Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Resumo

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Resumo

As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais primariamente responsável pela aquisição, processamento e apresentação de antigénios no antigénio que apresenta moléculas para iniciar a imunidade mediada por células-T. As células dendríticas podem ser separados em vários subconjuntos fenotipicamente e funcionalmente heterogéneas. Três subconjuntos importantes de células dendríticas esplênicas são plasmocit�des, as células CD8a ^POS e CD8a ^Neg. As DCs plasmocitoides são produtores naturais de interferão de tipo I e são importantes para a imunidade de células T anti-viral. O subconjunto de CD8a ^Neg DC é especializado para apresentação de antígenos MHC classe II e está envolvido no centro de priming células T CD4. O CD8a ^Pos DCs são os principais responsáveis ​​para a apresentação cruzada de antígenos exógenos e priming células T CD8. As DCs CD8a ^Pos ter sido demonstrado ser mais eficaz na apresentação de antigénios de glicolípidos por moléculas CD1d a um cel t especializadol população conhecidas como células invariante natural killer T (iNKT). A administração de ligando Flt-3 aumenta a frequência de migração de células progenitoras de células dendríticas a partir da medula óssea, resultando em última análise, a expansão de células dendriticas em órgãos linfóides periféricos em modelos murinos. Temos este modelo adaptado para purificar grandes números de células dendríticas funcionais para utilização em experiências de transferência de células para comparar proficiência in vivo de diferentes subconjuntos de DC.

Introdução

As células dendríticas (DC) foram descobertos há quase quarenta anos como o "grande estreladas celular (dendron grego)" encontrado nos órgãos linfóides ^1. Muitos estudos têm demonstrado que DC são as únicas células que apresentam o antigénio que pode estimular eficazmente células T ingénuas ^2. Uma das principais funções destas células é a absorção de antigénios e apresentação e o seu processamento eficiente e carregamento destes para moléculas que apresentam antigénios. No baço de ratinho, as DCs pode ser separado em subconjuntos e plasmocit�des convencionais. As DCs plasmocitoides são caracterizados por uma baixa expressão de CD11c e níveis elevados de B220 e Gr-1. Eles também são positivas para o mPDCA1 marcador de superfície e secretar interferon tipo I em resposta a toll like receptor 9 ligantes (TLR9). As DCs convencionais são elevados para CD11c e MHC classe expressão II. Eles podem ser divididos em três subgrupos distintos com base na expressão de superfície de marcadores fenotípicos tais como CD4, CD8a, DEC205, CD11b e receptor de células dendríticas 2 inibitória (DCIR2, reconhecida pelo anticorpo 33D1) proteínas de ^3,4. Os CD8a ^Pos DCs são também conhecidos como CDC1, são positivos para DEC205, mas negativo para marcadores mielóides tais como CD11b e 33D1. O CD8a ^Neg DCs, também chamado cdc2, são positivos para 33D1, CD11b e CD4, mas falta DEC205. O subconjunto dupla negativa (isto é, negativo para CD4 e CD8a) é relativamente rara, e é negativo para DEC205 e 33D1. É o subconjunto menos caracterizado e pode ser uma forma menos diferenciadas de CD8a ^Neg DC.

Diferenças fenotípicas nos diferentes subconjuntos de DC também se estendem para as suas funções in vivo. O CD8a ^Neg DCs são altamente fagocítica e são pensados ​​para apresentar antigénio exógeno principalmente por via do MHC de classe II às células T CD4 + ^3. Em contraste, as DCs CD8a ^Pos são especializados para apresentação de antigénio proteico solúvel em MHC de classe Inum mecanismo denominado apresentação cruzada. O resultado da apresentação cruzada depende do estado de activação de estas DCs ^5, e pode levar à expansão das células T citotóxicas (CTL) ou o desenvolvimento de células T reguladoras ^{6 2,7.} Segmentação de antigénio para CD8a ^Pos DCs utilizando resultados de entrega anti-DEC205-anticorpo-mediadas, em grande parte na eliminação de células T ^8, enquanto que a apresentação de antigénios derivados de células apoptóticas infectadas induz uma forte resposta de CTL ^9.

Além do reconhecimento de antigénios peptídicos, o sistema imunitário de mamífero evoluiu para reconhecer lípido e antigénios de glicolípidos. Estes antigénios são apresentados por moléculas de CD1, que são proteínas de MHC de classe I na superfície de células semelhantes que existem em várias formas relacionadas em vários mamíferos. Em ratos, um único tipo de molécula de CD1 CD1d altamente conservada chamada é responsável pela apresentação de antigénios glicolipidicos ^10. O prefeito população de células T que reconhecem os complexos glicolipidicos / CD1d é chamado células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) composto por uma cadeia invariante TCRα que é emparelhado com cadeias TCRβ que a diversidade ¹¹ limitadas. Ao contrário das células T convencionais que precisam proliferam e se diferenciam para se tornarem células T efectoras activadas, existem células iNKT como uma população efectora e começar a responder rapidamente após a administração de ¹² glicolípido. Identificação de células apresentadoras de antigénio lípido fisiologicamente relevante é uma área activa de investigação, e vários tipos de células distintos, tais como células B, macrófagos e células dendríticas têm sido sugeridos para executar esta função. No entanto, demonstrou-se que o subconjunto CD8a ^Pos de DCS é a principal célula mediar a captação e a apresentação de antigénios a células lipídicas rato iNKT ¹³ e glicolípido mediada cross-priming de células T CD8 ^14.

ove_content "> Para comparar a eficiência da apresentação de antigénio por diferentes células apresentadoras de antigénio, uma abordagem simples é a transferência de diferentes tipos de APC purificadas pulsadas com quantidades equivalentes de antigénio em hospedeiros sem tratamento prévio. experiências de transferência celular deste tipo são muitas vezes realizados para estudos imunológicos. no entanto, a realização de estudos de transferência com DCs tratadas ex vivo antigénio é desafiador, uma vez que estas células não existem populações como raros em órgãos linfóides, onde eles constituem menos do que 2% do total de células ^15. por conseguinte, é necessário reforçar o desenvolvimento destas células em animais dadores para aumentar a eficácia dos protocolos de isolamento.

Sabe-se que o linfóide comum e progenitores mielóides comuns, que são necessários para a geração de pdc e CD8 ^Pos subconjuntos e CD8 ^Neg DC, fms relacionados expressa a tirosina-cinase do receptor 3 (Flt-3). Após a in vivo, ligando Flt-3 (Flt-3L) administração, emigratião de Flt-3 que expressam as células progenitoras da medula óssea é aumentada, resultando no aumento da semeadura de órgãos linfóides periféricos e a expansão da sua descendência madura CC ^16. A expressão de Flt-3 é perdida durante compromisso com o B, T ou NK vias de diferenciação celular. Portanto, apenas alterações mínimas são observados nestas células após administração Flt-3L. Expansão similar em populações DC é observada em ratinhos portadores de tumores gerados por implantação de uma linha celular de melanoma B16-secretoras de murino Flt-3L, que proporciona um método simples e económico para proporcionar níveis sistémicos sustentados de Flt-3L ^17,18. Utilizando esta abordagem, temos desenvolvido um protocolo com base na implantação de células B16 de melanoma secretoras de Flt-3L para estimular a expansão de todos os subconjuntos normais DC em baço de ratinho, aumentando assim os rendimentos destas células que podem ser isolados por experiências subsequentes . Nós sempre achar que dentro de 10 - 14 dias após im subcutâneaplantação do tumor secretor de Flt-3, os murganhos desenvolvem esplenomegalia com enriquecimento acentuada das DCs para constituir 40 - 60% do total de células de baço. A partir destes baços, diferentes subconjuntos de DC pode ser isolado com pureza elevada utilizando kits de purificação de células padrão disponíveis comercialmente que utilizam marcadores fenotípicos específicos do subconjunto.

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Protocolo

Experiências em animais são feitos de acordo com as directrizes aprovadas do comitê institucional cuidados com os animais e uso (IACUC). Todos os procedimentos que requerem a esterilidade são realizadas em uma cabine de segurança biológica.

1. Implantação de Melanoma B16.Flt3L em Ratos

1. Cultura da linha expressando Flt-3 de células de melanoma B16 em frascos de cultura de tecidos T25, a uma densidade de 0,5 X 10 ⁶ células / ml em meio DMEM completo com 10% de CO ₂ a 37 ° C. Crescer até as células atingirem confluência ~ 90% (~ 20 h).
2. Colher as células por digestão com tripsina. Aspirar os meios de cultura de células e lavar as células aderentes com PBS. Adicionar 5 ml de 0,05% de tripsina e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicionar a frio 20 ml de meio DMEM completo (4 ° C) contendo soro fetal de vitelo (FCS) para extinguir a digestão com protease. Levante as células off batendo levemente seguido cuidado pipetando para cima e para baixo.
3. Recolher as células por centrifugação a 300xg durante 10 min a 4 ° C. Contar as células utilizando um hemocitómetro ou um contador de viabilidade de células automatizado. Ressuspender a uma densidade de 10 ⁸ culas / ml em PBS.
4. Ratinhos implante (C57BL / 6 ou outra estirpe histocompatível) com células de tumor por injecção subcutânea como descrito por Machholz et al. ^19, na base do pescoço com 100 ul de suspensão de células (10 ⁷ células).
5. Permitir que o tumor crescer até serem palpáveis ​​ou visíveis (2 - 10 mm de diâmetro, geralmente de 7 - 12 dias) antes de sacrificar os animais para os órgãos de colheita.

2. Preparação de Esplênica suspensão única célula de RATOS COM TUMOR

1. Anestesiar ratos com uma overdose de isoflurano (ajustar a taxa de fluxo de isoflurano a> 5% e continuar a exposição, pelo menos, 2 minutos após a paragens de respiração). Sacrificar o mouse rolamento Flt-3 tumor melanoma por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais para a eutanásia.
2. disinfect a pele com 70% de etanol e colheita do baço utilizando uma técnica asséptica, com o auxílio de uma tesoura esterilizada ^20.
3. Colocar o baço em uma placa de Petri estéril para o transporte para a cabine de segurança biológica. Execute todas as etapas a partir daqui em condições estéreis.
4. Transferir baço para um prato fresco Petri e lavar com meio RPMI. Cortar o baço em pedaços pequenos (~ 0,2 centímetros ²⁾ utilizando um bisturi. Incubar durante 30 min a 37 ° C com 10 ml de solução de colagenase / ADNase.
5. Verter a suspensão parcialmente digerido de tecido do baço sobre um filtro celular de 70 uM. Comprimir os restantes fragmentos de tecido através da tela do filtro com 5 ml de uma êmbolo da seringa.
6. Lavar o filtro de malha com 10 ml de meio fresco e descartar o filtro. Centrifugar a suspensão a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar as células.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos. Incubar à temperatura ambiente fou 10 min. Extingue-se a tampão de lise dos glóbulos vermelhos por adição de 10 ml de meio RPMI completo.
8. Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender em volume apropriado para atingir a densidade de células de 10 ⁸ culas / ml em tampão de separação de células (por exemplo, MACS) contendo 20 ug / ml de anticorpo de Fc-bloco (2.4G2).

3. Purificação de plasmocitóides DCs, CD8a ^Pos DCs e CD8a ^Neg DCs a partir do baço suspensão única célula

Nota: O isolamento dos subconjuntos de DC esplénicos de suspensão de célula única é um processo multi-passo, como ilustrado na Figura 1 execute todas as etapas usando tampão de pré-arrefecido e um banho de água gelada para manter a temperatura a 4-8 ° C.. Todos os volumes de reagente na seção seguinte do protocolo são calculados para uma entrada inicial de 200 ul de suspensão de células do baço em 10 ⁸ células / ml). Este pode ser aumentado oupara baixo com base na sua necessidade, alterando o volume de suspensão de células (sempre com uma densidade de 1 x 10 ⁸ células / ml) e outros reagentes proporcionalmente no passo inicial (3.1.1 e 3.2.1). Ajustar os volumes de reagente em todas as etapas posteriores de acordo. Por exemplo, se começando com 100 ul de suspensão de células do baço a 1 x 10 ⁸ / mL, usar metade dos volumes de reagentes indicados em todas as etapas.

1. Isolamento de plasmocitóides DCs (PDC)
   1. Adicionar 300 ul de coquetel de anticorpo marcado com biotina fornecido no kit de isolamento de DC plasmocit�des a 200 ul de suspensão de células do baço.
   2. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. Toque no tubo a cada 3 minutos para manter as células em suspensão, e para maximizar a ligação do anticorpo.
   3. Adicionar 12 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante para remover os anticorpos não ligados biotinilados.
   4. Ressuspender a célulapellet em 500 ul de tampão de separação de células. Adicionar 300 ul de esferas de anticorpo anti-conjugado com biotina. Repita o passo 3.1.2 e 3.1.3.
   5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de separação de células. Execute todas as etapas a partir deste ponto à temperatura ambiente usando buffers pré-arrefecido.
   6. Coloque uma célula ativada magnética fresco triagem coluna LS no suporte magnético. Lave e equilibrar coluna com 5 ml de tampão de separação de células.
   7. Pipetar a suspensão de células na coluna, aplicando-o suavemente para o centro da superfície do leito da coluna. Recolhe-se o fluxo através de.
   8. Lava-se a coluna com 10 ml de tampão de separação de células. Recolha este fluxo através e combinar com o fluxo através do passo 3.1.7. Os pDCs são enriquecidos nesse fluxo de coluna através de (FT1).
   9. Agregar as células de FT1 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, ressuspender em 2 ml de tampão de triagem de células e passar as células através de uma coluna LS frescorepetindo os passos 3.1.6 - 3.1.8. Este uso de duas colunas sequenciais produz pureza aumentada de células isoladas.
   10. as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender com 2 ml de RPMI completo. Coloque em gelo até ser necessário.
2. Isolamento de CD8a ^Pos e CD8a DCs ^Neg
   Nota: O primeiro passo neste processo é a depleção de células B, PDC, T e NK.
   1. Começando com toda a suspensão de células do baço (1 ml de ⁸ a 10 células / ml obtidas no passo 2.8), adicionar 100 ul de coquetel de anticorpo conjugado com biotina fornecido no kit de isolamento de CD8a ^Pos DC.
   2. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. Toque suavemente o tubo a cada 3 min para maximizar a ligação dos anticorpos marcados com biotina para suas células alvo.
   3. Adicionar 12 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar Supernatant para remover os anticorpos biotinilados não ligados.
   4. Adicionar 150 ul de tampão de separação de células e 100 ul de contas de anti-biotina fornecidos no kit de isolamento de CD8a ^Pos DC. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min.
   5. Adicionar 10 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
   6. Ressuspender as células em tampão de classificação 1 ml de células e passar sobre uma coluna LS frescos acordo com o procedimento nos passos 3.1.6 através de 3.1.8.
   7. Recolhe-se o fluxo não marcado a 2 (FT2) e descartar o material retido coluna. Esta fracção não marcado é enriquecido para CD8a ^Pos e CD8a DCs ^Neg.
   8. Agregar as células em FT2 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
   9. Ressuspender as células em tampão de células de triagem 1 ml e adicionar 200 ul de anti-CD8a contas magnéticas conjugadas fornecidos no kit de isolamento de CD8a ^Pos DC.
   10. Repcomer passos 3.2.2 através de 3.2.6. O fluxo através da coluna é enriquecido para CD8a ^Neg DCs e esgotado para CD8a ^Pos DCs. Esta é rotulada fluxo através de 3 (FT3).
   11. Para eluir a CD8a ^Pos DCs retidos na coluna, a coluna de remover o íman, adicionam-se 5 ml de tampão de separação de células e purgar a matriz da coluna utilizando o êmbolo fornecida com a coluna LS.
   12. Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em tampão de triagem 1 ml de células. Para aumentar a pureza, executar as células eluídas novamente através de uma coluna LS fresca, repetindo os passos 3.1.6 a 3.1.8, excepto descartar o fluxo através e recolher células retidas como em 3.2.11.
   13. Para a purificação de CD8a ^Neg DCs a partir da suspensão FT3, sedimentar a FT3 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender em 300 ul de tampão de separação de células.
   14. Adicione 100 ml de mag anti-CD11cgrânulos magnética. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min.
   15. Adicionar triagem células de tampão e 10 ml de pelotas de células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
   16. Repita os passos 3.1.5 através de 3.1.8. O CD8a ^Neg DCs são selecionados positivamente com contas CD11c e estão ligadas à coluna. O fluxo que atravessa pode ser descartado.
   17. Elui-se as células retidas na coluna tal como descrito no passo 3.2.11 para recolher a CD8a purificada ^Neg DCs.

4. Pulsing APCs com antígenos e Transferência de celular

1. Contar as células vivas após purificação usando exclusão de azul tripano ²¹ a distinguir as células vivas e mortas.
2. Incubam-se as células com o antigénio de escolha. Use análogos de antigénio glicolipídico ceramida chamada alfa-galactosilo (αGalCer) na concentração de 100 nM de ^13. Normalmente, placa 10 ⁶ células viáveis ​​bem em meio RPMI / completo utilizando ultra-low ATTAChment de fundo em U placas de 96 poços para minimizar a ligação de células. Incubar as células em uma atmosfera de 5% de _CO2 a 37 ° C durante 1-4 h.
3. Células colheita com cuidado pipetando várias vezes. Use largas dicas furo de pipeta para minimizar os danos celulares a partir de forças de cisalhamento. Lavar os poços com PBS e agrupar as lavagens para maximizar a colheita de células.
4. Agregar as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender a densidade desejada em PBS. Tipicamente, injectar 1 milhão de células em 200 ul por animal receptor. Manter as células no gelo para maximizar a viabilidade antes da administração em animais hospedeiros.
5. Injetar células por via intravenosa em ratos, quer através do vão lateral da cauda ou do plexo venoso retro-orbital ^19. Usar uma agulha G 27 numa seringa de 1 ml e injectar um volume máximo de 0,1 ml por ratinho.

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Resultados

O resultado deste procedimento baseia-se na ampliação de subconjuntos de DC de murino por Flt-3L expressos pelas células de melanoma implantado. O tumor B16.Flt3L foi derivado a partir de um ratinho C57BL 6 /, e deve ser implantado num animal com essa estirpe de fundo, a fim de evitar o fracasso do tumor para se estabelecer devido à rejeição. Em alguns casos, pode ser desejável a utilização de ratinhos geneticamente modificados para derivar as DCs com defeitos conhecidos nas via...

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Discussão

As células dendríticas são aceites como sendo a principal antigénio profissional células envolvidas na iniciação de respostas de células T apresentando. Sua função principal é fazer um levantamento do microambiente do tecido, tomando-se e processar antigénios para apresentação às células T. A fim de estudar a função dos subconjuntos de DC específicos, estes devem ser isolado em quantidade suficiente usando uma abordagem que mantém o seu fenótipo e funções normais. A maioria dos protocolos contar c...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.