直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

要約

このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。

要約

直接血栓イメージングは​​、血栓塞栓性梗塞の根本的な原因を可視化します。画像血栓にできることは、直接、間接測定に頼るのではなく、ストロークのはるかに優れた調査を可能にし、強力かつ堅牢な血管研究ツールとなります。我々は、分子イメージング血栓マーカーで血栓をラベル光イメージングアプローチを使用します - 共有結合血塊成熟のプロセス中に活性化凝固第XIIIa因子のフィブリン架橋酵素作用によって血栓のフィブリン鎖にリンクされたCy5.5、近赤外蛍光（NIRF）プローブ。フィブリン：マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）ベースのアプローチは、血餅の主要な構成要素を標的とするために、官能血栓求めて金ナノ粒子（AuNPs）を使用しています。本論文では、in vivoマイクロCT で合わせ、塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血栓塞栓のex vivo NIRFイメージングのための詳細なプロトコルを記述しています。我々は、in vivoであることを示します</ em>のマイクロCTおよびフィブリン標的グリコールキトサンAuNPsは（FIB-GC-AuNPs）の両方の現場での血栓や脳塞栓血栓で可視化するために使用することができます。我々はまた、直列組織プラスミノーゲン活性化因子媒介血栓溶解の治療効果をモニターするためのin vivoマイクロCTに基づく直接血栓イメージングの使用を記載しています。最後のイメージングセッションの後、我々は、ex vivoで NIRFがエクステントと脳内の残留血栓塞栓の分布を画像化することによって実証します。最後に、我々は定量的なイメージがマイクロCTとNIRFイメージングデータの分析について説明します。 ex vivoで NIRFイメージング対in vivoでの hyperdenseのマイクロCT血栓のボリューム上の血栓関連の蛍光シグナルの面積を：直接血栓イメージングを組み合わせた手法は、血栓の可視化の、2つの独立した方法を比較することができます。

概要

6人に1人は生涯のある時点でのストロークを持っています。虚血性脳卒中は、これまでで最も一般的なストローク型であり、すべての脳卒中症例の約80パーセントを占めています。血栓塞栓は、これらの虚血性脳卒中の大部分を引き起こすので、直接血栓イメージングへの関心が高まっています。

これは、200万人の脳細胞がスローガン「時間が脳である」につながる、中大脳動脈閉塞¹の毎分の間に死亡していると推定されました。コンピュータ断層撮影（CT）の研究が急速に行われ、広く利用可能であることができます。このため、CTは、初期診断及び超急性虚血性脳卒中の治療のための選択のイメージング残ります。血栓溶解のための組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）を投与すること、および/または血管内凝血塊-検索²にトリアージ：CTは重要な初期の決定を通知するための特に価値があります。現在のCTベースの血栓イメージング、しかし、シリアル大脳を追跡することはできませんin vivoでのリットルの血栓塞栓、それは間接的な方法を使用しているためには、血栓を実証するために：ヨード造影により血液プールの不透明化した後、血栓が血管内の欠陥を埋めることが証明されています。このように、血栓の繰り返しイメージングを排除ヨード造影の反復投与に関連した線量限度とリスクがあります。

したがって、より速く、より良い治療法の決定なされるようにする脳卒中患者における脳血栓の直接イメージング法のための重要な必要性があります。我々は、血栓を求めるナノ粒子、分子造影剤を使用して、CT、ストロークのために現在使用される現場の撮像モダリティの値を高めることによってこれを達成することを提案します。

我々は、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）、迅速なデータ収集を可能にするCTの高解像度のエクスビボまたはインビボ （小動物）イメージングバージョンを使用して、この薬剤の使用を実証しています ^{3,4。でも小動物マイクロCT（人間サイズのスキャナから入手できるよりはるかに悪い）ために利用可能な比較的弱い軟部組織コントラストで、造影剤は、分子によって強化された「密な血管記号 'それらCT上hyperdense行うことで、血栓を追求し、マークすることができましたイメージング。}

CT技術を補完するものとして、当社グループは、以前に脳の血栓負担^5を視覚化するのCy5.5、近赤外蛍光（NIRF）プローブを用いた光直接血栓イメージング技術を開発しました。これは、死後脳でのex vivoでの技術ですが、非常に敏感であり、研究の設定in vivoのデータで確認するためのものです。

CTとNIRF両方基づく血栓を求めるイメージング技術を持つことは、私たちが虚血性脳卒中の開発の過程における血栓および血栓イメージングの役割に非常に有益なデータを達成するためにこれらの技術を比較対照することができます。

HERE、我々は、in vivoマイクロCTおよびex vivo NIRFイメージングの組み合わせ技術の詳細なプロトコルは直接塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血栓塞栓を視覚化することについて説明します。これらのシンプルで堅牢な方法は提供していますex vivoでのデータが続き、治療中にin vivoでの迅速かつ定量的にダイナミックな血栓進化の血栓負担/分布と特性評価のin vivo評価に正確を可能にすることによって、血栓性疾患の我々の理解を進めるために有用ですin vivoイメージング所見を確認するための制御および参照標準として。

プロトコル

このプロトコルで実証すべての動物の手順を見直し、東国大学一山病院動物実験委員会によって承認され、ケアと動物の使用のためのNIHガイドに記載の原則及び手続に従って行われています。

蛍光マーカーで標識外因的に形成された血栓の作製（図1）

1. 30％酸素（1.5 L /分の酸素100％）と混合し、3％イソフルランを用いて誘導チャンバ内でマウスを麻酔。筋肉の緊張を観察し、つま先のピンチの反射が存在しないことを確認することで、麻酔の十分な深さを確認してください。
2. 腹臥位に滅菌ドレープで動物を置き、30％の酸素と混合し、吸入マスクと2％イソフルランを用いて麻酔下でそれを維持します。無菌技術および滅菌ガウン/マスク/手袋/楽器を使用して、次の手順を実行します。 Aの前に70％アルコールで実験的なエリアを清掃し、消毒することにより、無菌状態を維持ND手続き後。
3. 心臓穿刺⁶後、約300〜千μlの動脈血を採取します。蛍光血餅をマークするために、30μlのC15プローブ^5（20マイクロモル/ L濃度）、活性化された第XIII因子（活性化XIII因子）凝固酵素のフィブリン架橋活性に対して敏感Cy5.5の蛍光プローブを用いて70μlの全血を混ぜる（ 図1A ）。長さ20cmのポリエチレンチューブ（PE-50、ID 0.58ミリメートル）に3ミリリットル注射器（23ゲージの針）を用いた混合血液を注入します。 PEチューブは滅菌（またはメーカーが無菌認定）および血栓は、組織培養フード内で無菌的に準備する必要がありますする必要があります。
4. 呼吸と心臓パルスの欠如を観察することにより、動物の死を確認します。
5. 以前に^7を報告したように、22時間、4℃で、その後、2時間室温で血液ロードチューブのままにして、次の手順を実行します。
6. 1.5センチメートル長の片に血栓含むチューブをカット。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を充填したの3mlの注射器を使用して、穏やかにチューブの各片にPBSを注入して、PBSを含有する6ウェルプレートに血栓を追い出します。 （ 図1B）をPBSで血栓3回洗浄します。
7. 気泡を避けながら慎重に30で生理食塩水を充填した1mlシリンジを使用して、洗浄し、血栓を描く1.5センチ長い血栓た15センチ長PE-10チューブ（ID 0.28 mm）での先端部分をロードしますチューブの近位端に挿入されるゲージの針。
8. 前大脳 - 4センチのPE-50チューブ（ID 0.58ミリメートル）で血栓ロードPE-10チューブを接続すると、中大脳動脈（MCA）に置かれる、テーパー状の端部（ID 200μm）を有するように修正しました塞栓性脳卒中のマウスモデル（ 図1C）で内頚動脈（ICA）の動脈（ACA）分岐領域。

2.血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルのモデリング（図2）

1. Anesthetiz以前に30％酸素（1.5 L /分）と混合し、3％イソフルランを使用して導入室^7に報告されているようにストロークするEA異なるマウス。手術後の痛みを和らげるために、メロキシカム（5ミリグラム/ kg）を皮下に注入します。筋肉の緊張を観察し、つま先のピンチの反射が存在しないことを確認することで、麻酔の十分な深さを確認してください。
2. 麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目に獣医の軟膏の少量を適用します。無菌技術および滅菌ガウン/マスク/手袋/楽器を使用して、次の外科的処置を実行します。中、および手術後、前に70％アルコールで手術領域を清掃し、消毒することにより無菌状態を維持します。
3. 手術台にマウスを移動します。腹臥位に滅菌ドレープで動物を置き、吸入マスクと2％イソフルランを用いて麻酔下でそれを維持します。その後、直腸温度計からのフィードバックを恒温ブランケットを使用して、36.5℃の体温をクランプします。
4. surgi後ベタジンおよび70％アルコールで準備をCAL、左耳と目の間の頭皮にメスを用いて、1センチメートル縦切開を行います。 （左1mmからブレグマから4以下mm）の露出したまま一時的な骨の表面にレーザードップラー流量計の光ファイバの先端部を接着。そして、ドップラーフローモニタリング（ 図2A）を起動します。
5. 動物を下にして置きます。ピンに接続文字列を使用して上の前歯を引っ張って首をまっすぐに伸ばし、首のエリアを剃ります。そして、それは広げ、3センチメートル垂直正中切開を行い、周囲の血管軟組織を切開することにより、左頸動脈球領域を露出させます。迷走神経を傷つけないように注意してください。
6. 滅菌6-0黒絹縫合糸を用いて、近位左総頚動脈（CCA）を連結し、左ICAおよび滅菌7-0黒絹縫合糸を使用して、左翼口蓋動脈（PPA）を連結します。
7. 左外頸動脈USIの枝である左の上甲状腺動脈を、焼灼ngの単極電気焼灼し、左の近位外頚動脈（ECA）緩く、しっかりと滅菌7-0黒絹縫合糸を使用して、より遠位部位を連結します。
8. マイクロはさみを使用して、ECAのライゲーション部位の間に小さな穴（約0.2〜0.25μmの直径）を作ります。
9. 近位ECAライゲーションを緩めながら、ECAの穴に血栓を含むカテーテルを挿入します。所定の位置にカテーテルを締め付けるために、CCAにカテーテルを進めた後、再び近位ECAライゲーションを締めます。
10. 遠位の連結部位の遠位にあるECA先端部を、カットする焼灼、およびCCAからカテーテルを引き抜くながら、ICAの方向に整列させる自由近位ECAを時計回りに回転させます。すぐにICAライゲーションを緩めた後、遠位ICAのACAの分岐部 - 次に、MCAに9ミリメートル程度のカテーテルを進めます。その後、ICAライゲーションを締めます。
11. 優しくによって分岐領域に血栓を置きます血栓を注入する注射器1ミリリットルを押します。血栓が正常容器（ 図2B）を閉塞した場合、ベースラインと比較して30％以下とすることによって低下されるべきであるドップラー脳血流量（CBF）の減少を確認してください。
12. カテーテルを外し、すぐにしっかりとECAの近位のサイトを連結。また、CCAおよびPPAをunligate。
13. 6-0絹縫合糸を用いて切開部位を閉じます。 （ここでは、血栓注入後30分）所要時間スパンでドップラーモニタリングを継続した後、麻酔を停止します。空のケージにマウスを返し、加熱ランプでそれを暖かく保ちます。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を獲得するまで、マウス無人のまま放置しないでください。

脳血栓のin vivoマイクロCTイメージング3.（図3）

1. 開始後、予め指定された時間点（ここでは、1時間）で、工程2.1に記載のように2％イソフルランでマウスを再麻酔脳動脈内の血栓の配置に起因する塞栓性脳卒中の。つま先ピンチ反射が存在しないことを確認することで、麻酔の十分な深さを確認してください。麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目に獣医の軟膏の少量を適用します。
2. 10 mMのPBS中に10mgのAu / mlの濃度でフィブリン標的金ナノ粒子（FIB-GC-AuNP ^4）に再懸濁し、ナノ粒子の溶解及び分散を確実にするために30分間血栓造影剤を超音波処理します。 300μlのFIB-GC-AuNP（10 mg / mlで）陰茎静脈に注入します。
3. マイクロCTマシンのベッドの上に動物を配置し、モーションアーチファクトを低減するために、ピンに接続されている文字列を使用して上の前歯を引いて、首をまっすぐに。
4. FIB-GC-AuNPの注射後5分で、脳のマイクロCT画像を取得し始めます。ここで説明する実験のために、次の撮像パラメータを使用：65のkVp、60μA、ビューの26.7 X 26.7 X 27.9ミリメートル³フィールドを、0.053のx 0.053のx 0.054ミリメートル³ボクセルサイズ、フレームあたり100ミリ秒、1平均、360ビュー、512×512の再構成マトリクス、600スライス、64秒スキャン時間。
5. 空のケージにマウスを返し、加熱ランプでそれを暖かく保ちます。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を獲得するまで、マウス無人のまま放置しないでください。
6. マイクロCTスキャナにインストールされたソフトウェア・パッケージの「 復興 」パネルの「 スタート 」コマンドを使用して、医学（DICOM）フォーマットでデジタル画像と通信に生画像データを変換します。
7. （ステップ6）画像の定量分析のために、製造業者の説明書に従って市販のソフトウェアパッケージを使用して、TIFF形式にDICOMデータを変換します。
8. 定性的には同様に、定量的には、より簡単で迅速な方法で分析するように分析のための新しいセットを生成するためのDICOM形式でソフトウェア・パッケージと元の0.054ミリメートルの厚さの画像を使用します次のように、1または2ミリ（ここでは2 mm）の厚さを有するようにレンダリングされた軸方向及びコロナル像。
   1. 「 データソース 」ツリーにDICOMフォルダを選択し、マウスの右ボタンをクリックして、「MasterDB 'または' PrivateDB」にフォルダをインポートします。
   2. 「データソース」ツリー内の「MasterDB 'または' PrivateDB」をクリックして、インポートされたフォルダを選択します。 「読み込み中のオプション]ウィンドウがポップアップしたときに一番左のパネルに「3D」タブをクリックした後、押して「OK」は 、スタックのようにフォルダ内の画像のシーケンスをインポートします。
   3. 軸方向およびコロナル画像ウィンドウ内の単語「MRP」をクリックし、ポップアップメニューの「MIP」を選択することで、最大値投影（MIP）形式に画像表現を変更します。同じウィンドウで：次に、「0 [mm]でTH」をクリックした後に2ミリメートルに画像の厚さを変更します。
   4. NAを2mmの幅3Dを使用して画像スタックを探索し、適切な角度と位置でそれをスライスすることが可能vigatorバーは、血栓を保有ウィリス（COW）の円を完全にカバーして厚さ2mmの軸方向の断面像を準備します。 「 出力 」パネルのキャプチャボタン（カメラアイコン）をクリックします。 TIFF形式の画像を保存します。
9. その後、小脳に前頭葉から連続的にカバーする5 2mm厚の冠状断面の画像を用意。
   1. ACAの血栓 - まず、コロナル画像は最高のMCAを視覚化することができるように慎重にアキシャル画像上のナビゲーションバーを整列させることにより、第2のスライスを準備します。
   2. 次に、連続的な方法で、他の4つのスライスを準備します。 「 出力 」パネルのキャプチャボタン（カメラアイコン）をクリックします。 TIFF形式で画像を保存します。

4.血栓溶解や脳血栓のin vivoマイクロCTイメージングでは （図3）

1. 100センチメートル長いPE-1を準備します一方の端に30ゲージの針ともう一方の端に1mlシリンジ0チューブ。気泡を回避しながら、生理食塩水（600μL）またはtPAの（ここでは、24ミリグラム/キログラム、600μL）のいずれかでチューブを埋めます。
2. ステップ2.1で説明したように、マウスを再度麻酔。動物の陰茎静脈内針の先端を挿入します。マイクロCT機のベッドの上に慎重に動物を置きます。その後、ベッドにそれをテーピングすることにより、カテーテルシステムの静脈内注射の部分を固定化し、安定させます。
3. 治療前のベースラインとしてのフォローアップイメージングセッションを行います。その後、カテーテルシステムにシリンジプランジャーを押し下げることによって60μlの通常の生理食塩水またはtPAのいずれかを注入します。ボーラス注射の後、時間（ここでは、30分）かけて残りの溶液（540μl）を注入し始めます。
4. 予め指定された時点で、ステップ3.4の場合と同じパラメータを使用してマイクロCT画像を得る：ここで、ボーラス注射後の3および24時間で。次のex vivoで NIRF thromを実行するには脳のバスイメージングは​​、頸椎脱臼により麻酔下で動物を安楽死させます。

5. 生体外 NIRF血栓イメージングと脳組織のトリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色（図4）

1. 断頭後、頭皮を削除し、最大矢状縫合に向けて大後頭孔からハサミで頭蓋骨を切断。このようにして半球を産ん敷設、慎重に基礎となる脳に損傷を回避しながらハサミを使用して切開頭蓋骨の縁を上昇させることにより頭蓋を削除します。
2. 彼らはNIRFイメージングで可視化されるべきであるウィリス動脈の円と重なる可能性があるため、脳表面にできるだけ近い脳ベースで視神経を切り取ります。そして、明らかにNIRF血栓イメージングのためにY字型」MCA / ACA /遠位ICA」を可視化するためにそっと目を公開する小脳ベースを圧縮した後、可能な限り脳表面に対して遠位ICASを切り出します電子切断点（ 図4A）。
3. NIRFイメージング（励起/発光675 / 690nmで、1秒露出）を実行し、そのベースがCOWの動脈に蛍光標識された血栓塞栓を可視化する（ 図4B、C）を 、上向きと削除脳組織のを（ 図4D） 。その後、皮質血栓塞栓を可視化上向き脳の頂点に追加撮影を行います。組織に生理食塩水を数滴入れて脳の乾燥を避けてください。
4. 製造元の指示に従って脳マトリックスデバイスを使用して、すぐに冠状に2mm厚の脳スライスを準備：2ミリメートルの厚さにスライス（ブレグマから2.3、0.3、-1.7、-3.7、-5.7ミリメートル）の6個を。生理食塩水を点眼使用して脳切片の乾燥を避け、およびセクションの前面と背面の両方のNIRFイメージングを行います。
5. ガーゼへの暴露を回避しながら、20分間、2％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）溶液に脳切片を置きますトン。光への暴露を回避しながら、4℃で4％のホルムアルデヒド溶液にスライスを移動します。

マイクロCT画像とImageJの（1.49d）ソフトウェアを使用した6.定量血栓エリア（図5）

1. オープン画像（ 図5A）。
   1. 開いている画像シーケンスファイルは、「 ファイル>インポート>イメージシーケンス 」または「 ファイル>開く」を選択することで、スタックファイルを作成します。画像は「 イメージ>タイプ> 8ビット 'を使用して、8ビットグレースケールに変換します。
2. インチからミリへの単位を変換する（ 図5A）。
   1. CT画像ファイルの1画素が0.053ミリメートルに対応する場合、使用入力する'>設定スケールを分析' '1'、 '0.053'、および' ピクセル単位の距離 」の「ミリメートル」、「 既知の距離 」、および長さの 「 単位を '、それぞれ。
   2. とき（のみ）スケールバーが利用可能です、「直線」ツールを使用すると、スケールバーと同等の、その長さの線を引きます。そして、ミリメートルでスケールバーの長さを入力する'>設定スケールを分析 'を使用します。
3. 背景差分（ 図5B）
   1. 使用することにより血栓または骨関連hyperdense領域なしで脳実質の領域に関心の円形または矩形領域（ROI）の場所を「 編集>選択>を指定してください」。指定されたROIは、スタックのすべてのスライスに適用されるので、それは各スライスでhyperdense領域と重なっていない場合かどうかを確認してください。
   2. 「プラグイン> ROI> ROIからのBGの減算」を選択し、「平均値からの標準偏差の数」のため2.0と入力します。
4. 血栓塞栓関連Hyperdense病変のセグメンテーション（ 図5C）
   1. '>しきい値イメージ>調整」を選択し、とLo'の値を入力します。WERの閾値レベル 'と'は、それぞれ22および255、などの上限スレッショルド・レベル」。緑の上側閾値を超えるグレースケールで青、閾値処理をピクセル単位で下限しきい値以下のピクセル、およびピクセルを表示するには、「オーバー/下」を選択します。
   2. 骨領域を含むことなく、血栓塞栓関連hyperdense病変を囲むのROIを描画する「フリーハンド選択ツール」を使用してください。描画時には、追加またはそれぞれ、領域を除去するために、[SHIFT]または[ALT]のいずれかを押し続けます。
      注：hyperdense血栓塞栓症の病変ではなく、「フリーハンド選択ツール」で、骨構造から離れている場合は、「ワンドツールは、「安全に」許容」レベルを変更することなく使用することができます。
5. セグメント化された病変の定量化（ 図5D）
   1. 選択する「エリア''>の設定測定を分析'を使用し 、「平均グレー値」、および「統合密度（エリアXの平均）9 ;. 「しきい値の制限」と「表示ラベル」：次のオプションを確認してください。定量化されたデータを取得するために'>メジャーを分析'を使用します。そして、「.XLS」ファイルとして結果を保存します。
   2. TIFF形式のスタックファイルを保存します。また、関心領域を保存するには、「 分析>ツール> ROIマネージャ」を使用します。

結果

遠位内頸動脈（ 図6のACAの分岐部-塞栓性脳卒中後1時間でFIB-GC-AuNP（10 mg / mlで、300μl）を投与した後、in vivoで得られたベースラインマイクロCT画像は、明らかにMCAに脳血栓を可視化）。フォローアップマイクロCTイメージングは​​、生理食塩水処理した牛の血栓の変化を示しませんでした。しかし、tPAを用いた治療は、COWの血栓（ 図6?...

ディスカッション

我々は、塞栓性脳卒中の実験モデルにおいて直接血栓イメージングのための2つの相補的な分子イメージング技術の使用を実証：in vivoでのマイクロCTベースの撮像のためのフィブリン標的金ナノ粒子（FIB-GC-AuNP）を、および活性化XIII因子は、 元のための光学イメージングプローブを標的蛍光イメージングを生体内 。

FIB-GC-AuNPsの静脈内投与後、血栓は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
NIRF imaging system	Roper-scientific,Tucson, AZ	coolsnap-Ez
Laser Doppler flowmeter	Perimed, Stockholm, Sweden	PeriFlux System 5000
Surgical microscope	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
Inhalation anesthesia machine	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
Software
NFR control	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT control software
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3D render imaging software
Lab chart 7	ADInstruments, Colorado, USA	Lab chart 7	rCBF
ImageJ software	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	imaging analysis
Devices/Instruments
Infusion pump	Harvard, Massachusetts, USA	pump 22(55-2226)
Homeothermic blanket	Panlab, Barcelona, Spain	HB101
Pocket cautery	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
Brain matrice	Ted pella, CA, USA	15003	coronal section
PE-50 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm
30 gauge needle	sungshim-medical, Seoul, Korea
Syringe	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
Gauze	Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
Micro forceps	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	11253-27	Dumont #L5
Micro scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	14084-08	8.5 cm
Black silk suture	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 and 7-0
Reagents
meloxicam	Yuhan, Seoul, Korea
vet ointment	Novartis, Basel, Swiss
10% Povidone-iodine (betadine)	Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3	Sigma, Missouri, United States	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Isoflurane	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 ml
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 ml
Gold nanoparticles			Synthesis
C15 optical agent			Synthesis
Tissue plasminogen activator	Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany	rtPA(actilyse)	20 mg
Normal saline	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 ml