Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Resumo

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para realizar co-cultura de longo prazo de multi-espécies microbioma intestinal humana com vilosidades intestinais microengineered em um dispositivo microphysiological gut-on-a-chip humano. Nós recapitular a interface tecido intestinal lúmen capilar num dispositivo de microfluidos, onde as deformações mecânicas e fisiológicas fluxo de cisalhamento de fluidos são constantemente aplicada para imitar o peristaltismo. No microcanal lúmen, epiteliais intestinais células Caco-2 humanos são cultivados de modo a formar um epitélio das vilosidades 'livre de germes' e regenerar pequenas vilosidades intestinais. células microbianas cultivadas são pré-inoculado para o lado do lúmen para estabelecer um ecossistema hospedeira-micróbio. Depois de células microbianas aderir à superfície apical das vilosidades, fluxo de fluido e deformações mecânicas são retomadas a produzir um micro-ambiente de estado estacionário na qual meio de cultura fresco é continuamente fornecido e bactérias não ligadas (bem como resíduos bacterianas) são continuamente removidos. Após prolongado co-cultura fdias ROM para semanas, múltiplos microcolônias são encontrados para ser localizado de forma aleatória entre as vilosidades, e tanto as células epiteliais microbiana e permanecer viável e funcional durante pelo menos uma semana de cultura. Nosso protocolo de co-cultura pode ser adaptado para proporcionar uma plataforma versátil para outros ecossistemas hospedeiras-microbiota que pode ser encontrado em vários órgãos humanos, o que pode facilitar o estudo in vitro do papel da microbiota humana na orquestração de saúde e na doença.

Introdução

O intestino humano abriga uma matriz surpreendentemente diversificado de espécies microbianas (<1.000 espécies) e um número enorme de células microbianas (10 vezes mais do que as células hospedeiras humanas) e genes (100 vezes mais do que o genoma humano) ^1. Estes microbiomas humanos desempenham um papel fundamental no metabolismo de nutrientes e xenobióticos, regulação das respostas imunitárias, e a manutenção da homeostase intestinal ^2. Não é de surpreender, tendo em conta estas diversas funções, o microbioma intestinal comensal extensivamente modula saúde e da doença ^3. Assim, a compreensão do papel das interações microbioma intestinal e host-micróbio são de grande importância para promover gastrointestinal saúde (GI) e explorar novas terapêuticas para distúrbios intestinais ^4. No entanto, já existente em modelos de intestino in vitro (por exemplo, culturas estáticas) restringir a co-cultura de hospedeiro-microbiota a um curto período de tempo (<1 dia) porque as células microbianas e cobrir comprometer barreira intestinal⁵ funções. Modelos animais de substituição (por exemplo, ⁶ ou geneticamente modificada livre de germes ratos ⁷⁾ também não são comumente usados ​​para estudar host-gut microbiome crosstalk porque a colonização e manutenção estável do microbioma intestinal humana são difíceis.

Para superar estes desafios, que recentemente desenvolveu um ser humano biomimético "Gut-on-a-Chip" sistema microphysiological (Figura 1A, à esquerda) para emular as interações microbioma host-intestinais que ocorrem no intestino humano vivo ^5,8. O microdispositivo intestino-on-a-chip contém dois canais de microfluidos paralelas separadas por um flexível, poroso, matriz extracelular (ECM) -Revestido membrana revestida por epiteliais intestinais humanas Caco-2 As células, imitando o lúmen intestinal interface para o tecido-capilares (Figura 1A , à direita) ^9. deformações rítmicos cíclicos orientada por vácuo induzir deformações mecânicas fisiológicas que imitam mudanças normalmente Induced pelos movimentos peristálticos (Figura 1A, direita). Curiosamente, quando as células Caco-2 são cultivadas no intestino-on-a-chip para mais de 100 h, eles formam espontaneamente tridimensional (3D) vilosidades intestinais com junções apertadas, fronteiras escova apicais, células proliferativas limitados a criptas basais, a produção de muco, aumento da atividade de metabolização de drogas (por exemplo, o citocromo P450 3A4, CYP3A4), e reforçada glucose recaptação ^8. Neste microambiente 'livre de germes ", que era possível a co-cultura de Lactobacillus rhamnosus GG probiótico ou a formação de uma mistura terapêutica bacteriana probiótico com células epiteliais do hospedeiro por até duas semanas ^5,10.

Neste estudo, descrevemos o protocolo detalhado para executar-hospedeiro intestino co-cultura microbioma no dispositivo de intestino-on-a-chip por um período prolongado. Além disso, discutimos questões críticas e desafios potenciais a serem considerados para uma ampla aplicação deste host-microbioma co-cultura protocolo.

Protocolo

1. A microfabricação de um dispositivo Gut-on-a-chip

Nota: A a-chip intestino-em-um dispositivo de microfluidos feita por polímero de silicone transparente, permeável ao gás (polidimetilsiloxano, PDMS), contendo dois microcanais paralelas (1 mm de comprimento x largura de 150 um de altura x 1 cm), separadas por uma flexível porosa (10 um de diâmetro de poro, 25 um de poro no espaçamento de poro) PDMS membrana de ^5,9. Fabricar o gut-on-a-chip (Figura 1A, esquerda), seguindo os passos indicados.

1. Microfabricação Processo do ^5,9 Gut-on-a-chip.
   1. Prepare PDMS não curado, desgaseificada por mistura do pré-polímero de PDMS e o agente de cura (15: 1 w / w), e colocá-lo no exsicador de vácuo durante 30 min.
   2. Despeje 30 g e 3 g de não curados, PDMS desgaseificados em cada molde de silicone que tem SU-8 micropadrões base da parte superior e os microcanais inferiores do a-chip gut-on-, respectivamente. Em seguida, curar a 60 ° C num forno seco durante pelo lleste 4 h.
   3. Desmoldar o PDMS camadas superior e inferior de cada molde de silicone por corte em torno da borda usando um bisturi cirúrgico. Soco 6 furos (duas entradas, duas saídas e duas câmaras de vácuo) utilizando um perfurador de biópsia (2,0 mm de diâmetro do furo).
   4. Preparar a membrana porosa por vazamento 10 g de PDMS não curado e desgaseificado em uma bolacha de silício silanizado contendo pós matrizes com pilares circulares (10 um de diâmetro, 25 ^ m de altura) sobrepondo com uma superfície plana, silanizada camada de suporte PDMS (15: 1, W / w; 1 cm de espessura). Coloque um calcador 3 kg de peso sobre a configuração e curar o polímero a 60 ° C durante 12 h ou mais.
   5. Desmoldar a configuração de uma membrana porosa de PDMS aderido à laje de apoio PDMS da bolacha de silício por cuidadosamente levantando o canto da placa de bolacha, e que descasca fora até que a membrana porosa PDMS é completamente separado da bolacha.
   6. Expor o lado do canal de uma camada superior (PDMS, 15: 1, w / w) e o lado da membrana porosa ao plAsma gerado por um tratador de corona de mão durante 1 min, e 3 s, respectivamente.
   7. Coloque as superfícies tratadas com plasma da membrana PDMS poroso e camada de microcanais superior em um contato conformada, colocando cada peça em paralelo sem quaisquer bolhas de ar.
   8. Incubar toda a configuração a 80 ° CO / N para a ligação irreversível de as duas camadas de PDMS.
   9. Descolar a camada de suporte a partir de PDMS a montagem de uma camada superior com uma membrana porosa com cuidado levanta acima do canto da camada de suporte, e que descasca fora até que a camada de suporte é completamente separada da camada superior com a membrana.
   10. Corte as porções desta membrana localizada sobre as câmaras de vácuo (as duas câmaras situadas de cada lado do canal principal), utilizando uma pinça de ponta fina para tornar as câmaras de vácuo ocos.
   11. Expor o lado com a membrana ligada no topo da peça e o lado com os canais gravados na parte inferior do pedaço de plasma num mesmo modo como descrito iN passo 1.1.6 durante 1 min.
   12. Alinhar a camada superior microcanal com uma membrana porosa e a camada inferior com um contacto conformada colocando cada peça em paralelo, sem quaisquer bolhas de ar sob um estereoscópio.
   13. Curar toda a configuração num forno seco a 80 ° CO / N para produzir uma escala dispositivo completo gut-on-a-chip microfluídico contendo duas câmaras de vácuo ocas ao lado do canal de Cell microfluídico.
2. Para ligar a tubagem de entrada e na saída de cada porta ligada à parte superior ou inferior dos microcanais em uma a-chip-on-intestinal através de uma agulha de extremidade romba de 90 ° dobrada de aço inoxidável.
3. Ligue a tubagem aos buracos ligados às câmaras de vácuo, utilizando uma agulha romba-end 90 ° curvado de aço inoxidável.
4. Esterilizar os microcanais e a tubagem de fluxo de 70% (v / v) de etanol utilizando uma mistura 1 ml esterilizados seringa descartável.
5. Secar os microcanais e tubos em um 60 ° C forno seco O / N.

2. Crescimento de micromotorEred Intestinal Villi no Dispositivo Gut-on-a-chip

1. Semente células intestinais epiteliais (por exemplo, Caco-2BBE) sobre um ^5,9 microdispositivos Gut-on-a-chip.
   1. Esteriliza-se o dispositivo com 70% (v / v) de etanol (ver passo 1.4), utilizando uma seringa de 1 ml descartável esterilizado seguido por secagem num forno a 60 ° C seco S / N (ver passo 1.5), antes da activação da superfície.
   2. Expor a configuração completa de um microssistema intestino-on-a-chip (ou seja, um corpo do intestino-on-a-chip conectado a tubagem) à luz ultravioleta (253,7 nm) e o ozono simultaneamente, durante 40 min.
   3. Arrefecer o dispositivo à TA durante 15 min com luz UV de uma cabine de segurança biológica (BSC).
   4. Introduzir 100 ul de o revestimento de ECM solução que consistiria uma mistura de 50 ug / Tipo ml Eu colagénio e 300 ug / ml de mistura de matriz extracelular diluída no livre de soro da Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) - em ambos os microcanais superior e inferior usando um descartável , estéril seringa de 1 ml.
   5. Incubate toda a configuração de uma temperatura de 37 ° C humidificada com 5% de _CO2 durante 1 hora.
   6. Desgaseifica 50 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura completo (DMEM, 20%, v / v, de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina; aliquotadas em 3 ml seringa descartável) usando um sistema de filtração de 50 ml (0,45 um de tamanho de poro) no BSC durante 1 min.
      1. Passar o meio de pré-aquecido através do sistema de filtragem e bater suavemente sobre a forma filtrada durante 1 minuto para remover quaisquer bolhas de gás ou dissolvido no meio.
   7. Coloque a alíquota de meio completo desgaseificada numa seringa descartável de 3 ml e incuba-se num banho a 37 ° C humidificada com 5% de _CO2 durante 1 hora.
   8. Conectar duas seringas descartáveis ​​de 3 ml contendo desgaseificada, meio de cultura completo pré-aquecido para os microcanais superiores e inferiores.
   9. Fluir o meio de cultura celular completo desgaseificada no microcanal superior usando uma bomba de seringa no volumétricataxa de 30 ul / h de fluxo (equivalente à tensão de corte a 0,02 dyne / ^cm2) em uma temperatura de 37 ° C humidificada com 5% de CO ₂ incubadora S / N.
2. Formação de Microengineered Caco-2 vilosidades no o a-chip-on-Gut.
   1. Utilização de células Caco-2BBE com o número de passagem entre 50 e 65.
   2. Crescer as células Caco-2 em um frasco T75 contendo meio de cultura completo em uma temperatura de 37 ° C humidificada com 5% de _CO2 durante 4-5 dias para obter células completamente confluentes.
   3. Adicionar 10 ml de Ca ²⁺ e Mg ²⁺ -livre PBS para totalmente as células Caco-2 confluentes, cultivadas num frasco T75, células de lavar, em seguida, aspirar para fora PBS. Repita esta etapa duas vezes.
   4. Adicionar 1 ml de solução de tripsina / EDTA a 0,05% e incuba-se num banho a 37 ° C humidificada com 5% de _CO2 durante 5 min.
   5. Ressuspender as células dissociadas com 10 ml de meio de cultura celular completo pré-aquecido (com FBS) por pipetagem para cima e para baixo de três a cinco vezes.
   6. Spin down a suspensão de células por centrifugation a 500 xg durante 5 min, em seguida, remover o sobrenadante.
   7. Ressuspender novamente com 1 ml de pré-aquecido meio completo para ajustar a densidade celular a 1,5 x 10 ~ ⁵ células / ^cm2 no dispositivo. Use hemocitómetro para estimar a densidade de células.
   8. Infundir 100 ul da ressuspensas Caco-2 em células do microcanal superior (lado do lúmen), colocando uma seringa descartável de 1 ml ligada a uma 25 G5 / 8 agulha na saída da tubagem ligada ao microcanal superior.
   9. Fixe todas as entradas e saídas de tubos ligados aos microcanais superior e inferior usando grampos da pasta.
   10. Incubar toda a configuração de uma temperatura de 37 ° C, humidificada com 5% de _CO2 durante 1 hora para permitir que dissociado células Caco-2 a aderir à superfície da membrana porosa.
   11. Remover os grampos e retomar o fluxo de meio de cultura apenas ao microcanal superior a 30 uL / ​​hr usando uma bomba de seringa até que as células formam uma monocamada intacta durante 24-36 hr. Use os contras de faseT ou microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) para confirmar junções célula-célula em uma monocamada de células.
   12. Quando as células formam uma monocamada, a perfusão do meio de cultura para ambos os superiores (lúmen) e inferior microcanais (capilar) à mesma taxa de fluxo de 30 mL / hr.
   13. Aplicação de deformações mecânicas que imitam movimentos peristaltismo-like ^5,9.
       1. Ligar a bomba de vácuo equipada com o equipamento de tensão.
       2. Ligar as câmaras de vácuo para o controlador de vácuo através de uma tubagem com um conector de aço inoxidável.
       3. Defina o movimento de alongamento de 10% de deformação média de células com uma frequência de 0,15 Hz com o modo de função seno cíclica sobre o software que controla a vácuo, em seguida, clique em "Start".
   14. Manter o fluxo constante de meio de cultura (30 ul / h) em ambos os microcanais superiores e inferiores para o confluente monocamada de células Caco-2 sob deformações mecânicas (10%, 0,15 Hz) durante 100 ~ hr.
       Nota: as células Caco-2 sponneamente sofrer morfogénese das vilosidades com projecções 3D ondulados estendidos em direcção ao lúmen do microcanal epitelial ^5,8-10.
3. Para emular as funções de nível de órgãos do intestino humano vivo com interface de tecido lúmen capilar no intestino-on-a-chip ^10, siga os passos conforme descrito.
   1. Cresça microengineered Caco-2 vilosidades, repetindo os passos de 2,1 a 2,2.
   2. Fluir o meio de pré-aquecido de co-cultura (uma mistura de meio de cultura celular completo de Caco-2 e o meio de cultura completo HMVECs, 1: 1 v / v) para os microcanais superiores e inferiores a 30? L / h.
   3. Introduzir 100 ul de células dissociadas normais capilar microvasculares endoteliais humanas (HMVECs, densidade celular final, ~ 5,0 x 10 ⁵ células / ^cm2) na parte inferior das microcanal pelo método idêntico descrito nos passos a partir de 2.2.3 a 2.2.9.
   4. Coloque um pedaço rectangular de PDMS curado (0,5 cm x 1 cm x 1 cm; comprimento x largura x altura; 15: 1, W/ w elastômero: agente de cura) em cima do dispositivo gut-on-a-chip, em seguida, virar toda a configuração do dispositivo de cabeça para baixo (ou seja, do microcanal superior enfrenta para o lado negativo, e do microcanal inferior enfrenta para a cabeça).
   5. Incubar a configuração em um temperatura de 37 ° C, humidificada com 5% de _CO2 durante 1 hora para permitir HMVECs dissociados para aderir à superfície da membrana porosa no microcanal inferior.
   6. Retire uma configuração inteira da incubadora _de CO _2, e virar a configuração mais uma vez.
   7. Fluxo do meio de co-cultura pré-aquecido (uma mistura de meio de cultura celular completo de Caco-2 e o meio de cultura HMVECs completa, 1: 1 v / v) em ambos os microcanais superiores e inferiores a 30? L / h, com movimentos de alongamento mecânico ( 10%, 0,15 Hz), durante pelo menos três dias para formar junções célula-célula de uma monocamada endotelial.

3. Host-gut Microbiome Co-cultura num microdispositivos Gut-on-a-chip

1. Realizar pré-cultura of das células bacterianas como segue para co-cultura microbioma commensal intestino na vilosidades intestinais microengineered.
   1. Ressuspender a mistura em pó bacterianas probióticas liofilizado em 10 ml de mistura (1: 1, v / v) de Lactobacilli MRS Broth autoclavado e reforçado de Clostridium Médio.
   2. Ajustar a densidade de células final de aproximadamente 0,2 unidades de densidade óptica (a 600 nm) por adição de uma quantidade adequada de meio de, em seguida, 3 ml de aliquota de suspensão de células microbianas num tubo estéril de 10 ml descartável.
   3. Colocar os tubos contendo células microbianas ressuspensos no recipiente anaeróbio. Adicionar dois maços de anaeróbio saquinho de geração de gás no recipiente. Fechar a tampa do recipiente hermeticamente e incubar a configuração do recipiente sem agitação num banho a 37 ° C humidificado a 5% de CO ₂ incubadora S / N.
2. Inoculação de Microbiome e Co-cultura com células epiteliais intestinal ^5,10.
   1. Prepare 3 ml seringas descartáveis ​​contendo antibioti desgaseificadoC-livre meio de cultura celular (ou seja, meio DMEM com FBS a 20%). Ver 2.1.6 para o processo de desgasagem do meio de cultura.
   2. Retire uma configuração de todo o dispositivo de gut-on-a-chip contendo vilosidades microengineered da incubadora _de CO _2, em seguida, passar para a cabine de segurança biológica.
   3. Remover seringas ligada à tubagem ligada para os microcanais superiores e inferiores. Conectar seringas preparadas em 3.2.1 para o dispositivo, para trazer de volta na incubadora de CO _2, então o fluxo este meio de cultura isento de antibiótico durante 12 horas antes da sementeira da microbiota.
   4. Girar as células bacterianas probióticas pré-cultivadas a mistura (ver passos em 3.1) a 10.000 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante usando vácuo, em seguida ressuspender em meio de DMEM livre de antibióticos (densidade celular final, ~ 1,0 x 10 ⁷ UFC / ml).
   5. Infundir a suspensão de células para o lado do lúmen do microcanal contendo as vilosidades intestinais "livres de germes", usando uma seringa descartável de 1 ml ligada a uma 25G5 / 8 agulha. Permitir que a aderência de células microbianas para a superfície apical das vilosidades intestinais durante ~ 1,5 horas sem fluxo por fixação a toda a extremidade da tubagem.
   6. Perfundir o meio de cultura livre de antibióticos pré-aquecido em ambos os microcanais superiores e inferiores a 40? L / h, com deformações cíclicas rítmicos (10%, 0,15 Hz).
   7. Para a co-cultura de proteína verde fluorescente (GFP) marcado com E. coli (GFP E. coli; não-patogênico hospedeiras coli DH5-alfa E.) ^10,11 células com vilosidades microengineered, pré-cultivar GFP E. células de E. coli em meio LB autoclavado a 37 ° C sob agitação condição (200 rpm) durante 12 h. Repita o procedimento a partir do 3.2.5 para 3.2.6 para realizar co-cultura de GFP E. células de E. coli com vilosidades microengineered.
3. Células imagem ^5,8-10
   1. Execute DIC, epifluorescência, ou de varredura a laser microscopia confocal para gravar microbiana e epitelial morfologia ^5,8,10.
      1. Para a imagem DIC, tirar uma configuração do microssistema gut-on-a-chip da incubadora _de CO _2, coloque a configuração do dispositivo no palco de um microscópio, em seguida, registrar a morfologia celular.
      2. Para imagiologia de fluorescência de epitélio das vilosidades, fluir PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min.
         1. Fix vilosidades com 4% (w / v) de paraformaldeído durante 15 min. Então o fluxo de PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min.
         2. Permeabilizar as vilosidades com 0,3% (v / v) de Triton X-100 diluído em PBS contendo 2% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) durante 10 min. Então o fluxo de PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min.
         3. As células de bloco com 2% (w / v) de solução de BSA em PBS durante 1 h. Então o fluxo de PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min.
         4. Adicionar 300 nM de 4 ', solução de dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) diluída em PBS para a coloração nuclear sob protecção contra a luz.
         5. Adicionar 25 unidades / ml de phalloidin fluorescente(Conjugado faloidina-CF647) dissolvida em PBS para a coloração de F-actina sob a proteção de luz.
         6. gravar imagens das células fluorescentes coradas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser.
            Nota: Um objetivo 25X foi aplicado com zoom óptico apropriado durante a microscopia confocal. Na Figura 3B, foi utilizado aproximadamente 525x ampliação.

Resultados

Para emular o ecossistema hospedeira-microbiota intestinal humano in vitro, que é necessário desenvolver um protocolo experimental para reconstituir a co-cultura estável a longo prazo das bactérias intestinais e as células epiteliais intestinais humanas sob condições fisiológicas, tais como peristalse mecânica semelhante e fluxo de fluido. Aqui, nós utilizamos um microdispositivo biomimético gut-on-a-chip (Figura 1A) para co-cult...

Discussão

Compreender as interacções hospedeiro-microbioma é fundamental para o avanço da medicina; No entanto, os modelos de cultura de células tradicional realizados numa placa de plástico ou de uma placa de estática não suportam a co-cultura estável de células intestinais humanas com micróbios intestinais viver durante mais de 1-2 dias na maior parte porque as células microbianas cobrir as células de mamíferos in vitro. A população microbiana overgrowing rapidamente consome oxigénio e nutrientes, prod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES	Gibco	10564-011	Warm it up at 37 °C in a water bath.
Difco Lactobacilli MRS broth	BD	288120	Run autoclave at 121 °C for 15 min.
Poly(dimethylsiloxane)	Dow Corning	3097358-1004	15:1 (w/w), PDMS : cureing agent
Caco-2BBE human colorectal carcinoma line	Harvard Digestive Disease Center		Human colorectal adenocarcinoma
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	20% (v/v) in DMEM
Penicillin-streptomycin-glutamine	Gibco	10378-016	1/100 dilution in DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Molecular Probes	D1306	Nuclei staining
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml)	Biotium	00041	F-actin staining
Flexcell FX-5000 tension system	Flexcell International Corporation	FX5K	Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency)
Inverted epifluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	Imaging, DIC
Scanning confocal microscope	Leica	DMI6000	Imaging, Fluorescence
UVO Cleaner	Jelight Company Inc	342	Surface activation of the gut-chip
Type I collagen	Gibco	A10483-01	Extracellular matrix component for cell culture into the chip
Matrigel	BD	354234	Extracellular matrix component for cell culture into the chip
1 ml disposable syringe	BD	309628	Cell and media injection stuff
25 G 5/8 needle	BD	329651	Cell and media injection stuff
Syringe pump	Braintree Scientific Inc.	BS-8000	Injection equipment into the chip
VSL#3	Sigma-Tau Pharmaceuticals	7-45749-01782-6	A formulation of 8 different commensal gut microbes
Reinforced Clostridial Medium	BD	218081	Anaerobic bacteria culture medium
GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator	BD	260001	Anaerobic gas generating sachet
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-4-100	Fixing the cells for staining
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilizing the cells
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030	Blocking agent for staining of the cells
Corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC	Plasma generator for fabrication of the chip
Steriflip	Millipore	SE1M003M00	Degasing the complete culture medium
Disposable hemocytometer	iNCYTO	DHC-N01	For manual cell counting