JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описывается протокол в пробирке для совместного культивирования кишечной микробиомом и ворсинок кишечника в течение длительного периода , используя человеческую microphysiological систему кишка-на-чипе.

Аннотация

Здесь мы опишем протокол для выполнения долгосрочного сотрудничества культуры нескольких видов человеческого кишечника микробиомом с microengineered кишечных ворсинок в кишечнике человека-на-чипе microphysiological устройства. Резюмируем просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани в микрожидком устройстве, где физиологические механические деформации и сдвигового течения жидкости постоянно применяются для имитации перистальтику. В просвете микроканалов, кишечные эпителиальные клетки Сасо-2 человека культивируют с образованием "стерилен" ворсинок эпителия и регенерации тонкого кишечника ворсинки. Предварительно культивированный микробные клетки инокулируют в сторону светового потока, чтобы установить хост-микробных экосистему. После того, как микробные клетки прилипают к апикальной поверхности ворсинок, поток текучей среды, и механические деформации возобновили производить стационарную микросреду, в котором свежая культуральная среда постоянно подается и несвязанные бактерии (а также бактериальные отходы), непрерывно удаляются. После длительного совместного культивирования FROM дней до нескольких недель, несколько микроколонии оказываются случайным образом расположены между ворсинками, и как микробный и эпителиальные клетки остаются жизнеспособными и функциональной в течение по крайней мере, одну неделю в культуре. Наш протокол совместного культивирования может быть адаптирована для обеспечения универсальную платформу для других хост-микробиомом экосистем , которые могут быть найдены в различных человеческих органов, которые могут способствовать в пробирке изучения роли человеческого микробиомом в оркестровки здоровья и болезни.

Введение

Кишечник человека таит в себе потрясающе разнообразный спектр видов микроорганизмов (<1000 видов) и огромное количество микробных клеток ( в 10 раз больше , чем клеток - хозяев человека) и гены ( в 100 раз больше , чем в геноме человека) 1. Эти человеческие microbiomes играют ключевую роль в метаболизировать питательных веществ и ксенобиотиков, регуляции иммунных реакций и поддержание гомеостаза кишечника 2. Не удивительно, учитывая эти разнообразные функции, комменсальной кишечника микробиомом широко модулирует здоровье и болезни 3. Таким образом, понимание роли кишечника микробиомом и хост-микробных взаимодействий имеют большое значение для содействия желудочно - кишечного тракта (GI) здоровья и исследовать новые терапевтические средства для лечения кишечных расстройств 4. Тем не менее, существующие в пробирке моделях кишечника (например, статические культуры) ограничивают хост-микробиомом сокультуре на короткий период времени (<1 день) , так как микробные клетки разрастаются и скомпрометировать кишечного барьераФункция 5. Суррогатные модели на животных (например, стерилен 6 или генной инженерии мышей 7) также обычно не используется для изучения хост-кишечную микробиомом перекрестных помех , так как колонизация и стабильное поддержание кишечной микробиомом человека трудно.

Для преодоления этих проблем, недавно мы разработали Biomimetic человека "Gut-на-чипе" microphysiological системы (рис 1А, слева) , чтобы эмулировать микробиомом взаимодействия хост-кишечную , которые происходят в живом человеческом кишечнике 5,8. Микроприбор кишка-на-чипе содержит два параллельных микроканалов , разделенных гибкой пористой, внеклеточного матрикса (ЕСМ) -покрытие мембраны выстлана эпителия кишечника человеческого Сасо-2 клеток, имитируя просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани (рис 1A , справа) 9. Вакуумные управляемые циклические ритмические деформации вызывают физиологические механические деформации, которые имитируют изменения обычно inducред перистальтики (рис 1А, справа). Интересно, что когда клетки Сасо-2 выращивают в микросхеме кишка-на-для более чем 100 часов, они самопроизвольно образуют трехмерную (3D) ворсинок кишечника с плотными соединениями, верхушечных границ кисти, пролиферирующих ограничивается базальных крипт, производство слизи, повышение активности метаболизировать наркотиков (например, цитохром Р450 3А4, CYP3A4), и повышение уровня глюкозы обратного захвата 8. В этом "стерильном" микросреды, это было возможно совместное культивирование пробиотик лактобактерии рамнозус GG или терапевтическое образование пробиотической бактериальной смеси с хозяина эпителиальных клеток в течение двух недель 5,10.

В данном исследовании мы описываем подробный протокол для выполнения хост-кишечную микробиомом совместного культивирования в устройстве кишка-на-чипе в течение длительного периода. Кроме того, мы обсудим важнейшие вопросы и потенциальные проблемы, которые будут рассматриваться для широкого применения этого хозяина-микробиомом сокультуры рrotocol.

протокол

1. микротехнологий из устройства Gut-на-чипе

Примечание: а-чип кишки на это Микрожидкостных устройство, сделанное прозрачной, газопроницаемая силиконового полимера (полидиметилсилоксана, PDMS), содержащий два параллельных микроканалов (1 мм длина ширина х высота 150 мкм х 1 см), разделенных гибкой пористый (диаметром пор 10 мкм, 25 мкм , с расстоянием между порами до поры) PDMS мембраны 5,9. Изготовьте кишка-на-чипе (рисунок 1А, слева) , следуя инструкциям на странице .

  1. Процедура микротехнологий от Gut-5,9 на чипе.
    1. Готовят неотвержденных дегазированного PDMS путем смешивания форполимера PDMS и отвердитель (15: 1 вес / вес), и поместите его в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин.
    2. Залить 30 г и 3 г нелеченых, дегазированной PDMS на каждую силиконовум форму, которая имеет СУ-8 micropatterns на основе верхних и нижних микроканалы кишки-на-чипе, соответственно. Затем отверждение при 60 ° С в сушильном шкафу в течение по лвосток 4 ч.
    3. Выемки верхний и нижний слои PDMS из каждой кремниевой формы путем разрезания вокруг края с помощью хирургическим скальпелем. Удар 6 отверстий (два входа, два выхода и два вакуумных камер) с помощью перфоратора биопсии (2,0 мм в диаметре отверстия).
    4. Приготовьте пористую мембрану путем заливки 10 г нелеченых и дегазированной PDMS на силанизированном кремниевой пластины, содержащей почтовые массивы с круглыми столбами (10 мкм в диаметре, высотой 25 мкм), наложенной с плоской, силанизированы опорный слой PDMS (15: 1, W / вес, толщиной 1 см). Поместите 3 кг веса прижимного на установке и вулканизации полимера при 60 ° С в течение 12 часов или дольше.
    5. Выемки установку пористой мембраны PDMS приклеен к опорной плите PDMS из кремниевой пластины, осторожно поднимая угол плиты от пластины, и слезать, пока пористая мембрана PDMS полностью не отделяется от пластины.
    6. Выставляют сторону канала верхнего слоя (PDMS, 15: 1, вес / вес) и пористой стороне мембраны к плАсма генерируется портативном коронного пропиточной машине в течение 1 мин и 3 сек, соответственно.
    7. Поместите плазменной обработки поверхности пористой мембраны PDMS и верхний слой микроканалов в конформном контакте, помещая каждый фрагмент параллельно без каких-либо воздушных пузырьков.
    8. Выдержите всю установку при 80 ° CO / N для необратимого связывания двух PDMS слоев.
    9. Лупиться слоя поддержки PDMS из сборки верхнего слоя с пористой мембраной, осторожно поднимая угол опорного слоя, и отслаивание, пока опорный слой не будет полностью отделена от верхнего слоя с мембраной.
    10. Оторвите части этой мембраны, расположенной над вакуумными камерами (двумя камерами, расположенные по обе стороны от основного канала) с помощью тонкой кончик пинцетом, чтобы сделать полые вакуумные камеры.
    11. Выставляют сторону с мембраной, прикрепленной к верхней части и на стороне с каналами выгравированными на нижней части плазмы в таким же образом, как описано Iп шаг 1.1.6 в течение 1 мин.
    12. Выравнивание верхнего слоя микроканальной с пористой мембраной, а нижний слой с конформного контакта, помещая каждый фрагмент параллельно без каких-либо воздушных пузырьков под стереоскоп.
    13. Cure всю установку в сухой печи при 80 ° CO / N для получения полной шкалы кишки на чипе микрожидкостных устройство, содержащее два полых вакуумные камеры рядом с каналом микрожидком клеток.
  2. Подключение трубки к входному отверстию и на выходе из каждого порта, связанного с верхним или нижним микроканалы в кишечнике-на-чипе через 90 ° согнутой из нержавеющей стали с тупым концом иглы.
  3. Подключите трубку к отверстиям, связанных с использованием вакуумных камер 90 ° согнутую из нержавеющей стали тупым концом иглы.
  4. Стерилизация микроканалов и трубки пропусканием 70% (об / об) этанола с использованием 1 мл стерилизованные одноразовый шприц.
  5. Иссякнуть микроканалов и трубки в 60 ° C сухой печи O / N.

2. Рост микродвигательEred ворсинок кишечника в устройстве Gut-на-чипе

  1. Семенной эпителиальные клетки кишечника (например , Сасо-2BBE) на Gut-на-чипе микроустройство. 5,9
    1. Стерилизация устройство с 70% (об / об) этанола (этап 1.4) с использованием 1 мл стерилизованной одноразовый шприц с последующей сушкой в ​​сушильном шкафу O 60 ° C / N (этап 1.5) до активации поверхности.
    2. Выставляют полную установку ТВО-на-чипе микросистемы (т.е. тело кишка-на-чипе , соединенного с трубкой) УФ - излучения (253,7 нм) и озона одновременно в течение 40 мин.
    3. Охладить прибор при комнатной температуре в течение 15 мин под УФ-светом в кабинете биологической безопасности (BSC).
    4. Введем 100 мкл ЕСМ покрытия находить оптимальные решения в смесь 50 мкг / типа мл коллагена и 300 мкг / мл внеклеточного матрикса смеси разведенной в бессывороточной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), - в верхней и нижней микроканалов с помощью одноразового использования , стерильный шприц емкостью 1 мл.
    5. Инкубаторыт.е всю установку в 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 ч.
    6. Дега 50 мл подогретого (37 ° С) полной культуральной среде (DMEM, 20%, об / об, фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина; на аликвоты в 3 мл одноразовый шприц) с использованием системы фильтрации 50 мл (0,45 мкм размер пор) в КБС в течение 1 мин.
      1. Пропускают подогретого среды через систему фильтрации и нажмите аккуратно на фильтруемой среды в течение 1 мин для удаления пузырьков воздуха или газа, растворенного в среде.
    7. Поместите аликвоты дегазированной полной среды в 3 мл одноразовый шприц и инкубировать при 37 ° С увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 ч.
    8. Подключить два 3 мл одноразовые шприцы, содержащие дегазированной, предварительно нагретом полной культуральной среде верхней и нижней микроканалов.
    9. Поток Дегазированную полная среда для культивирования клеток в верхнюю микроканале с помощью шприцевого насоса в объемномскорость 30 мкл / ч потока (эквивалент напряжения сдвига на 0,02 дин / см 2) при 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубатор O / N.
  2. Формирование Microengineered Сасо-2 в Вилли Gut-на-чипе.
    1. Использование клеток Сасо-2BBE с числом пассажей в диапазоне от 50 до 65 лет.
    2. Рост клеток Сасо-2 в Т75 колбу , содержащую полную культуральную среду в 37 ° C увлажненный 5% CO 2 инкубаторе в течение 4-5 дней , чтобы получить полностью вырожденные клетки.
    3. Добавьте 10 мл Ca 2+ и Mg 2+ -бесплатно PBS , чтобы полностью сливающихся клеток Сасо-2 выращивали в колбе Т75, промыть клетки, а затем аспирата из PBS. Повторите этот шаг дважды.
    4. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсин / ЭДТА и инкубировать в 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубаторе в течение 5 мин.
    5. Ресуспендируют диссоциированных клеток с 10 мл подогретого полная среда для культивирования клеток (с FBS) с помощью пипетки вверх и вниз от трех до пяти раз.
    6. Спин вниз клеточной суспензии на сentrifugation при 500 мкг в течение 5 минут, затем удалите супернатант.
    7. Ресуспендируют снова с 1 мл предварительно нагретого полной среды для регулирования плотности клеток в ~ 1,5 × 10 5 клеток / см 2 в устройстве. С помощью гемоцитометра для оценки плотности клеток.
    8. Настоять 100 мкл ресуспендировали клеток Сасо-2, в верхней микроканале (Просвет сторона), помещая 1 мл шприц одноразового прикрепленный к 25 G5 / 8 иглы на выходе из трубки соединена с верхним микроканала.
    9. Зажмите все входы и выходы из трубки, соединенные с верхними и нижними микроканалов с использованием связующих клипов.
    10. Инкубируют всю установку в 37 ° C, увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 часа , чтобы дать диссоциированных клеток Сасо-2 , чтобы прилипать к поверхности пористой мембраны.
    11. Удалить зажимы и возобновить подачу культуральной среды только к верхней микроканале при 30 мкл / час при помощи шприца до тех пор, пока клетки не образуют интактный монослой в течение 24-36 часов. Использование фазовых контраст или дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии для подтверждения межклеточных соединений в клетке монослоя.
    12. Когда клетки образуют монослой, обрызгивать культуральной среды в обоих верхних (просвет) и нижней (капилляра) микроканалов при той же скорости потока 30 мкл / ч.
    13. Применение механических деформаций , имитирующих перистальтику подобных движений 5,9.
      1. Включите вакуумный насос, снабженный натяжного оборудования.
      2. Соедините вакуумные камеры с вакуумным контроллером с помощью трубки с разъемом из нержавеющей стали.
      3. Установить растяжку движение 10% среднего клеточного штамма на частоте 0,15 Гц с режимом циклической синусоидальной функцией от управляющего программного обеспечения вакуума, а затем нажмите кнопку "Пуск".
    14. Поддержание постоянного потока культуральной среды (30 мкл / ч), в верхней и нижней микроканалов к вырожденным Сасо-2 монослоя под действием механических деформаций (10%, 0,15 Гц) в течение ~ 100 ч.
      Примечание: Сасо-2 клетки Sponновременно подвергаются ворсинок формообразование с волнистой 3D проекции , оказанный просвет эпителиальной микроканале 5,8-10.
  3. Для имитации функций органа на уровне живого человеческого кишечника с просветом капилляра интерфейс ткани в кишечнике-на-чипе 10, выполните следующие действия , как описано.
    1. Grow microengineered Сасо-2 ворсинки, повторяя шаги от 2,1 до 2,2.
    2. Поток предварительно подогретой совместно культуральной среды (смесь полного Сасо-2 клеточной культуральной среды и полной HMVECs культуральной среды, 1: 1 об / об) к верхней и нижней микроканалов при 30 мкл / ч.
    3. Представьте 100 мкл диссоциированных нормальных человеческих капиллярная микрососудистых эндотелиальных клеток (HMVECs конечна плотность клеток, ~ 5,0 × 10 5 клеток / см 2) в нижнее микроканале по идентичным способом , описанным в шагах от 2.2.3 до 2.2.9.
    4. Поместите отвержденного прямоугольный кусок PDMS (0,5 см х 1 см х 1 см, ширина х высота х длина; 15: 1, ш/ вес эластомера: отвердитель) на верхней части устройства кишка-на-чипе, затем переверните установку устройства весь вниз головой (то есть, верхняя Микроканал лица к нижней стороне, а нижняя Микроканал лица к верху).
    5. Выдержите установки в 37 ° C, увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 часа , чтобы позволить Диссоцииро- HMVECs прилипать к поверхности пористой мембраны , в нижней части микроканала.
    6. Выньте всю установку из CO 2 инкубатора и переворачивания установку снова.
    7. Поток подогретого совместно культуральной среды (смесь полного Сасо-2 клеточной культуральной среды и полной HMVECs культуральной среды, 1: 1 об / об) в верхней и нижней микроканалов при 30 мкл / ч с механическим простирающихся движений ( 10%, 0,15 Гц) в течение не менее трех дней, чтобы сформировать межклеточных сочленений эндотелиальной монослоя.

3. Хост-выпотрошить микробиомом Совместное культивирование в микроустройство Gut-на-чипе

  1. Выполнение предварительной культуры ое бактериальные клетки, как следует взаимодействовать культуры синантропных кишечника микробиомом на microengineered ворсинок кишечника.
    1. Ресуспендируют лиофилизированный пробиотический бактериальный порошкообразной смеси в 10 мл смеси (1: 1, об / об) автоклавного лактобацилл MRS бульоном и Обогащенную среду клостридий.
    2. Регулировка конечной плотности клеток приблизительно до 0,2 единиц оптической плотности (при 600 нм) путем добавления соответствующего количества среды, а затем аликвоты 3 мл микробной клеточной суспензии в 10 мл одноразовой стерильной пробирке.
    3. Место пробирки, содержащие ресуспендировали микробных клеток в анаэробном контейнере. Добавьте две пачки анаэробного газогенерирующей саше в контейнере. Закройте крышку контейнера плотно и инкубировать установку контейнера без встряхивания при 37 ° C увлажняются 5% СО 2 инкубатора O / N.
  2. Прививка микробиомом и Co-культуры с эпителиальные клетки кишечника 5,10.
    1. Подготовьте 3 мл одноразовые шприцы, содержащие дегазированной antibiotiC-свободной среда для культивирования клеток (т.е. DMEM с 20% FBS). См 2.1.6 для процедуры дегазации культуральной среды.
    2. Выньте всю установку устройства кишка-на-чипе , содержащем microengineered ворсинки из СО 2 инкубатора, а затем перейти к шкафу биологической безопасности.
    3. Удалить шприцы, подключенные трубок, связаны с верхним и нижним микроканалов. Подключите шприцы , подготовленные в разделе 3.2.1 к устройству, чтобы вернуть к CO 2 инкубаторе, а затем течет этот антибиотик культуральной среды в течение 12 ч до посева микробиомом.
    4. Спином вниз предварительно культивированных клеток пробиотических бактерий смесь (см действия, описанные в разделе 3.1) при 10000 мкг в течение 5 мин. Отберите из надосадочной жидкости с использованием вакуума, а затем вновь суспендируют в антибиотической свободной DMEM среде (конечная плотность клеток, ~ 1,0 × 10 7 КОЕ / мл).
    5. Настаивать суспензии клеток в просвете сторону микроканала, содержащего "стерилен" кишечные ворсинки с использованием 1 мл шприц одноразового присоединенный к 25G5 / 8 иглы. Разрешить адгезию микробных клеток к апикальной поверхности кишечных ворсинок в течение ~ 1,5 ч без потока с помощью зажима, чтобы полностью конца насосно-компрессорных труб.
    6. Заливать подогретого антибиотику культуральной среды в верхней и нижней микроканалов при 40 мкл / ч с циклическими ритмических деформаций (10%, 0,15 Гц).
    7. Для совместного культивирования зеленого белка флуоресценции (GFP) меченных E. coli (GFP E.coli; Непатогенные DH5-альфа кишечной палочки хозяева) 10,11 клетки с microengineered ворсинок, предварительно культивируют Е. GFP Клетки палочки в среде LB автоклавного при 37 ° C при встряхивании условию (200 оборотов в минуту) в течение 12 ч. Повторите процедуру , начиная с 3.2.5 до 3.2.6 осуществлять совместное культивирование E. GFP Клетки палочки с microengineered ворсинок.
  3. Image Клетки 5,8-10
    1. Выполните DIC, эпифлуоресцентной или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для записи микробные и эпителиальной морфологии 5,8,10.
      1. Для визуализации DIC, вынимают установку кишка-на-чипе микросистемы из CO 2 инкубатора, место установки устройства на этапе микроскопа, а затем запись морфологии клеток.
      2. Для флуоресцентной визуализации ворсинок эпителия, поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        1. Закрепить ворсинки с 4% (вес / объем) параформальдегидом в течение 15 мин. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        2. Проницаемыми ворсинки с 0,3% (об / об) Тритона X-100 в PBS, разбавленный, содержащей 2% (вес / об) альбумина бычьей сыворотки (BSA) в течение 10 мин. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        3. Блокбоксов с помощью 2% (вес / объем) раствора БСА в PBS в течение 1 часа. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
        4. Добавьте 300 нМ 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид раствор (DAPI), разведенного в PBS для ядерного окрашивания под действием света защиты.
        5. Добавьте 25 ед / мл флуоресцентного фаллоидином(Фаллоидином-CF647 конъюгат), растворенного в PBS для F-актина окрашивания под легкой защитой.
        6. Запись изображений флуоресцентно окрашенных клеток с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
          Примечание: Цель 25X была применена с соответствующим оптическим зумом во время конфокальной микроскопии. На фигуре 3B, использовали около 525x увеличения.

Результаты

Для имитации человеческого кишечника хозяина-микробиомом экосистемы в пробирке, то Необходимо разработать экспериментальный протокол для восстановления стабильного долгосрочного сотрудничества культуры кишечных бактерий и эпителиальных клеток кишечн...

Обсуждение

Понимание хост-микробиомом взаимодействия имеет решающее значение для продвижения медицины; Тем не менее, традиционные модели клеточных культур , выполненные в пластиковом блюде или статичным луночного планшета не поддерживают стабильное совместное культивирование клеток кишечник...

Раскрытие информации

Donald E. Ingber is a founder of Emulate Inc., holds equity in the company and chairs its Scientific Advisory Board. The other authors have no financial disclosures.

Благодарности

We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPESGibco10564-011Warm it up at 37 °C in a water bath.
Difco Lactobacilli MRS brothBD288120Run autoclave at 121 °C for 15 min.
Poly(dimethylsiloxane)Dow Corning3097358-100415:1 (w/w), PDMS : cureing agent
Caco-2BBE human colorectal carcinoma lineHarvard Digestive Disease CenterHuman colorectal adenocarcinoma 
Heat-inactivated FBSGibco10082-14720% (v/v) in DMEM
Penicillin-streptomycin-glutamineGibco10378-0161/100 dilution in DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMolecular ProbesD1306Nuclei staining
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml)Biotium00041F-actin staining
Flexcell FX-5000 tension systemFlexcell International CorporationFX5KPeristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency)
Inverted epifluorescence microscopeZeissAxio Observer Z1Imaging, DIC
Scanning confocal microscopeLeicaDMI6000Imaging, Fluorescence
UVO CleanerJelight Company Inc342Surface activation of the gut-chip
Type I collagen GibcoA10483-01Extracellular matrix component for cell culture into the chip
MatrigelBD354234Extracellular matrix component for cell culture into the chip
1 ml disposable syringeBD309628Cell and media injection stuff
25 G 5/8 needleBD329651Cell and media injection stuff
Syringe pumpBraintree Scientific Inc.BS-8000Injection equipment into the chip
VSL#3Sigma-Tau Pharmaceuticals7-45749-01782-6A formulation of 8 different commensal gut microbes
Reinforced Clostridial MediumBD218081Anaerobic bacteria culture medium
GasPak EZ Anaerobe Container System with IndicatorBD260001Anaerobic gas generating sachet 
4% paraformaldehydeElectron Microscopy Science157-4-100Fixing the cells for staining
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Permeabilizing the cells
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7030Blocking agent for staining of the cells
Corona treaterElectro-Technic ProductsBD-20ACPlasma generator for fabrication of the chip
Steriflip MilliporeSE1M003M00Degasing the complete culture medium
Disposable hemocytometeriNCYTODHC-N01For manual cell counting

Ссылки

  1. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  2. Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
  3. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  5. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
  6. Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
  7. Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
  8. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
  9. Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
  10. Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
  11. Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
  12. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
  13. Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
  14. Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
  15. Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  16. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  17. Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

114Comicrophysiological

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены