Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

Riepilogo

Descriviamo un protocollo in vitro di co-coltura budello microbiome e villi intestinali per un periodo prolungato utilizzando un sistema umano intestino-on-a-chip microphysiological.

Abstract

Qui, descriviamo un protocollo per eseguire a lungo termine co-coltura di multi-specie intestino microbioma umano con villi intestinali microengineered in un dispositivo umano gut-on-a-chip microphysiological. Noi ricapitolare i intestinale interfaccia di tessuto lume-capillare in un dispositivo di microfluidica, dove deformazioni meccaniche fisiologiche e flusso di taglio fluido sono costantemente applicati per imitare la peristalsi. Nel microcanali lume, epiteliali intestinali Caco-2 cellule umane sono coltivate in modo da formare un epitelio villi 'germ-free' e rigenerare piccoli villi intestinali. cellule microbiche pre-coltivate vengono inoculati nel lato lume di stabilire un ecosistema host-microbo. Dopo che le cellule microbiche aderiscono alla superficie apicale dei villi, flusso di fluido e deformazioni meccaniche sono ripresi per produrre un microambiente stato stazionario in cui terreno fresco viene costantemente alimentato e batteri non legato (nonché scarti batteriche) sono continuamente rimossi. Dopo estesa co-coltura fgiorni o settimane rom, più microcolonie sono trovati per essere collocata in modo casuale tra i villi, ed entrambi microbica e cellule epiteliali rimangono vitali e funzionale per almeno una settimana in coltura. Il nostro protocollo co-coltura può essere adattato a fornire una piattaforma versatile per altri ecosistemi ospitanti-microbiome che si possono trovare in vari organi umani, che potrebbe agevolare studio in vitro del ruolo del microbioma umano nell'orchestrare la salute e la malattia.

Introduzione

L'intestino umano ospita una gamma incredibilmente diversificata di specie microbiche (<1.000 specie) e un numero enorme di cellule microbiche (10 volte di più rispetto alle cellule ospiti umane) e geni (100 volte più del genoma umano) ^1. Questi microbiomes umane giocano un ruolo chiave nel metabolismo di sostanze nutritive e xenobiotici, che regola le risposte immunitarie, e mantenere l'omeostasi intestinale ^2. Non sorprende che, date queste diverse funzioni, l'intestino microbiome commensale modula ampiamente salute e la malattia ^3. Così, la comprensione del ruolo del budello microbioma e host-microbo interazioni sono di grande importanza per promuovere gastrointestinale (GI) di salute e di esplorare nuove terapie per i disturbi intestinali ^4. Tuttavia, esistenti in modelli intestinali in vitro (ad esempio, le culture statiche) limita host-microbiome co-coltura per un breve periodo di tempo (<1 giorno) perché le cellule microbiche invadere e compromettono barriera intestinaleFunzione ^5. Modelli animali surrogati (ad esempio, di germi free ⁶ o tecniche di ingegneria genetica topi ⁷⁾ sono, inoltre, non comunemente utilizzati per lo studio ospite-gut microbiome crosstalk perché la colonizzazione e il mantenimento stabile di microbioma intestinale umana sono difficili.

Per superare queste difficoltà, abbiamo recentemente sviluppato un essere umano biomimetico "Gut-on-a-Chip" sistema microphysiological (Figura 1A, a sinistra) per emulare le interazioni ospite-microbioma intestinale che si verificano nel vivere intestino umano ^5,8. Il Microdevice gut-on-a-chip contiene due canali microfluidica parallele separate da un flessibile, porosa, matrice extracellulare (ECM) membrana Rivestiti fiancheggiata da epiteliali intestinali umane cellule Caco-2, imitando il intestinale lume-capillari interfaccia tessuto (Figura 1A , a destra) ^9. ciclici deformazioni ritmiche sotto vuoto spinto inducono deformazioni meccaniche fisiologiche che simulano i cambiamenti normalmente Induccati da peristalsi (Figura 1A, a destra). È interessante notare che, quando cellule Caco-2 sono coltivate nell'intestino-on-a-chip per più di 100 ore, hanno spontaneamente forma tridimensionale (3D) villi intestinali con giunzioni strette, bordi pennello apicali, le cellule proliferative limitate a cripte basali, produzione di muco, una maggiore attività metabolizzare farmaci (ad esempio, citocromo P450 3A4, CYP3A4), e una maggiore glucosio ricaptazione ^8. In questo microambiente 'privo di germi', è stato possibile co-cultura probiotico Lactobacillus GG rhamnosus o una formazione terapeutica di una miscela batterico probiotico con cellule epiteliali ospitante per due settimane ^5,10.

In questo studio, descriviamo il protocollo dettagliato per eseguire host-intestino microbiome co-coltura nel dispositivo gut-on-a-chip per un periodo prolungato. In aggiunta, discutiamo criticità e sfide potenziali da considerare per una vasta applicazione di questo host-microbiome co-coltura pROTOCOLLO.

Protocollo

1. Microfabbricazione di un dispositivo Gut-on-a-chip

Nota: L'intestino-on-a-chip è un dispositivo microfluidico fatta da, polimero siliconico gas-permeabile trasparente (polidimetilsilossano, PDMS), contenente due microcanali paralleli (1 mm larghezza lunghezza x 150 micron di altezza x 1 cm) separati da un flessibile poroso (10 micron di diametro dei pori, 25 micron di pori spaziatura a pori) PDMS membrana ^5,9. Realizzare il (Figura 1A, a sinistra) gut-on-a-chip seguendo le istruzioni fornite.

1. Microfabbricazione interno del ^5,9 Gut-on-a-chip.
   1. Preparare non essiccate, PDMS degassati miscelando il prepolimero PDMS e il catalizzatore (15: 1 w / w), e posizionarlo in un essiccatore a vuoto per 30 minuti.
   2. Versare 30 ge 3 g di TDS, PDMS degassati su ogni stampo in silicone che ha SU-8 microdisegni base della tomaia e microcanali inferiori dell'intestino-on-a-chip, rispettivamente. Poi polimerizzare a 60 ° C in un forno asciugare per lest 4 ore.
   3. Sformatura le PDMS strati superiore ed inferiore di ogni stampo di silicone tagliando lungo il bordo utilizzando un bisturi chirurgico. Punch 6 fori (due ingressi, due uscite e due camere a vuoto) con un perforatore biopsia (2,0 mm di diametro del foro).
   4. Preparare la membrana porosa versando 10 g di PDMS non essiccate e degassati su un wafer di silicio silanizzata contenente array di pubblicare con pilastri circolari (10 micron di diametro, 25 micron di altezza), sovrapponendo con TV, silanizzato strato di supporto PDMS (15: 1, w / w; 1 cm di spessore). Mettere a 3 kg di peso premistoffa sulla configurazione e curare il polimero a 60 ° C per 12 ore o più.
   5. Sformatura la configurazione di un porosa membrane PDMS aderito alla lastra di supporto PDMS dal wafer di silicio con attenzione sollevando l'angolo della lastra dal wafer, e staccava fino membrana porosa PDMS è completamente staccato dal wafer.
   6. Esporre il lato del canale di uno strato superiore (PDMS, 15: 1, w / w) e il lato della membrana porosa al plasma generato da un trattamento corona palmare per 1 min e 3 sec, rispettivamente.
   7. Posizionare le superfici plasma trattato del porosa membrane PDMS e lo strato superiore microcanale in contatto conforme mettendo ogni pezzo in parallelo senza bolle d'aria.
   8. Incubare l'intero setup a 80 ° CO / N per legame irreversibile dei due strati PDMS.
   9. Staccare lo strato di supporto PDMS dal gruppo di uno strato superiore con una membrana porosa con attenzione sollevando l'angolo dello strato di supporto, e si staccava finché lo strato di supporto è completamente staccato dallo strato superiore con la membrana.
   10. Strappare le porzioni di questa membrana si trova sopra le camere a vuoto (le due camere situate su entrambi i lati del canale principale) utilizzando un fine-tip pinzette per rendere camere a vuoto vuoti.
   11. Esporre il lato con la membrana attaccata sul pezzo superiore e il lato con i canali incisi sul pezzo inferiore al plasma in uno stesso modo come i descritton passo 1.1.6 per 1 min.
   12. Allineate lo strato microcanali superiore con una membrana porosa e lo strato inferiore con un contatto conformazionale mettendo ogni pezzo in parallelo senza bolle d'aria sotto uno stereoscopio.
   13. Curare l'intero setup in un forno secco a 80 ° CO / N per produrre una scala dispositivo microfluidica completa gut-on-a-chip contenente due camere a vuoto cave accanto al canale cella microfluidica.
2. Collegare tubo alla ingresso e uscita di ciascuna porta collegato alla tomaia o microcanali inferiori in un budello-on-a-chip con un 90 ° piegata in acciaio inox ago smussato-end.
3. Collegare il tubo ai fori collegati alle camere a vuoto utilizzando un piegato acciaio inox ago smussato-end 90 °.
4. Sterilizzare i microcanali e tubi fluendo etanolo al 70% (v / v) con un 1 ml sterilizzato siringa monouso.
5. Asciugare i microcanali e tubi in un forno a 60 ° C asciutto O / N.

2. Crescita di MicroengineEred intestinale Villi nel dispositivo Gut-on-a-chip

1. Seed cellule intestinali epiteliali (ad es Caco-2BBE) su un ^5,9 Microdevice Gut-on-a-chip.
   1. Sterilizzare il dispositivo con il 70% (v / v) etanolo (vedere fase 1.4) utilizzando un 1 ml siringa monouso sterilizzato seguito da essiccazione a 60 ° C forno secca O / N (vedere fase 1.5) prima della attivazione della superficie.
   2. Esporre la configurazione completa di un microsistema budello-on-a-chip (cioè, un corpo dell'intestino-on-a-chip collegato al tubo) a luce UV (253,7 nm) e ozono simultaneamente per 40 min.
   3. Raffreddare il dispositivo a temperatura ambiente per 15 minuti sotto la luce UV in un armadio biosicurezza (BSC).
   4. Introdurre 100 ml di rivestimento ECM soluzione- una miscela di 50 mg / tipo ml collagene e 300 ug / ml di miscela matrice extracellulare diluita nella esente da siero di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) - in entrambi i microcanali superiore e inferiore utilizzando un monouso , siringa sterile da 1 ml.
   5. incubaTe l'intero setup a 37 ° C umidificata al 5% CO ₂ incubatore per 1 ora.
   6. Degas 50 ml di pre-riscaldato (37 ° C) terreno di coltura completo (DMEM, 20%, v / v, siero bovino fetale (FBS), 100 unità / ml di penicillina, e 100 mg / streptomicina ml; aliquotati in 3 ml siringa monouso) utilizzando un sistema di filtrazione 50 ml (0,45 micron di dimensione dei pori) nel BSC per 1 min.
      1. Passare il supporto pre-riscaldato attraverso il sistema di filtrazione e toccare delicatamente sul mezzo filtrata per 1 min per rimuovere eventuali bolle o gas disciolto nel mezzo.
   7. Posizionare la aliquota di terreno completo degasata in una siringa monouso ml 3 e incubare a 37 ° C umidificata al 5% CO ₂ incubatore per 1 ora.
   8. Collegare due 3 siringhe monouso ml contenente degasate, medio pre-riscaldato completo di coltura per i microcanali superiori e inferiori.
   9. Flusso del mezzo di coltura cellulare completa degasata in microcanali superiore utilizzando una pompa a siringa al volumetricoportata di 30 microlitri / hr (equivalente alla tensione tangenziale a 0.02 dyne / cm ²⁾ a 37 ° C umidificata al 5% CO ₂ incubatore O / N.
2. Formazione di Microengineered Caco-2 Villi nel Gut-on-a-chip.
   1. Utilizzare le cellule Caco-2BBE con il numero di passaggio tra il 50 e il 65.
   2. Grow cellule Caco-2 in un pallone T75 contenente terreno di coltura completo in un 37 ° C umidificata al 5% CO ₂ incubatore per 4-5 giorni per ottenere cellule completamente confluenti.
   3. Aggiungere 10 ml di Ca ²⁺ e Mg ^2+-free PBS a pieno confluenti Caco-2 cellule coltivate in un pallone T75, lavare le cellule, poi Aspirare PBS. Ripetere questa operazione due volte.
   4. Aggiungere 1 ml di tripsina soluzione 0,05% / EDTA e incubare a 37 ° C umidificata al 5% CO ₂ incubatore per 5 min.
   5. Risospendere le cellule dissociate con 10 ml di mezzo di coltura cellulare completo pre-riscaldato (con FBS) pipettando su e giù tre a cinque volte.
   6. Centrifugare la sospensione cellulare da centrifugation a 500 xg per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
   7. Risospendere nuovo con 1 ml preriscaldata mezzo completo per regolare la densità delle cellule a ~ 1,5 x 10 ⁵ cellule / cm ² nel dispositivo. Utilizzare emocitometro per stimare la densità cellulare.
   8. Infondere 100 pl delle risospeso cellule Caco-2 nella microcanali superiore (lato lumen) posizionando un 1 ml siringa monouso collegata ad un 25 G5 / 8 ago sull'uscita del tubo collegato al microcanali superiore.
   9. Bloccare tutte le entrate e le uscite di tubi collegati ai microcanali superiore e inferiore con clip legante.
   10. Incubare l'intera configurazione a 37 ° C, umidificata al 5% CO ₂ incubatore per 1 ora per consentire dissociato cellule Caco-2 per aderire alla superficie della membrana porosa.
   11. Rimuovere i morsetti e riprendere il flusso di terreno di coltura solo al microcanali superiore al 30 microlitri / hr utilizzando una pompa a siringa fino cellule formano un monostrato intatto per 24-36 ore. Utilizzare i contras faset o microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) per confermare giunzioni cellula-cellula in un monostrato di cellule.
   12. Quando le cellule formano un monostrato, profumato il terreno di coltura in entrambi superiori (lumen) e inferiore microcanali (capillari) alla stessa velocità di flusso di 30 ml / h.
   13. L'applicazione di deformazioni meccaniche che mimano peristalsi-come movimenti ^5,9.
       1. Accendere la pompa a vuoto equipaggiato con l'apparecchiatura tensione.
       2. Collegare le camere a vuoto per il controllore di vuoto tramite tubi con un connettore in acciaio inox.
       3. Impostare il moto allungamento del 10% ceppo cellulare medio ad una frequenza di 0,15 Hz con la modalità funzione seno ciclico sul software di controllo del vuoto, quindi scegliere "Start".
   14. Mantenere il flusso costante di terreno di coltura (30 ml / h) in entrambi i microcanali superiore e inferiore al confluente Caco-2 monostrato sotto deformazioni meccaniche (10%, 0,15 Hz) per ~ 100 ore.
       Nota: cellule Caco-2 sponneamente subire morfogenesi dei villi con le proiezioni in 3D ondulati estesi verso il lume del microcanali epiteliale ^5,8-10.
3. Per emulare le funzioni a livello di organo dell'intestino umano vivente con interfaccia tessuto lumen-capillare nell'intestino-on-a-chip ^10, seguire la procedura descritta.
   1. Grow microengineered Caco-2 villi ripetendo i passaggi 2,1-2,2.
   2. Flusso pre-riscaldato a medio co-coltura (una miscela di completo mezzo di coltura cellulare Caco-2 e la HMVECs mezzo completo di coltura, 1: 1 v / v) per i microcanali superiore e inferiore a 30 microlitri / hr.
   3. Introdurre 100 ml di cellule normali dissociate capillare microvascolari umane endoteliali (HMVECs; densità cellulare finale, ~ 5.0 x 10 ⁵ cellule / cm ²⁾ nel microcanali in basso con il metodo identico descritto ai punti da 2.2.3 a 2.2.9.
   4. Posizionare un pezzo rettangolare PDMS curato (0,5 centimetri x 1 cm x 1 cm, larghezza x lunghezza x altezza; 15: 1, w/ w elastomero: induritore) sulla parte superiore del dispositivo gut-on-a-chip, poi capovolgere l'intera configurazione del dispositivo a testa in giù (vale a dire, il microcanali superiore volti al ribasso, e la più bassa microcanali volti al rialzo).
   5. Incubare la configurazione a 37 ° C, umidificata al 5% CO ₂ incubatore per 1 ora per consentire HMVECs dissociati per aderire alla superficie della membrana porosa in microcanali inferiore.
   6. Estrarre un intero setup dal termostato di CO _2, e capovolgere l'impostazione più volte.
   7. Flusso medio co-coltura pre-riscaldato (una miscela di completo mezzo di coltura cellulare Caco-2 e la HMVECs mezzo completo di coltura, 1: 1 v / v) in entrambi i microcanali superiore e inferiore a 30 microlitri / hr con movimenti di stretching meccanici ( 10%, 0,15 Hz) per almeno tre giorni per formare giunzioni cellula-cellula di un monostrato endoteliale.

3. Host-Gut Microbiome Co-cultura in un Microdevice Gut-on-a-chip

1. Eseguire pre-cultura of le cellule batteriche come segue per co-coltura commensale dell'intestino microbiome sul villi intestinali microengineered.
   1. Risospendere il composto in polvere batterica probiotici liofilizzati in 10 ml della miscela (1: 1, v / v) di autoclavato lattobacilli MRS brodo e rinforzato da clostridi Medium.
   2. Regolare la densità cellulare finale a circa 0,2 unità di densità ottica (a 600 nm) l'aggiunta di adeguate quantità di mezzo, poi un'aliquota 3 ml di sospensione cellulare microbica in una provetta sterile monouso da 10 ml.
   3. Porre le provette contenenti risospese cellule microbiche nel contenitore anaerobica. Aggiungere due confezioni di anaerobica bustina generatore di gas nel contenitore. Chiudere il coperchio del contenitore e incubare la configurazione del contenitore senza agitazione a 37 ° C umidificata al 5% di CO ₂ incubatore O / N.
2. Inoculazione di Microbiome e co-coltura con cellule epiteliali intestinali ^5,10.
   1. Preparare 3 ml siringhe monouso contenenti antibioti degassatoc privo terreno di coltura cellulare (cioè, DMEM con 20% FBS). Vedere 2.1.6 per la procedura di degassificazione del mezzo di coltura.
   2. Estrarre tutta una messa a punto del dispositivo gut-on-a-chip contenente villi microengineered dal termostato di CO _2, per poi passare al mobile biosicurezza.
   3. Rimuovere siringhe collegati al tubo collegato a microcanali superiori e inferiori. Collegare siringhe preparate in 3.2.1 per il dispositivo, riportare al incubatore CO _2, poi sfociare questo terreno di coltura privo di antibiotici per 12 ore prima di semina di microbioma.
   4. Spin giù le cellule probiotici miscela batteriche pre-coltura (vedere i passi in 3.1) a 10.000 xg per 5 min. Aspirare il surnatante usando il vuoto, poi risospendere in terreno DMEM antibiotico-free (densità cellulare finale, ~ 1.0 x 10 ⁷ CFU / ml).
   5. Infondere la sospensione cellulare nel lato lume del microcanali che contiene i villi intestinali "germ-free" con un 1 ml siringa monouso collegata ad un 25G5 / 8 ago. Consentire l'adesione delle cellule microbiche alla superficie apicale della villi intestinali per ~ 1,5 ore senza flusso mediante serraggio a tutte le estremità del tubo.
   6. Profumato terreno di coltura privo di antibiotici pre-riscaldato in entrambi i microcanali superiore e inferiore a 40 ml / h con deformazioni ritmiche ciclici (10%, 0,15 Hz).
   7. Per la co-coltura di proteina fluorescente verde (GFP) -labeled E. coli (E. coli GFP; non patogeno DH5-Alpha E. coli ospitanti) ^10,11 cellule con villi microengineered, pre-coltivare GFP E. coli in terreno LB autoclave a 37 ° C sotto agitazione condizione (200 rpm) per 12 ore. Ripetere la procedura da 3.2.5 a 3.2.6 per effettuare co-coltura di GFP E. coli con villi microengineered.
3. Celle di immagine ^5,8-10
   1. Eseguire DIC, epifluorescenza, o scansione laser microscopia confocale per la registrazione microbica e epiteliale morfologia ^5,8,10.
      1. Per la formazione immagine DIC, prendere una configurazione di microsistemi gut-on-a-chip dal termostato di CO _2, posizionare la configurazione del dispositivo sul palco di un microscopio, quindi registrare la morfologia cellulare.
      2. Per l'imaging di fluorescenza di villi dell'epitelio, il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 l / h per 10 min.
         1. Fissare villi con 4% (w / v) paraformaldeide per 15 min. Poi il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 ml / h per 10 min.
         2. Permeabilize villi con 0,3% (v / v) Triton X-100 diluito in PBS contenente 2% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) per 10 min. Poi il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 ml / h per 10 min.
         3. cellule di blocco con 2% (w / v) di BSA in PBS per 1 ora. Poi il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 ml / h per 10 min.
         4. Aggiungere 300 Nm di 4 ', 6-dicloridrato diamidino-2-phenylindole soluzione (DAPI) diluito in PBS per la colorazione nucleare sotto protezione dalla luce.
         5. Aggiungere 25 unità / ml di falloidina fluorescente(Falloidina-CF647 coniugato) disciolto in PBS per la colorazione F-actina sotto protezione dalla luce.
         6. registrare le immagini di cellule fluorescente colorate utilizzando una scansione laser microscopio confocale.
            Nota: Un obiettivo 25X è stato applicato con zoom ottico appropriato durante la microscopia confocale. Nella Figura 3B, è stato utilizzato circa 525X ingrandimento.

Risultati

Per emulare il intestinale ecosistema host-microbioma umano in vitro, è necessarie per sviluppare un protocollo sperimentale per ricostituire la stabilità a lungo termine co-coltura di batteri intestinali e le cellule epiteliali intestinali umane in condizioni fisiologiche come la meccanica peristalsi-simili e flusso del fluido. Qui, utilizziamo un biomimetico Microdevice gut-on-a-chip (Figura 1A) per co-coltura cellule microbiche a diret...

Discussione

Capire interazioni ospite-microbiome è fondamentale per far progredire la medicina; tuttavia, tradizionali modelli di coltura cellulare eseguiti in un piatto di plastica o di una piastra ben statica non supportano la stalla co-coltura di cellule intestinali umane con microbi intestinali vivere per più di 1-2 giorni, perché le cellule microbiche soprattutto invadere le cellule di mammifero in vitro. La popolazione microbica overgrowing consuma rapidamente ossigeno e sostanze nutritive, in seguito la produzion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES	Gibco	10564-011	Warm it up at 37 °C in a water bath.
Difco Lactobacilli MRS broth	BD	288120	Run autoclave at 121 °C for 15 min.
Poly(dimethylsiloxane)	Dow Corning	3097358-1004	15:1 (w/w), PDMS : cureing agent
Caco-2BBE human colorectal carcinoma line	Harvard Digestive Disease Center		Human colorectal adenocarcinoma
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	20% (v/v) in DMEM
Penicillin-streptomycin-glutamine	Gibco	10378-016	1/100 dilution in DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Molecular Probes	D1306	Nuclei staining
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml)	Biotium	00041	F-actin staining
Flexcell FX-5000 tension system	Flexcell International Corporation	FX5K	Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency)
Inverted epifluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	Imaging, DIC
Scanning confocal microscope	Leica	DMI6000	Imaging, Fluorescence
UVO Cleaner	Jelight Company Inc	342	Surface activation of the gut-chip
Type I collagen	Gibco	A10483-01	Extracellular matrix component for cell culture into the chip
Matrigel	BD	354234	Extracellular matrix component for cell culture into the chip
1 ml disposable syringe	BD	309628	Cell and media injection stuff
25 G 5/8 needle	BD	329651	Cell and media injection stuff
Syringe pump	Braintree Scientific Inc.	BS-8000	Injection equipment into the chip
VSL#3	Sigma-Tau Pharmaceuticals	7-45749-01782-6	A formulation of 8 different commensal gut microbes
Reinforced Clostridial Medium	BD	218081	Anaerobic bacteria culture medium
GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator	BD	260001	Anaerobic gas generating sachet
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-4-100	Fixing the cells for staining
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilizing the cells
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030	Blocking agent for staining of the cells
Corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC	Plasma generator for fabrication of the chip
Steriflip	Millipore	SE1M003M00	Degasing the complete culture medium
Disposable hemocytometer	iNCYTO	DHC-N01	For manual cell counting