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要約

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.

要約

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

概要

短距離代替アクセプタまたはドナー部位が互いに近接している（タンデム）選択的スプライシングは、哺乳動物1、脊椎動物2植物3で一般的です。哺乳動物遺伝子の20％が2~12ヌクレオチド離れ4の代替スプライス部位を含有すると推定されます。これらのサイトの多くは、3ヌクレオチド離れており、単一のコドンの包含または除外になります。いくつかは他の人が組織特異8に基づいて規制を推測しながら、スプライシングモチーフ違いは、選択が確率的7になるように微妙であることを主張してこれらのサイト5,6でスプライシング調節の性質についての議論があります。

タンデムスプライス部位の選択が変更されたキャピラリー電気泳動7、及び高分解能ゲル電気泳動8を用いて半定量的に分析しました。 RNA-SEQ（RNA配列）の各スプライスでスプライシング比率を定量化するために使用することができる読み出しサイト。このように、RNA-のSeqデータは、タンデムスプライス部位9の規制への洞察を提供してきました。それはまた、ヌクレオチドモチーフ10に基づいて予想されるスプライスバリアント比の予測を可能にしました。単一コドンを含むか、または除外スプライシングを重視のほとんどは、より一般的に（Nは任意のヌクレオチドを=）NAGNAGsとして知られているタンデムアクセプタースプライス部位を、発生にされています。

（Yはピリミジン= GYNGYN認識モチーフを、）を含む、または単一のコドンを除くタンデムドナー代替スプライス部位は、タンデム受容体よりも一般的です。転写因子3（STAT3）のシグナルトランスデューサーおよび活性化剤は、タンデムドナーオルタナティブスプライシング1,11を受けるキー遺伝子です。タンデムドナースプライス部位は、エクソン21と22を結合し、セリン-701（SまたはΔSそれぞれ）1,11のコドンの包含または除外になります。エクソン22を接合し、下流の代替アクセプター部位（互いに離れた40ヌクレオチド）とトランス活性化ドメイン（α）または7ユニークなC末端残基と切り捨てられたトランス活性化ドメイン（β）11の55末端残基のいずれかを含めることで23A / Bの結果。したがって4つのスプライスバリアントが可能です。

STAT3タンパク質は、多数の細胞型12の転写因子と主要な信号積分器であり、変異した場合、その構成的活性化は、（参照13に概説）は、いくつかの癌表現型に寄与する。ヨブ症候群、IgEの高レベルによって特徴付けられる免疫不全障害は、また、STAT3（参照14で検討）の変異によって引き起こされます。 STAT3のαおよびβスプライスバリアントタンパク質のための明確な役割は、以前に15を説明してきました。最初は、STAT3βは、STAT3のαの転写活性を拮抗、ドミナントネガティブ様式16に作用すると考えられたが、その後の仕事は、それが独立した標的遺伝子17を有していることが示唆されましたアップ。タンデムスプライシングの繊細さにもかかわらず、セリン701（Ser701）の影響機能の有無を信じる理由があります。だけでなく、Ser701は、チロシン705（STAT3活性化18においてリン酸化残基）に近接しているが、最近の研究では、STAT3 SとΔSスプライスバリアントは、STAT3-中毒びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBLCL）の生存能力の両方が必要であることを示唆しています細胞19。生物学的関連性が検討されていません。スプライスバリアント組成物は機能に影響を与える可能性があることを考えると、我々は比は、好酸球にサイトカイン刺激によって乱されたかどうかを発見するために努めました。

私たちは、最初にSのスプライスバリアント、AfeIのための特定の制限酵素での製品の切断に続いて、STAT3の αとβのスプライスバリアントのためのPCRの特定を使用して、2つのスプライシング事象間の連携を模索しようとしました。製品のデンシトメトリーは、Ser701の包含をrであることを示しましたoughly 10倍、より一般的なSTAT3の αとβの両方でその不作為（ΔS）よりも（データは示さず）。しかし、この半定量的アプローチは十分に再現性がなかったし、同時に4つのすべてのスプライス変異体を測定するために効果的に使用することができませんでした。 4スプライス変異体の各々の割合を分析するためには、厳しい技術的（所定のサンプルのいくつかのアッセイ）を得た定量的PCR（定量PCR）プロトコル複製を確立する必要がありました。

相対定量PCRは、特定のレベル20で発現することが知られている標準またはハウスキーピング遺伝子を目的の遺伝子の比較に依存し、関心とハウスキーピング遺伝子の遺伝子が同様の効率で増幅されるときに適切です。ダブル本鎖（ds）DNA結合蛍光（シアニン）染料は、PCRアンプリコン21に結合し、サイクルの特定の番号の後に、十分な増幅が検出可能で蛍光を発生しました。初期レベルが高いです転写産物のより低い閾値サイクル（Ct）値。 cDNA調製物の濃度が異なるので、一つは好酸球22内グルクロニダーゼβ（GUSB）のように、全てのサンプルで一貫したレベルで発現することが知られている転写産物の濃度のトランスクリプトの濃度を比較する必要があります。

相対定量PCRは、タンデムスプライシングから生じるスプライス変異体に見られるように、非常に類似する配列のために不可能です。具体的スプライス変異体を増幅するために必要なストリンジェントな条件は、効率低下をもたらします。その代わりに、絶対的定量は、23を使用する必要があります。これは、関心のスプライスされた転写物の既知濃度の標準曲線を作成し、PCR条件は、特異性24を最適化確保伴います。説明したように、特定の遺伝子の絶対及び相対定量PCRデータはで、特定の細胞型における遺伝子の発現の理解を通知するためにマージすることができこの場合、種々の刺激好酸球におけるSTAT3 25。

本明細書において、STAT3スプライス変異体の定量は、方法は、他のタンデムスプライシング事象の標的研究に適合させることができることを期待して説明します。最適化は、様々な濃度とサイクリングパラメータの多数の反復でいくつかのプライマー対は、数ヶ月にわたって試験した長いプロセスでした。プロトコルの主な機能は、スプライスバリアントの既知濃度の標準曲線に基づいて、プライマー特異性の検証と定量化されています。一緒に相対定量PCRは、我々のアプリケーションのために有用証明したが、必要はありません。

プロトコル

注：末梢血好酸球は、健康科学治験審査委員会のためにウィスコンシン大学マディソンセンターの大学（＃2013から1570）承認されたプロトコルに従って、情報を特定せずに受信されました。ドナーから署名されたインフォームドコンセントは、研究中の各サンプルの使用のために得られました。

1.テンプレートの基準としてプラスミドを作成します

  1. 表1aあたりとして5'- をKpnIおよびNheI制限部位（5'-拡張子）で、両方のSTAT3スプライス部位にまたがるアンプリコンのためのプライマーを作成します。
    注： のKpnIおよびNheI部位を、カナマイシン耐性25,26と修正されたPET-28Aベクター中に連結される挿入を可能にするために選択されたKpnI部位は、マルチクローニングサイトに追加されていました。
  2. 細胞培養培地中に2.5×10 6細胞/ mlの複製サンプルを準備し、新たに寄贈好酸球を使用して（ロズウェルパークメモリアリットル研究所（RPMI）1640培地）。 5％CO 2および10％湿度下で37℃で1時間インキュベートします。
    1. RNA抽出およびcDNA合成キットを使用してあたり、製造業者の説明書のようにサンプルからの相補的（c）のDNA（調製あたり少なくとも1×10 6細胞）を準備します。
  3. ステップ1.2.1で調製した鋳型cDNAから増幅STAT3スプライスは、 表ごとに図2aとして増幅PCRを用いて変異体です。
  4. 2％アガローストリス-酢酸、エチレンジアミン四酢酸（TAE）ゲル27内のアンプリコンを解決します。消費税ゲルからバンドとゲル切除キットの説明書に従って精製します。
  5. ボリューム、インキュベーション時間および温度を使用して、適切な制限酵素（参照27における制限の概要）、とカットアンプリコンプラスミドは、酵素プロバイダによって推奨します。ステップ1.4のように精製します。プロバイダの推奨条件でプラスミドに制限されたアンプリコンを連結。
  6. 負の続きを準備ROL（インサートを含まないが、リガーゼを用いて制限されたプラスミドDNA）およびポジティブコントロール（カナマイシン耐性を持つ無制限プラスミド）。コンピテントE.の標準的なプラスミド変換を実行ライゲーション混合物27を使用して大腸菌 DH5α28。
  7. 形質転換されたE.インキュベート 37℃で1時間振とう（27指示されるように調製）を1mlのルリア・ブロス（LB）培地中で大腸菌 。 50μg/ mlのカナマイシンを含有するLBプレート上で形質転換体を広げ、37℃で一晩インキュベートします。
  8. 滅菌爪楊枝27を使用して、STAT3の αおよびSTAT3の β版からいくつかのコロニーを選択してください。 2ミリリットルのLBにそれぞれの転送振盪インキュベーター中で37℃で一晩培養物を成長させます。
  9. DNA精製キットの指示に従うことにより、細菌の培養物からプラスミドを精製します。 -20または-80℃で保存プラスミド。
  10. シーケンスは、20μlの配列決定反応を調製することにより、いくつかのコロニーからプラスミド。ピペット3μlのシークエンシング反応バッファー、2μlのシークエンシング反応ミックス、12μlの超純水、テンプレートと2μlのシークエンシングプライマーとして1μlのプラスミド。
    注：PET-28Aベクターを使用している場合、「配列決定プライマー5'-TAA TAC GAC TCA CTAタグGGG-3を使用します。
    1. Sα、Sβ、ΔSαとΔSβ25：各変異体をコードするプラスミドのelectrophoretogramsを評価します。
  11. NG /μlの中で純粋なプラスミドDNAの測定濃度。分光光度計を用いて260nmで吸光度を読み取る場合は、ランベルト・ベールの法則29を使用して、DNAの濃度を計算します。
    figure-protocol-2137
    ここで、c =濃度、A =吸光度、ε（吸光係数）= 0.02（/ mlの）-1 cm -1 で二重鎖DNAとの光L =光路長（通常1センチ）のために。
  12. STAT3スプライスバリアントのcDNA AMの分子量を使用してpliconsおよびベクターは、1μl当たりのコピー数を計算します。
    注：塩基対（bp）の1個当たりの分子量が650ダとして推定されます。
    figure-protocol-2482

2.絶対定量PCR用のプライマー特異性を分析します

  1. 超純水を使用して、1μl当たり〜8月10日から3月10日までコピー（20μl）を用いて、STAT3プラスミドの10希釈系列に1を準備します。最も集中の測定濃度（1μl当たり〜10 8コピー、ステップ1.11を参照してください）。
  2. 4つの「非標的」ミックスを準備するために希釈されたプラスミドを使用してください（ すなわち 、STAT3Sα、ΔSα、Sβが、無ΔSβの等しい濃度を含むSTAT3ΔSβネガティブコントロール）各1μl当たり10 6コピーで。 1μl当たり10 6コピーにすべての4つのテンプレートそれぞれの等濃度で「ターゲット」ミックスを調製します。
  3. プライマー対溶液を調製します7μMの濃度で、プライマーの〜60μlの各することにより、各スプライスバリアント（ 表1bおよび図1を参照）（試料中の最終濃度は560 nMのであろう）のための。
  4. 純粋なH 2 Oで5：DNAポリメラーゼ/二本鎖DNA結合色素ミックス7を希釈
  5. テンプレート（ 表3）に示すように、96ウェルPCRプレートにアッセイ1を設定します。
    1. DNAポリメラーゼ/二本鎖DNA結合色素ミックス希釈21μL、その後プライマーミックス2μlのと（ 表2bあたりなど）テンプレートの2μLを加えます。代わりにテンプレートの、よく鋳型なしコントロール（NTC）にH 2 Oフィルタリング2μlを添加します。再現性30を評価するために、重複での反応を設定します。
  6. 接着カバーと12℃で1200×gで5分間遠心分離器とシールのqPCRプレート。
  7. 記載されているように材料に記載されているソフトウェアを使用する場合は、実験を設定します。
    1. 定量PCR機の電源を入れ、密封された定量PCRプレートを挿入します。 [ファイル]をクリックします＆＃62; [新規作成]> [次へ>、「新しい検出器」を選択してレポーターを選択し、クエンチャーと名前を入力します。各スプライスバリアントのための「新しい検出器」を設定します。
    2. 量を確保し、[次へ]を選択し、設定サンプルプレートページに促されるような基準を設定するには、表に入力され、適切な検出器が選択されています。 [完了]をクリックします。
    3. 表2bごとにサイクリングを設定します。 （CTを決定するために）、その蛍光が読んで確認し、各サイクルの72℃のステップの間に起こります。ファイル名を指定して実行]を選択します。
    4. 実行が完了すると、[結果]タブ>増幅プロット]タブをクリックします。 （ 図2のように 、指数関数のプロットを探してください）データの品質を評価するための出力増幅プロットを評価します。
      注：確認増幅プロットは、ほとんど指数関数、サイクル閾値はプロットの指数部に設定することができるということです。 NTCはが増幅されていないことを確認し、他の標準的なポイントが高いΔRnと低いCt値を示しています。
    5. EXPへortがファイル]> [エクスポート]> [結果]をクリックし、表計算ソフトになります。

3.絶対定量PCRアッセイ特異性と再現性を評価します

  1. 再現性
    1. CT（蛍光のための閾値サイクル）値の標準偏差を計算するステップ2.7.5からのデータを使用してください。
      figure-protocol-4431
      ここで、N =サンプル数（2連で行われていれば）、 figure-protocol-4531 =サンプルのCTおよびfigure-protocol-4611 =サンプルCtが意味します。重複のCt値の標準偏差が≤0.2であることを確認してください。すべてが、NTCウェルにおけるCt値が38よりも小さいことを確認してください。
    2. 再現性は増加または減少アニール時間によって貧しい最適化サイクルパラメーターである場合。
  2. しびれプロットログ・コピーER（ステップ1.12で決定し、ステップ2.1で調製した）Ct値対 標準曲線を作成します。以下の式が得られます。
    figure-protocol-4951
    yがコネチカットここで、mは勾配であり、xは 、ログ（コピー数）であり、Bは切片値です。
    注：線形回帰のR 2値は、良好なデータのために≥0.95となります。
  3. 標準曲線と式を用いて増幅効率を計算します。
    figure-protocol-5187
    注：効率≥75％を目指します。
  4. あまりにもの式を用いて定量PCRアッセイ1から特異性を計算します。
    figure-protocol-5319
    ここで、Δ のCt すぎる = たCt 標的 -特異的および非特異的なアンプのための閾値サイクル数の差を説明するCt 非ターゲットlification
    注：特異性は、4桁を超えている必要があります（ すなわち 、特異性因子を≥4。）。
    1. 特異性が悪い場合には、プライマー濃度を低下させることによって最適化します。 100〜500nmの範囲の最終プライマー濃度と（ステップ2.5から2.7に記載されているように）アッセイを設定します。

4.相対定量PCRアッセイを行います

  1. 転写を促進するサイトカインで細胞を処理します。
    1. 新たに寄贈好酸球は、細胞培養培地中2.5×10 6細胞/ ml（RPMI 1640培地）の複製サンプルを準備し、（50 ngの/ mlのインターロイキン3（IL3）、および/または50 ngの/ mlの腫瘍壊死因子αで処理5％CO 2および10％湿度下で37℃で3、6、9、20時間の期間TNFα）。
  2. RNA抽出およびcDNA合成キットを用いて、製造元の指示に従って、好酸球のサンプル（準備あたり少なくとも1×10 6細胞）からcDNAを準備します。
  3. 「1」から「1024年における1「希釈に希釈範囲で、2つのサンプルのcDNAアリコート（制御または安静時のサンプル）の連続希釈液を調製します。
    1. 1 4で希釈、ピペット1μlのcDNA及び3μlの超純水のため。
    2. 1 16で希釈するために、1のピペット1μlの4希釈し、3μlの超純水などで
  4. （ 表4のテンプレートを参照してください）2.3から2.5まで説明したステップとしてではなく、パンSTAT3およびGUSBのためのいくつかのプライマー濃度で25μlの反応を96ウェルプレートにPCRを設定します。
  5. GUSBは、「新しい検出器」を追加して、 表2cに記載サイクリングパラメータを使用して、手順2.6から2.7に従ってください。
  6. 濃度は95から100パーセントの増幅効率につながるどのプライマーを決定する（ステップ3.2と3.3を参照してください）標準曲線を生成します。
  7. （ステップ4.2）から調製したcDNAサンプルおよび最適化されたプライマー濃度でプレートを設定します（サイクリングパラメータ、試薬および表5に 、96ウェルプレートテンプレートの表2Cを参照）。
  8. 手順2.6から2.7を実行します。少なくとも一回アッセイを繰り返し、データ品質を確認してください。
  9. STAT3およびハウスキーピング遺伝子GUSBの両方に重複したサンプルのCtの平均Ct値を計算します。
  10. 各サンプルのΔCt値を取得します。
    figure-protocol-6932
  11. 各サンプルのサンプル0計算ΔΔCtを 31（ここではサンプルXとして指定）として（通常は関心の転写物の最も低い濃度を有する）のサンプルを休んで指定：
    figure-protocol-7101
  12. 各サンプルの増加倍数を計算します。
    figure-protocol-7195
  13. 再現性
    1. 汎STのためのコピー数の変動係数（CV）を計算AT3とGUSB。
      figure-protocol-7333
      ここで、N =サンプル数、=サンプルの計算されたコピー数と=標本平均。各サンプルのCV（複数のアッセイ）は≤10％であることを確認してください。

5.未知のサンプルのために絶対のqPCRデータの分析

  1. サンプル」のcDNA濃度が一桁以内であることを確認するために、ハウスキーピング遺伝子GUSBのために（ステップ4.9で説明したように）相対定量PCRで得られたCt値を比較します。
    1. 希釈cDNAはそれに応じて（ 例えば、試料1〜17.5のCt値を有し、他のサンプル「Ct値である場合〜21、サンプル1は、大きく2（21から17.5）が 11倍以上濃縮= 1行います。で1希釈必要以上に希釈せずに同じ範囲内で超純水）。
      注：非常に異なる開始濃度は（ステップ4.1を線形回帰分析を偏らます2）。
  2. サンプルの絶対定量PCRアッセイを設定します。 表6のとおりSαとSβのためのアッセイ2aのテンプレートプレートを準備します。 表7の通りΔSαとΔSβためのアッセイ2bとを準備する。ステップ2.6-2.7.3（および表2b）に記載されているようにアッセイを実施します。少なくとも一回のアッセイを繰り返します。
  3. ステップ2.7.4-2.7.5で説明したように、データの品質とエクスポートを確認してください。
  4. 汎STAT3プライマー （ 表1cの中のプライマー、 表8のテンプレート）400μMで、すべての4つのプラスミドのミックスまたは記載されている総濃度で単一のプラスミドを用いて、25μlの反応と絶対定量PCR 96ウェルプレートを設定します。
    注：効率は絶対定量PCRのために重要ではなく、これらのプライマーの効率を最適化することは、相対定量PCR（ステップ4）のために重要であるしません。
  5. 接着カバーと12℃で1200×gで5分間遠心分離器とシールのqPCRプレート。
  6. パンのための「新しい検出器」を設置-ステップのようにSTAT3 2.7.1-2.7.3。
  7. 表あたりの図2c（相対定量PCRと同じ条件）としてパンSTAT3のためにサイクリングを設定します。 （CTを決定するために）、その蛍光が読んで確認し、各サイクルの72℃のステップの間に起こります。再現性を確保するために、少なくとも一回アッセイを繰り返します。
  8. （2.7.4-2.7.5手順を参照）データ品質およびエクスポートを確認してください。
    1. 増幅プロット（ 図2参照） が指数関数でない場合は、サンプルのcDNA（1:10）希釈し（ステップ5.7）に記載のようにアッセイを繰り返します。
  9. 標準曲線の式を用いて各スプライス変異体の、各サンプル中のパンSTAT3のコピー数を計算し、サンプルのCt値（ 図3の 3.2を参照）。
    figure-protocol-9005
  10. プロットログSTAのログ（累積絶対定量PCRコピー数の値対（パンSTAT3のために得られた絶対定量PCRコピー数値）T3スプライスバリアントを）。
    注：理想的な線形回帰とスロープの値は、両方の〜1になります。
  11. 再現性（ステップ3.1）および再現性（ステップ4.13）を計算します。

6.絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

  1. 各スプライスバリアントの増加倍率を算出する総STAT3の増加倍率を有する変異体の割合を掛けます。
  2. エラーの伝播を考慮して絶対と相対値の標準偏差（ステップ3.1.1を参照）を計算します。示すように、測定の標準誤差（SEM）を決定します。
    figure-protocol-9460

結果

良質のqPCRデータは、サイクリングの過程で転写産物の指数関数的な増加を意味する、S字型増幅プロット（ 図2a）が生成されます。あまりにも多くのテンプレートが存在することは、不適切なベースラインが最初の数サイクルにおいて確立されることを意味、高い蛍光バックグラウンドをもたらすことができます。データは指数曲線（ 図2b）を提供していない場合は、さらなる最適化は（ステップ3.1および3.4に概説）が必要です。トラブルシューティングのqPCR結果の詳細については、32を参照するために参照してください。テンプレートキャリブレータプラスミドのために作成した標準曲線は、増幅の効率（ 図3に示すSTAT3Sαの曲線）が表示されます。 83と95％との間の効率は、記載した条件下で観察されました。特異性のための式（ステップ3.4）は同じ25可能性は低い効率、とても特異性を前提としてい特異性係数が示すよりも大きくなる可能性があります。

すべての4つのスプライス変異体（ 図4）に共通する領域を増幅するプライマーを用いて、STAT3レベルの一致を評価するためには、4つのスプライス変異体の各々の絶対値を測定しただけでなく、総STAT3のレベル、後者。理想的には、線形回帰（相関の指標）と傾き（加算スプライスバリアントにパンSTAT3の比率）は、両方の1に近くなければなりません。

絶対定量PCRデータは、サイトカイン（ 図5a）との時間刺激後オーバー4スプライスバリアントの割合を表示する円グラフとして表示されます。この変異体は常に最も豊富であったが一休みする好酸球（0時間）は、STAT3Sαの最小の割合を持っていました。 STAT3βスプライスバリアントの割合を乗じ（S ^6; +ΔSβ）STAT3ΔSスプライスバリアント（ΔSα+ΔSβ）の割合によっては、一貫ΔSβのための実験的に記録された値よりも低い値を示しました。スプライシング事象が独立した場合、1はΔSの割合を乗じることは実験的に決定した値と一致する値を与えるβ変異体の割合によって変異体のことを期待します。独立したスプライシング事象から予想されるよりΔSβより高いレベルの同時スプライシングバイアスが存在を示唆しています。

絶対と相対のqPCRデータをマージすると、すべてのSTAT3のスプライスバリアントのレベルはレベルが6時間刺激後（ - 電子 図5b）をピークにして、サイトカインIL-3およびTNFαで刺激後に増加したことを実証しました。 4スプライスバリアントの3のために、転写レベルは、メディアでの好酸球と比較して、IL-3 +TNFα処理された好酸球（6時間）で約3倍高かったです同じ時点で。STAT3SαレベルIL3 +TNFαで3.5倍高いが、この時点での培地中の好酸球と比較して好酸球を処理しました。最大の不確実性（測定の最大の標準誤差）は、全ての試料中の総STAT3の最小の割合を含み、ΔSβ（ 図5E）、に見られました。低いレベルは、より高いCt値に関連付けられているので、これは驚くべきことではなかったです。閾値サイクルに到達するために多くのサイクルを要求することにより、増幅効率のサイクル間の変動に不確実性を配合します。

figure-results-1914
図1：STAT3 のスプライス変異体及びパンSTAT3特にSTAT3のスプライス変異体（それぞれSα、Sβ、ΔSα及びΔSβ）の各々を増幅するために使用されるプライマーであるS の定量PCRを実行するために使用されるプライマー対の概略hown。フォワードプライマー（STAT3「S」と「ΔS」）は、エクソン21と22の間の接合部にまたがるこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2403
図 2： 定量PCRデータの増幅プロット（a）は、シグモイド増幅プロットは、信頼性の高い増幅を意味します。これらのデータは、40サイクル（x軸）にわたって重複希釈した試料の蛍光レベルを示す色付きの線の各対と、STAT3Sαを含むプラスミドの2つのシリアル希釈液の定量PCRから得ました。最も濃縮されたサンプル（緑灰色）が十分に閾値蛍光値を超えて（y軸上に示された蛍光に比例した二本鎖DNA結合色素を用いて）サイクル17で増幅した（baseli）緑色の矢印として示されネブラスカ。そのCt値は、17（b）は非指数関数プロットとなるバックグラウンドの蛍光閾値が正しく最初の数サイクルに設立されていなかったことを示唆しています。これは、阻害剤の存在下、または高度に濃縮されたテンプレートまたはプライマーである可能性があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3119
図 3： のCt 対 ログの標準曲線（STAT3Sαのコピー数 ）各STAT3スプライスバリアントのコピー数と閾値サイクル（Ct）の対数との間に直線関係が存在します。試料のcDNA及び従って、プラスミドDNAからの標準曲線を模倣作成します希釈したPCRアンプリコンから作成された曲線よりも優れた測定を提供します。提示されたデータは、STAT3Sαを含むプラスミドの2連続希釈液の定量PCRから得られたCt値です。この曲線から、（83.9％）、各試料中に存在するコピー数を補間することができ、増幅効率を計算しました。 y軸インターセプトが傾斜よりも少ない再現可能ですが、切片は42.2サイクルが全く標的DNAが存在しない特定のことが必要であろう示唆しています。エラーバーはSEMを示し、nは3匹敵する曲線はSTAT3Sβ、ΔSαとΔSβ（図示せず）のために構築した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3971
図4： 定量化されたパンの比較 累積 STAT3 スプライス バリアント 対 STAT3。追加されたSTAT3スプライスの回帰が総STAT3対の変異体は、スロープ（累積へのパンの比）と17サンプル（好酸球およびDLBCL）から1の値に近いR 2値（相関）を持つべきです含まれています。エラーバーは、x対yの測定のSEMを示し、nは、それぞれのための≥2。参照20から適応図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-4605
図5：STAT3 スプライス変異体レベルがサイトカイン処理の過程にわたって変動 （a）の各STAT3のスプライスバリアントの割合を示す円グラフIL3およびTNFαを用いた治療中の好酸球インチ（B - e）の相対的および絶対的定量PCRのデータを組み合わせることによって測定されたサイトカインの種々の組み合わせで処置した好酸球におけるSTAT3のスプライス変異体の変化、STAT3Sα（B）、Sβ（C）、ΔSα（D）、及びΔSβ（E）レベル。時間刺激後にわたって変動しました。レベルは当初、6時間刺激後をピークに達し、増加しました。 IL3 +TNFαの組み合わせは、単独のIL3よりすべての4つのSTAT3のスプライス変異体のより高い発現を誘発しました。 SEMエラーの伝播を占め各データポイントについて計算。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表1：増幅に用いたプライマーの（a）、（b） は 、絶対および相対（c）の定量的PCR。クローニングプライマーは、制限配列と効率的な切断のための5'-の拡張をしています。 をKpnIおよびNheI制限部位が太字で示されています。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表2のPCRサイクルパラメータ（左）と増幅用試薬容量（右）の（a）、相対（b）は、絶対（c）の定量的PCR。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表3：絶対定量PCRプラスミド較正アッセイのテンプレートこのアッセイは、再現性及び効率性を評価する必要があるだけでなく、データを補間するために、そこから標準曲線を生成します。 「非標的」ミックスは、特異性の推定値を与えます。最適化は、一貫性を達成する必要があるかもしれない。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表4：相対定量PCR（パン STAT3 及びハウスキーピング遺伝子 GUSB）較正アッセイ のテンプレート絶対定量PCRとは異なり、このアッセイの点は、増幅効率は約100％となる時の条件を決定することです。tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表5：パン STAT3 およびハウスキーピング遺伝子 GUSBを 測定するための相対的な定量PCRサンプルアッセイのためのテンプレート標準曲線は、アッセイの同等の効率性を確保するために、サンプルと一緒に繰り返され、この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表6：S変異体を測定するための絶対的な定量PCRサンプルアッセイのためのテンプレート標準曲線が比較EFFを確保するために、サンプルと一緒に繰り返されます。アッセイのiciency。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表7：ΔS 変異体を 測定するための絶対的な定量PCRサンプルアッセイのためのテンプレート標準曲線は、アッセイの同等の効率性を確保するために、サンプルと一緒に繰り返されている。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表8：パン STAT3を 測定 する ため の 絶対的な定量PCRサンプルアッセイのためのテンプレート 。large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

私たちは、好酸球およびリンパ腫細胞におけるSTAT3のスプライスバリアントの転写物のレベルおよび比率を評価し、サイトカイン刺激がレベル及び割合に影響を与えたかどうかを学ぶためにこのプロトコルを開発しました。 STAT3は、それが癌における腫瘍性タンパク質または腫瘍抑制因子として機能するかどうかについてのレポートを矛盾すると、理由は、その多面的かつ不確実な機能性の特に重要である（参照33に概説されています）。 STAT3のαとβのスプライスバリアント機能の違いは、以前に34,35を特徴としていた、と私たちのプロトコルは、Sの最適な比率の必要性を示唆しているノックダウン/再発現解析を容易にし、ΔSは19を転写産物。

異なるスプライス変異体の正確な定量化は、変異体組成物をスプライスする異種のSTAT3の機能に関連するさらなる調査を容易にします。プロトコルは、ABの能力を組み合わせて、絶対と相対のqPCRデータを統合します溶質のqPCRは、スプライスバリアントの割合を計算し、相対定量PCRは、全体的なSTAT3発現の変化を測定します。このアプローチは、1シーケンスの微妙な違いを区別し、同時に50以上のヌクレオチド離れた二つの代替スプライス部位でのスプライシング比を測定することができます。個別スプライシング事象の比率を決定することは、共同スプライシングバイアスがΔSβレベル2つのサイトの使用は、ランダムに25をスプライスされた場合に予想されるよりも高いことなど存在していた驚くべき知見が得られていないだろう。

批判的に、プラスミド較正曲線を用いた絶対定量PCRは非常に類似した配列を生じるスプライスバリエーションの（サブ最適な効率で）定量化を可能にします。我々は微妙なスプライシングのqPCRアッセイを最適化するために、およそ2ヶ月かかるべき小説を期待しています。アッセイ開発における重要なステップは、絶対定量PCRのための標準曲線を生成する際に使用されるSTAT3プラスミドの作成です。実験特異性および再現性を保証するために、最適なプライマー配列とサイクリングパラメータを決定します。そして、相対定量PCRデータの統合は、GAPDH発現にパン-STAT3の発現の相対定量由来します。累積定量対STAT3をパンすることによって定量コピー数の相関（Sα+ΔSα+Sβ+ΔSβ）プロトコルは、信頼性のある結果をもたらすことを示しています。

技術の注意点は、大規模な検証プロセスです。アッセイ内変動性（再現性）、アッセイ間変動性（再現性）および特異性を評価する必要があります。プロトコルは、これらのパラメータの数値の出力を取得する方法の概要を説明します。私たちは、効率性を≥75％、特異性因子≥4、変動係数（再現性）≤10％とCT標準偏差（再現）≤0.2などの適切なしきい値30とみなします。 STAT3配列のアミノ酸1から690における突然変異または欠失はdiscoveではありませんこれらはスプライシング率に影響を与えるかもしれないが、このプロトコルによって赤。トランスクリプトの割合は比率36を proteoformに比例していない可能性があります。

サンプルは全cDNAの量を開始異なっているため、絶対的な定量PCRは、確立されたハウスキーピング遺伝子を使用して相対的定量PCRに結合されていない限り、サンプル内ではなく、サンプル間の比較のためのスプライス変異体のコピー数を比較するのに適しています。この方法は、再現性30 MIQEのqPCRガイドラインに準拠します。 PCRサイクリングパラメータおよびプライマー濃度は、他の機器が使用される場合、再現データを取得するように変更される必要があるかもしれません。パーフェクト特異性は大幅に効率を犠牲にすることなく可能ではありませんが、ターゲットは桁違いの4以上のことにより、より効率的に増幅しました。

線状DNAは、より容易に、円形よりも増幅されます。代替プラスミドが良好標準曲線を提供していない場合（R 2 <; 0.95）、前定量化への単一のサイトの制限によりプラスミドを線形化することを検討してください。定量PCRを最適化する（ 図1）は、良好な品質のデータを得るために重要です。ほとんどの定量PCRプロトコルは、2ステップサイクリングに依存している、そしてマシンはそれに応じて最適化されています。加熱ブロックの不均一な加熱は、乏しい再現性に寄与する、三段階サイクルで悪化してもよいです。アッセイは、理想的には、専用の層流フード内で、フィルターピペットチップと超純水で無菌条件下で設定する必要があります。汚染物質が一貫性のない結果につながる可能性があるため、アッセイは、理想的には、専用の層流フード内で、フィルターピペットチップと超純水で無菌条件下で設定する必要があります。定量PCRの最適化の詳細については、バスティンらを参照してください。32

STAT3を定量化するコンテキストの数でより深い洞察につながる可能性があります。 STAT3の独自の表現37を自動調節し、上記のプロトコルが役立つことがありますSTAT3スプライス変異体の比率は、この正のフィードバックループを規制に貢献するかどうかを解明します。密度38または開発の過程で異なるの細胞において観察されたようなプロトコルは、スプライス変異体比の変化を研究するために使用することができる。それは、造血16中のタンパク質レベルでのSTAT3α/β比が変化することが知られています。サンディンら 。ヨブ症候群39患者のSTAT3におけるエクソン12のイントロンの単一塩基多型バイアスされたスプライシングことがわかりました。エキソン21および22、またはエクソン22と23の間のイントロン中に存在する多くのSNPのいずれかがそれぞれΔS/ Sのスプライシング比およびα/βに寄与し得ると考えられます。アッセイは、スプライシングの調節における突然変異または変化はスプライシングプロセス40にバイアスを導入することができる癌細胞におけるSTAT3の転写を定量化するために使用することができます。 observとして（SF3B1のような）スプライシング因子の変異は、骨髄異形成症候群でのED 41は、また、このプロトコルによって測定することができる変化をもたらすことができます。

より広くは、このアプローチは、具体的には、従来のRNA-のSeq、また標準的な定量PCRと現実的ではありませんスプライシングにおける共同関連を検出します。相互排他的エクソンスプライシングの現象は、スプライシングの決定の調整を示しているが、他のスプライシング事象の同時会合は、よく研究されていません。完全長cDNAを調べるように、RNAのSeqが変更された最近記載された別の方法は、以前に42思ったより遠くのスプライシング事象が複数の共依存している示唆しています。

STAT3は、ドナータンデムスプライス部位が含まれています。アクセプタータンデムスプライス部位は、43より頻繁であり、概説したプロトコルの原理はNAGNAGスプライシングと200ヌクレオチド内の他のスプライシング事象の同時検出のためのアッセイを開発するための出発点として役立つことができます。その他potenシャルアプリケーションはインデルまたはダブル/トリプル塩基多型44のような他の微妙な配列の違い、の一致の定量化を含みます。

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

著者らは、気道炎症とリモデリングにおける好酸球の役割にプログラムプロジェクト助成のための健康NHLBIの国立研究所を承認したいと思います：P01HL088584（PI：N. Jarjour）、およびウィスコンシン大学のカーボンがんセンター医学科学内資金調達のために。私たちは4 STAT3変異体をクローニングするためのダグラスアニスに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
MJ Research PTC-200 Thermal CyclerGMIN/AUsed for standard PCR
7500 Real-Time PCR SystemApplied BiosystemsN/AqPCR machine
GS-6RBeckman CoulterN/Acentrifuge for 96-well plates
Nanodrop 2000 sprectrophotometerThermoFisher ScientificN/A
RPMI-1640 mediumSigma AldrichR8758cell culture medium
PfuTurbo DNA PolymeraseAgilent Technologies600410DNA polymerase for standard PCR
KpnINew England BiosciencesR0142S
NheINew England BiosciencesR0131S
SYBR Green PCR Master MixQiagen330523qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix
Rneasy Mini KitQiagen74204RNA extraction kit
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemInvitrogen (ThermoFisher Scientific)18080-044cDNA synthesis kit
PrimersIntegrated DNA TechnologyN/A
NEBuffer 1.1New England BiosciencesB7201S
GenePure LE AgaroseISC BioExpressE-3120-500component of TAE gel
PipettorsMajor lab suppliers (MLS)N/A
Filter pipette tipsNeptune ScientificBT10XL, BT20, BT200
EU One Piece Thin Wall PlateMidSciABI7501
ThermalSeal A Sealing FilmMidSciTSA-10096 well plate seal
pET-Elmer (variant of pET-28a)Novagen; modified in Mosher labN/ADetails in PMID: 20947497
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification systemPromegaA1460Plasmid purification
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitThermoFisher Scientific4337455Sequencing kit
QIAEX II Gel Extraction kitQiagen20021Amplicon purification
DH5α competent cellsThermoFisher Scientific18265-017available from several providers, see PMID: 2162051
kanamycinResearch Products International Corp.K22000-5.0
Tris baseThermoFisher ScientificBP152-5component of TAE buffer
Acetic acid, glacialThermoFisher ScientificA38C-212component of TAE buffer
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)E-5134component of TAE buffer
Bacto TryptoneBD Biosciences211705component of Luria Broth
Bacto Yeast extract, technicalBD Biosciences288620component of Luria Broth
Sodium chlorideThermoFisher ScientificS271-10component of Luria Broth
Sodium hydroxideThermoFisher ScientificSS255-1component of Luria Broth
Bacto AgarBD Biosciences214010component of Luria Broth plate
Lasergene SeqBuilderDNASTARFigure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR)

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