ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

要約

私たちは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalシステムを使用して長期間のためのin vitroプロトコルへの共培養腸microbiomeと腸絨毛を説明します。

要約

ここでは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalデバイスにおけるマイクロ加工腸絨毛を有する多種のヒト腸microbiomeの長期共培養を行うためのプロトコルを記述します。私たちは、生理的機械的変形と流体せん断流れは絶えず蠕動運動を模倣するために適用されるマイクロ流体デバイス、内腸管腔毛細血管組織界面を再現します。ルーメンマイクロチャネルにおいて、ヒト腸上皮のCaco-2細胞は、「無菌」絨毛上皮を形成し、小腸絨毛を再生する培養されます。前培養した微生物細胞は、宿主微生物の生態系を確立するために、ルーメン側に接種します。微生物細胞は、絨毛の先端面に付着した後、流体の流れ及び機械的変形は、新鮮な培養培地を常時供給して未結合細菌（ならびに細菌性廃棄物）である定常状態の微小環境を生成するために再開される連続的に除去されます。拡張された共培養Fの後ROM日週に、複数の微小コロニーを無作為に絨毛の間に位置することが見出されており、両方の微生物および上皮細胞は、培養中で少なくとも1週間生存し、機能しています。私たちの共培養プロトコルは、健康と病気を組織内の人間microbiomeの役割のin vitroでの研究に容易にすることができる様々なヒトの臓器、中に見出すことができる他のホストmicrobiome生態系のための汎用プラットフォームを提供するように適合させることができます。

概要

ヒトの腸は、微生物種の驚くほど多様な配列（<千種）と驚異的な微生物細胞の数（ヒト宿主細胞よりも10倍以上）と遺伝子（ヒトゲノムよりも100倍以上）の^1を保有します。これらのヒトmicrobiomesは、栄養素および生体異物を代謝免疫応答を調節し、腸のホメオスタシス^2を維持^する上で重要な役割を果たしています。驚くべきことではないが、これらの多様な機能を考えると、共生腸microbiomeは広く健康と病気^3を変調^します 。したがって、腸のmicrobiomeとホスト微生物の相互作用の役割を理解することは、胃腸（GI）の健康を促進し、腸の障害⁴のための新しい治療法を探求するために非常に重要です。しかし、 インビトロでの腸モデル（ 例えば、静置培養） 中に存在するのは時間の短い期間（<1日）微生物細胞が過剰に増殖し、腸の障壁を損なうためにホストmicrobiome共培養を制限します機能^5。植民地と人間の腸microbiomeの安定維持が困難であるため、代理動物モデル（ 例えば、無菌⁶または遺伝子操作マウス^7）はまた、一般的にホスト腸microbiomeのクロストークを研究するために使用されていません。

これらの課題を克服するために、我々は最近、生きているヒトの腸^5,8で発生したホスト腸microbiome相互作用をエミュレートする「ガット・オン・チップ」microphysiologicalシステム（左図1A）バイオミメティック人間を開発しました。腸オンチップマイクロデバイスは、柔軟な、多孔質、細胞外マトリックス（ECM）は、ヒトの腸上皮のCaco-2細胞が並んでコーティングされた膜、腸管腔毛細血管組織界面（ 図1Aを模倣することによって分離された2つの並列マイクロ流体チャネルが含まれています、右^）9。真空駆動型の環状リズミカルな変形は通常induc変更を模倣する生理学的な機械的変形を誘発します（右図1A）蠕動運動によって編。興味深いことに、のCaco-2細胞は、100以上の時間のための腸オンチップで栽培されたとき、彼らは自然にタイトジャンクショ​​ン、頂端ブラシの境界線、基底陰窩に限定増殖性細胞と3次元（3D）腸絨毛を形成し、粘液産生は、薬物代謝活性（ 例えば、シトクロムP450 3A4、CYP3A4）、および強化されたグルコースの再取り込み^8を増加^させ^ました 。この「無菌」微小環境では、プロバイオティクスラクトバチルス・ラムノサス GGまたは2週間まで^5,10のための宿主上皮細胞とプロバイオティクス細菌の混合物の治療上の形成がする共培養が可能でした。

本研究では、長期間腸オンチップデバイスでホスト腸microbiome共培養を実行するための詳細なプロトコルを記述します。加えて、我々はこのホスト-microbiome共培養Pの広範なアプリケーションのために考慮すべき重要な問題と潜在的な課題を議論しますrotocol。

プロトコル

ガット・オン・チップデバイスの1微細加工

注：ガット・オン・チップは、透明、ガス透過性シリコーンポリマー（ポリジ​​メチルシロキサン、PDMS）製のマイクロ流体デバイスである、二つの平行なマイクロチャネルを含む（1ミリメートル幅×150μmの高さ×1センチ長さ）柔軟で区切ら多孔性（細孔径が10μm、気孔する細孔間隔で25ミクロン）PDMS膜^5,9。提供の手順以下の腸・オン・チップ（左図1A）を製造します。

1. ガット・オン・チップ^5,9の微細加工手順。
   1. PDMSプレポリマーと硬化剤と混合することにより、未硬化、脱気したPDMSを準備します（15：w / wの1）を、30分間真空デシケーターに入れてください。
   2. 30グラムと未硬化の3グラムを注ぎ、SU-8、上部のベースマイクロパターンおよび腸・オン・チップ、それぞれの低いマイクロチャネルを持つ各シリコン型にPDMSを脱気しました。次にlのドライオーブン中で60℃で硬化東4時間。
   3. 外科用メスを用いてエッジの周りに切断することにより、各シリコン鋳型から上下のPDMS層をデモールド。生検パンチャー（穴の直径2.0ミリメートル）を使用して、6穴（2つの入口、二つの出口、および2つの真空チャンバー）をパンチ。
   4. 未硬化の10グラムを注ぐことにより、多孔質膜を準備し、円形の柱と柱の配列を含むシラン化シリコンウェハ上にPDMSを脱気（直径が10μm、高さ25μmの）フラットで重ね、PDMS支持層（15シラン化：ワット1を、 /ワット;厚さ1cm）。セットアップに3キロの重量押えを置き、12時間以上60℃でポリマーを硬化させます。
   5. 慎重にウエハからスラブの隅を持ち上げて、シリコンウエハからPDMS支持スラブに付着した多孔質PDMS膜のセットアップを脱型し、多孔質PDMS膜が完全にウェハから切り離されるまで剥離。
   6. PLに多孔質膜側：上位層（1、w / wのPDMS、15）のチャネル側を公開asmaがそれぞれ1分、3秒、のために携帯型コロナ処理機によって生成されます。
   7. 気泡なしで並列に各ピースを配置することによって多孔質PDMS膜と共形接触の上位マイクロチャネル層のプラズマ処理表面を置きます。
   8. 2 PDMS層の不可逆的な結合のために80℃のCO / Nで全体のセットアップをインキュベートします。
   9. 慎重支持層の隅を持ち上げて、支持層が完全に膜と上層から取り外されるまで剥離することにより、多孔質膜と上層のアセンブリからPDMS支持層をはがし。
   10. 中空真空チャンバを作るために、微細先端ピンセットを用いて真空チャンバ（メインチャンネルのいずれかの側に位置する2つの室）の上に配置この膜の部分を切り取り。
   11. 私が説明したように、トップピースと同じように、プラズマに下片に刻まれたチャンネルの側に取り付けられた膜と側面を公開nは1分間1.1.6ステップ。
   12. ステレオスコープの下で気泡なしで並列に各ピースを配置することにより、共形接触を有する多孔質膜を有する上部マイクロチャネル層と下層を合わせます。
   13. マイクロ流体セルチャネルの横に2つの中空の真空チャンバを含む完全なスケール腸オンチップマイクロ流体デバイスを製造するために80℃のCO / Nで乾燥オーブンで全体のセットアップを治します。
2. 90°曲がったステンレス鋼の平滑末端針を介して腸オンチップで下限またはマイクロチャンネルにリンクされている各ポートの入口と出口にチューブを接続します。
3. 90°曲がったステンレス鋼平滑末端針を用いて真空チャンバに連結された穴にチューブを接続します。
4. 使い捨て注射器を滅菌を1ml用いて70％（v / v）エタノールを流すことによってマイクロチャネルおよびチューブを滅菌します。
5. 60℃のドライオーブンO / Nでのマイクロチャネルおよびチューブを乾かします。

マイクロエンジンの2.成長ガット・オン・チップデバイスでered腸絨毛

1. ガット・オン・チップマイクロデバイスの^5,9上にシード腸上皮細胞（ 例えばのCaco-2BBE）。
   1. 前の表面活性化を60℃の乾燥オーブンO / N（ステップ1.5参照）で乾燥した1 mlの滅菌使い捨て注射器を使用して（ステップ1.4参照）、70％（v / v）エタノールを用いて装置を滅菌します。
   2. 腸オンチップマイクロシステムの完全なセットアップを公開（ すなわち、本体腸オンチップチューブに接続されている）を同時に40分間UV光（波長253.7nm）及びオゾンへ。
   3. 安全キャビネット（BSC）にUV光の下で15分間、RTでデバイスをクールダウン。
   4. 使い捨てを使用して、上下のマイクロチャネルの両方に - 私はコラーゲンを50μg/ mlのタイプ、無血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に希釈した300 / mlの細胞外マトリックス混合物の混合溶液 - ECMコーティングの100μLを紹介滅菌1mlシリンジ。
   5. Incuba37°Cで全体のセットアップTE 1時間、5％CO ₂インキュベーターを加湿。
   6. ドガ予め温めた（37℃）の完全培地（DMEM、20％v / vウシ胎児血清（FBS）、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシンを50ml、3mlに等分1分間BSCで50mLのろ過装置（孔径0.45μm）を用いて、使い捨て注射器）。
      1. ろ過システムを介して予め温めた培地をパスし、培地中の気泡や溶存ガスを除去するために、1分間のろ過媒体に軽くタップします。
   7. 3ミリリットル使い捨て注射器に脱気した完全培地のアリコートを置き、37℃でインキュベート1時間、5％CO ₂インキュベーターを加湿。
   8. 2 3ミリリットルを上下のマイクロチャネルに脱気し、予め温めておいた完全培養培地を含む使い捨て注射器を接続します。
   9. 容積で、シリンジポンプを使用して、上部マイクロチャネルに脱気し、完全な細胞培養液を流します37°Cで（0.02ダイン/ cm ²での剪断応力に相当）を30μl/ hrの流量は、5％CO ₂インキュベータO / Nを加湿しました。
2. ガット・オン・チップにおけるマイクロ加工のCaco-2絨毛の形成。
   1. 50と65の間の通路番号でのCaco-2BBE細胞を使用してください。
   2. 37°Cで完全培養培地を含むT75フラスコ中で成長したCaco-2細胞は、完全にコンフルエントな細胞を得るために4-5日間、5％CO ₂インキュベーターを加湿しました。
   3. 完全にT75フラスコ中で増殖させたコンフルエントたCaco-2細胞は、その後、細胞を洗浄PBSを吸引するためにPBSフリー^{2+ の} Ca ²⁺およびMgの10ミリリットルを追加します。二回、この手順を繰り返します。
   4. 37°Cで0.05％トリプシン/ EDTA溶液1mlを加え、インキュベートを5分間、5％CO ₂インキュベーターを加湿しました。
   5. ピペッティングによって、および3〜5回上下（FBS付き）予め温めておいた完全な細胞培養培地10ミリリットルで解離した細胞を再懸濁します。
   6. cで細胞懸濁液をスピンダウン5分間、500×gでentrifugation、その後、上清を除去します。
   7. デバイスで〜1.5×10 ⁵細胞/ cm ²で細胞密度を調整するために、再び1ミリリットルで予め温めておいた再懸濁完全培地。細胞密度を推定するために、血球計数器を使用してください。
   8. 上部のマイクロチャネルに接続されたチューブの出口に25 G5 / 8針に取り付けられた1ミリリットルの使い捨て注射器を配置することにより、上部マイクロチャネル（管腔側）に再懸濁させたCaco-2細胞100μlを注入。
   9. バインダークリップを使用して、上下のマイクロチャネルに接続されたチューブのすべての入口と出口をクランプ。
   10. 1時間37℃で、加湿した5％CO ₂インキュベーターで全設定をインキュベートし、多孔質膜の表面に付着したCaco-2細胞を解離可能にします。
   11. クランプを外し、細胞は24-36時間、無傷の単層を形成するまで、シリンジポンプを用いて30μlの/ hrでのみ上位マイクロチャネルに培養液の流れを再開します。位相コントラを使用します細胞単層において細胞間結合を確認するため、Tまたは微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡。
   12. 細胞は単層を形成する場合、30μL/時の同じ流速で両方の上部（ルーメン）と下部（毛細管）マイクロチャネルに培地を灌流。
   13. 蠕動運動のような動き^5,9を模倣^する機械的変形の応用。
       1. テンション装置を搭載した真空ポンプの電源を入れます。
       2. ステンレス製のコネクタとチューブを介して真空コントローラに真空チャンバーを接続します。
       3. 真空制御ソフトウェア上の巡回正弦関数モードで0.15ヘルツの周波数で10％、平均細胞株の伸縮運動を設定し、「スタート」をクリックします。
   14. 〜100時間のための機械的変形の下でコンフルエントのCaco-2単層に上下マイクロチャネルにおける培地の一定流量（30μL/時）（10％、0.15 Hz）を維持します。
       注：たCaco-2細胞はSPONtaneously上皮マイクロチャネル^5,8-10の内腔に向かって延長起伏3Dの突起と絨毛の形態形成を受けます。
3. 記載されているように腸オンチップ¹⁰におけるルーメン毛細血管組織界面で生きている人間の腸の器官レベルの機能をエミュレートするには、手順に従ってください。
   1. 2.1から2.2までの手順を繰り返して、マイクロ加工のCaco-2絨毛を成長させます。
   2. 予熱した共培養培地フロー（完全なCaco-2細胞培養培地と完全HMVECを培地の混合物、1：1 v / v）を30μL/時間で上下マイクロチャネルへ。
   3. 解離した正常なヒト毛細血管の微小血管内皮細胞の100μlの紹介（HMVECを、最終細胞密度を、〜5.0×10 ⁵細胞/ cm ^2）2.2.3から2.2.9までの手順で説明する同一の方法により、低いマイクロチャネルへ。
   4. 硬化した長方形のPDMSピースを置きます（0.5センチメートルのx 1センチメートルのx 1センチメートル;幅×長さ×高さ; 15：1、ワット/ワットエラストマー：硬化剤））腸オンチップデバイスの上に、その後、逆さま全体のデバイスのセットアップを反転（ すなわち、上側のマイクロチャネルは、マイナス面に面しており、下側のマイクロチャネルは、上方に向いています。
   5. 解離したHMVECをが低いマイクロチャンネル内での多孔質膜の表面に付着することを可能にするために1時間、37℃、加湿5％CO ₂インキュベーターでセットアップをインキュベートします。
   6. CO ₂インキュベーターから全体のセットアップを取り出し、再び上でセットアップを反転させます。
   7. 予熱共培養培地フロー（完全なCaco-2細胞培養培地と完全HMVECを培地の混合物、1：1 v / v）の機械的伸張運動と30μL/時間（時上側と下側のマイクロチャネルの両方に10％、0.15 Hz）で内皮単層の細胞間接合を形成するために、少なくとも3日間。

ガット・オン・チップマイクロデバイス3.ホスト腸Microbiome共培養

1. 前培養Oを実行F細菌細胞をマイクロ加工腸絨毛上に同時培養共生腸microbiomeを次のように。
   1. オートクレーブラクトバチルスMRSブロス及び強化クロストリジウム培地（v / v、1：1）混合液10mlに凍結乾燥されたプロバイオティクス細菌の粉末混合物を再懸濁します。
   2. 10 mlの使い捨ての滅菌チューブにアリコートその後、菌体懸濁液を3mlの培地を適量添加することにより（600nmで）約0.2の光学密度単位の最終細胞密度を調整します。
   3. 嫌気性容器中に再懸濁させた微生物細胞を含む場所チューブ。コンテナ内の嫌気性ガス発生サシェの2つのパックを追加します。しっかりと容器の蓋を閉め、37℃で振盪せずにコンテナの設定をインキュベート、5％CO ₂インキュベーターO / Nを加湿。
2. 腸上皮細胞^5,10とMicrobiomeとの共培養の接種。
   1. 脱気antibiotiを含む3ミリリットル使い捨て注射器を準備しますC無細胞培養培地（ すなわち、20％FBSを含むDMEM）。培養液の脱気手順については2.1.6を参照してください。
   2. バイオセーフティキャビネットに移動した後、CO ₂インキュベーターからマイクロ加工絨毛を含む腸オンチップデバイスの全体的なセットアップを行ってください。
   3. 上下のマイクロチャンネルにリンクされているチューブに接続された注射器を取り外します。その後、前microbiomeの播種に12時間、この抗生物質を含まない培地を流れ、CO ₂インキュベーターに戻す、デバイスに3.2.1で調製した注射器を接続します。
   4. 5分間万×gで（3.1の手順を参照してください）​​前培養したプロバイオティクス細菌の混合細胞をスピンダウン。真空を用いて上清て吸引し、次いで（〜、最終細胞密度1.0×10 ⁷ CFU / ml）を、抗生物質を含まないDMEM培地中に再懸濁します。
   5. 25に取り付けられた1ミリリットル使い捨て注射器を使用して、「無菌」腸絨毛を含むマイクロチャネルの内腔側に細胞懸濁液を注入G5 / 8針。すべてのチューブ端にクランプすることにより、流れずに〜1.5時間腸絨毛の頂端表面に微生物細胞の接着を可能にします。
   6. 巡回リズミカルな変形（10％、0.15ヘルツ）と40μlの/時間で、上下のマイクロチャネルの両方に予熱した抗生物質を含まない培地を灌流。
   7. 緑色蛍光タンパク質（GFP）の共培養のためにEを標識大腸菌 （GFP 大腸菌 ;非病原性DH5アルファ大腸菌宿主）マイクロ加工絨毛と^10,11細胞、プレ育成GFP E. 12時間の条件（200 rpm）し振とうしながら37℃でオートクレーブしたLB培地中の大腸菌細胞。 GFP Eの共培養を行うために3.2.5から3.2.6への手順を繰り返しますマイクロ加工絨毛とcoli細胞。
3. 画像セル^5,8-10
   1. DIC、エピ蛍光、または微生物と上皮形態の^5,8,10を記録するためのレーザー走査型共焦点顕微鏡を実行します。
      1. DICイメージングのために、CO ₂インキュベーターから腸オンチップマイクロシステムのセットアップを取り出し、その後、細胞形態を記録し、顕微鏡のステージ上でのデバイスのセットアップを配置します。
      2. 絨毛上皮の蛍光イメージングのために、10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
         1. 15分間、4％（w / v）のパラホルムアルデヒドで絨毛を修正しました。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
         2. 0.3％と絨毛を透過（v / v）のトリトンX-100で10分間、2％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSで希釈しました。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
         3. 1時間PBS中の2％のブロック細胞（w / v）のBSA溶液。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。
         4. 4の300 nMの「光保護下で核染色のためにPBSで希釈し、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸（DAPI）溶液を加えます。
         5. 蛍光ファロイジンの25単位/ mlを追加します。光の保護の下でF-アクチン染色にPBSに溶解（ファロイジン-CF647複合体）です。
         6. レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蛍光染色した細胞の記録画像。
            注：25Xの目的は、共焦点顕微鏡の間に適切な光学ズームで塗布しました。 図3Bにおいて、約525Xの倍率を使用しました。

結果

in vitroでのヒトの腸ホストmicrobiomeのエコシステムをエミュレートするために、それはあります このような蠕動運動のような力学や流体の流れのような生理的条件下で腸内細菌とヒト腸上皮細胞の安定した長期の共培養を再構成するための実験プロトコルを開発するために必要。ここでは、生体模倣腸オンチップマイクロデバイスを利用します （...

ディスカッション

ホストmicrobiomeの相互作用を理解することは、医療を進めるために重要です。微生物細胞は、主にin vitroで哺乳動物細胞を過増殖しているためしかし、プラスチック皿または静的ウェルプレートで行われる伝統的な細胞培養モデルは、以上1-2日のために生き腸内微生物とヒト腸細胞の安定な共培養をサポートしていません。過剰成長微生物集団は急速に続いて深刻な腸のバリア機能を損?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES	Gibco	10564-011	Warm it up at 37 °C in a water bath.
Difco Lactobacilli MRS broth	BD	288120	Run autoclave at 121 °C for 15 min.
Poly(dimethylsiloxane)	Dow Corning	3097358-1004	15:1 (w/w), PDMS : cureing agent
Caco-2BBE human colorectal carcinoma line	Harvard Digestive Disease Center		Human colorectal adenocarcinoma
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	20% (v/v) in DMEM
Penicillin-streptomycin-glutamine	Gibco	10378-016	1/100 dilution in DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Molecular Probes	D1306	Nuclei staining
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml)	Biotium	00041	F-actin staining
Flexcell FX-5000 tension system	Flexcell International Corporation	FX5K	Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency)
Inverted epifluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	Imaging, DIC
Scanning confocal microscope	Leica	DMI6000	Imaging, Fluorescence
UVO Cleaner	Jelight Company Inc	342	Surface activation of the gut-chip
Type I collagen	Gibco	A10483-01	Extracellular matrix component for cell culture into the chip
Matrigel	BD	354234	Extracellular matrix component for cell culture into the chip
1 ml disposable syringe	BD	309628	Cell and media injection stuff
25 G 5/8 needle	BD	329651	Cell and media injection stuff
Syringe pump	Braintree Scientific Inc.	BS-8000	Injection equipment into the chip
VSL#3	Sigma-Tau Pharmaceuticals	7-45749-01782-6	A formulation of 8 different commensal gut microbes
Reinforced Clostridial Medium	BD	218081	Anaerobic bacteria culture medium
GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator	BD	260001	Anaerobic gas generating sachet
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-4-100	Fixing the cells for staining
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilizing the cells
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030	Blocking agent for staining of the cells
Corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC	Plasma generator for fabrication of the chip
Steriflip	Millipore	SE1M003M00	Degasing the complete culture medium
Disposable hemocytometer	iNCYTO	DHC-N01	For manual cell counting