 ul ekleyinmanyetik boncuklar. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir.
   15. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile 10 mi hücre sıralama tamponu ve pelet hücreleri ekleyin.
   16. Tekrarlayın 3.1.8 ile 3.1.5 adımları. CD8α ^Neg DH'ler pozitif CD11c boncuklar ile seçilir ve kolona bağlanmıştır. akış yoluyla çıkarılabilir.
   17. Saflaştırılmış CD8α ^Neg DCler toplamak için aşama 3.2.11 de tarif edildiği gibi kolon içinde alıkonur ve hücreler Zehir.

Antijen ve Hücre Transferi 4. Sıralı Yanan APC'ler

1. Arıtma, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek tripan mavisi dışlama ^21. kullandıktan sonra canlı hücreleri saymak.
2. tercih edilen antijen ile inkübe hücreleri. 100 nM konsantrasyonda ¹³ de glycolipid antijen denilen alfa-galaktozil seramid (αGalCer) analogları kullanın. Tipik haliyle, çok düşük attac kullanılarak 10 ⁶ canlı hücre / kuyuda tam RPMI levhahment U tabanlı, 96 oyuklu plakalar hücre eki en aza indirir. 4 saat - 1, 37 ° C'de% 5 _CO2 atmosferinde inkübe hücreleri.
3. hafifçe birkaç kez pipetleme Hasat hücreleri. kesme kuvvetlerinin hücre hasarı en aza indirmek için geniş delik pipet uçları kullanın. PBS ile kuyu yıkayın ve hücre hasat üst düzeye çıkarmak için bu yıkar havuz.
4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri ve PBS içinde arzu edilen bir yoğunluğa yeniden süspanse edin. Tipik olarak, alıcının, hayvan başına 200 ul 1.000.000 hücre enjekte edilir. konak hayvanların içine uygulanmadan önce canlılığı maksimize etmek hücreleri buz üzerinde tutun.
5. Intravenöz farelere ya yanal kuyruk damarı ya da retro-orbital venöz pleksus yoluyla ¹⁹ hücreleri enjekte edilir. 1 ml şırınga üzerinde 27 G iğne kullanın ve fare başına 0.1 ml maksimum hacim enjekte.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu prosedürün sonucu implante melanoma hücreleri tarafından ifade fare Flt-3L DC alt kümeleri genişletilmesi dayanmaktadır. B16.Flt3L tümör C57BL / 6 fareden türetildi ve red nedeniyle tesis haline tümörün başarısızlığı önlemek için bu suş kökenli, hayvanlara implante edilmiş olmalıdır. Bazı durumlarda, yollar veya ilgi reseptörleri sinyal bilinen kusurları ile DC'ler elde etmek için genetik olarak modifiye edilmiş fareler kullanmak arzu edilebilir. Tü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Dendritik hücrelerin T hücre yanıtlarının prime dahil sunan hücreler büyük profesyonel antijen olarak kabul edilmektedir. Onların ana fonksiyonu T hücrelerine sunum için antijenleri alarak ve işleyerek doku mikro incelemektir. Belirli DC alt gruplarının işlevini incelemek için, bu normal fenotip ve fonksiyonlarını koruyan bir yaklaşım kullanarak yeterli sayıda izole edilmesi gerekir. Çoğu protokolleri naif farelerin spesifik DC alt kümesi izolasyonu güveniyor. Bu hücreler az olduğu için, izol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.