Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

Resumo

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.

Resumo

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Introdução

De curto alcance (em tandem) splicing alternativo, onde os locais aceitadores ou dadores alternativas estão em estreita proximidade um do outro, é comum nos mamíferos ^1, invertebrados e plantas ^{2 3.} Estima-se que 20% dos genes de mamífero contêm locais de splicing alternativos 2-12 nucleótidos Além ^4. Muitos desses sites estão 3 nucleotídeos além e resultar em inclusão ou exclusão de um único códon. Há um debate sobre a natureza da regulação do splicing nesses locais ^5,6 com alguns argumentando que as diferenças splicing motivo são tão sutis que a seleção é estocástico ^7, enquanto outros inferir regulamento com base no tecido especificidade ^8.

Selecção do local de splicing em tandem foi analisado semi-quantitativamente usando electroforese capilar ⁷ modificado, e electroforese em gel de alta resolução ^8. RNA-Seq (sequenciação de ARN) lê pode ser usado para quantificar os rácios de splicing em cada talalocal. Desta forma, os dados de RNA-Seq tem proporcionado uma visão sobre a regulamentação dos sites de conjunto de emenda ^9. Também permitiu a previsão de rácios variante de splicing esperados com base no motivo de nucleótidos ^10. A maior parte da ênfase na emenda que inclui ou exclui um único códon tem sido sobre os que ocorrem mais comumente locais de splicing conjunto receptor, conhecido como NAGNAGs (onde N = qualquer nucleótido).

Tandem doadores locais de splicing alternativos incluindo ou excluindo um único códon (motivo reconhecimento GYNGYN, onde Y = pirimidina) são menos comuns do que aceitantes em tandem. Transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) é um gene chave passando em tandem dador de splicing alternativo ^1,11. Os locais em tandem doador de splicing juntar exons 21 e 22 e resultar na inclusão ou exclusão do codão para serina-701 (S ou Ds respectivamente) ^1,11. locais a jusante alternativas receptor (40 nucleotídeos distância um do outro) que une exons 22 e23a / b em resultado da inclusão de qualquer dos 55 resíduos do terminal do domínio de transactivação (α) ou um domínio de transactivação truncada com 7 resíduos C-terminais únicas (p) ^11. Portanto, quatro variantes de processamento são possíveis.

Proteína STAT3 é um factor de transcrição e maior integrador de sinal em numerosos tipos de células ¹² e, quando mutado sua activação constitutiva contribui para vários fenótipos de cancro (revisto em referência ^13). Síndrome de trabalho, um distúrbio de imunodeficiência caracterizado por níveis elevados de IgE, é também causada por mutações em STAT3 (revisto em ¹⁴ de referência). Papéis distintos para α STAT3 e proteínas variantes β emenda ter sido previamente descrito ^15. Inicialmente, STAT3 β foi pensado para agir de uma forma dominante negativa ^16, antagonizar a actividade de transcrição STAT3 de α, mas trabalhos posteriores sugeriram que tem genes alvo independentes ¹⁷ . Apesar da sutileza de splicing tandem, não há razão para acreditar que a ausência ou presença de Serina 701-função (Ser701) influências. Não só é Ser701 em estreita proximidade com tirosina 705 (o resíduo fosforilada na ativação STAT3 ^18), mas um estudo recente sugere que STAT3 S e Ds variantes de processamento são ambos necessários para a viabilidade do viciado-STAT3 Difuso de Grandes Células B (DLBLCL) As células ^19. A importância biológica continua a ser explorado. Dado que a composição variante de processamento pode influenciar a função, procuramos descobrir se a razão foi perturbado pela estimulação de citocinas em eosinófilos.

Inicialmente tentou explorar a ligação entre os dois eventos de splicing por PCR utilizando específica para α STAT3 e variantes de splicing β, seguido por clivagem de produtos com uma enzima de restrição específica para as variantes de splicing, S AfeI. Densitometria de produtos indicados inclusão de Ser701 foi de rminuciosa- dez vezes mais comum do que a sua omissão (Ds) em ambos os α STAT3 e β (dados não mostrados). No entanto, esta abordagem semi-quantitativa não era suficientemente reprodutível, e não pode ser utilizado eficazmente para medir todas as quatro variantes de processamento simultaneamente. Para analisar as proporções de cada uma das quatro variantes de splicing, foi necessário estabelecer um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) que produziu apertados técnicas (vários ensaios de uma dada amostra) replica.

QPCR Relativa baseia-se na comparação de um gene de interesse para um gene normal de arrumação ou conhecido por ser expresso a um determinado nível ²⁰ e é apropriado quando o gene de interesse e do gene de arrumação são amplificados com eficiência semelhante. Uma cadeia simples (DS) fluorescente (cianina) corante duplo de ligação do ADN liga-se a produtos de amplificação de PCR ^{de 21,} e depois de um certo número de ciclos, a amplificação ocorreu suficiente para fluorescência para ser detectável. Quanto maior o nível inicialdo transcrito, o valor mais baixo do ciclo limiar (Ct). Uma vez que a concentração de preparações de ADNc diferente, é necessário comparar a concentração da transcrição com a concentração de uma transcrição conhecido por ser expresso a um nível consistente em todas as amostras, como glucuronidase-β (GUSB) em eosinófilos ^22.

qPCR relativa não é viável para sequências altamente semelhantes, como pode ser visto em variantes de processamento resultantes de splicing em tandem. As condições rigorosas necessárias para amplificar especificamente as variantes de splicing resultar numa diminuição da eficiência. Em vez disso, a quantificação absoluta deve ser utilizado ^23. Isto implica a preparação de uma curva padrão com concentrações conhecidas do transcrito ligado de interesse, e que garantam condições de PCR optimizar a especificidade ^24. Como descrito, os dados qPCR absolutas e relativas de um gene particular, podem ser fundidos para informar a compreensão da expressão do gene num determinado tipo celular, emNeste caso STAT3 em eosinófilos variadamente estimulados ^25.

Nisto, STAT3 variante de splicing quantificação é descrita com a expectativa de que o método pode ser adaptado para estudos específicos de outros eventos de splicing em tandem. Optimização foi um processo demorado, em que vários pares de iniciadores em várias concentrações e numerosas iterações de parâmetros dos ciclos foram testados ao longo de alguns meses. As principais características do protocolo são validação especificidade primer e quantificação com base nas curvas padrão com concentrações conhecidas das variantes de processamento. qPCR Relativa em conjunto provou útil para a nossa aplicação, mas não é necessário.

Protocolo

NOTA: eosinófilos do sangue periférico foram recebidos sem informações de identificação de acordo com um protocolo aprovado (# 2013-1570) pela Universidade de Wisconsin-Madison Centro de Ciências da Saúde Institutional Review Board. consentimento informado assinado a partir do dador foi obtida para a utilização de cada amostra em investigação.

1. Criação de plasmídeos como modelo Standards

1. Criar iniciadores para um amplicon abrangendo ambos os locais de splicing STAT3, com 5'- sítios de restrição KpnI e NheI (e 5'-extensões), conforme Tabela 1-A.
   NOTA: Os locais Kpnl e NheI foram escolhidos para permitir inserções para ser ligado a um vector pET-28a modificados com resistência à canamicina ^25,26 local KpnI tinha sido adicionado no local de clonagem múltipla..
2. Usando eosinófilos recém doados, preparar amostras em duplicado de 2,5 x 10 ⁶ culas / ml em meio de cultura celular (Roswell Park Memórial Institute (RPMI) 1640). Incubar durante 1 hora a 37 ° C sob 5% de CO ₂ e 10% de humidade.
   1. Prepare (c) ADN complementar a partir de amostras (pelo menos 1 x 10 ⁶ culas por preparação), conforme as instruções do fabricante, utilizando a extracção de ARN e kits de síntese de cDNA.
3. A partir de cDNA modelo preparado no passo 1.2.1, amplificar STAT3 variantes de processamento usando a amplificação PCR conforme Tabela 2a.
4. Resolver amplicões em gel de agarose a 2% de Tris-acetato-etilenodiaminotetraacetato (TAE) ^27. bandas retirando-se do gel e purifica-se de acordo com as instruções do kit de excisão do gel.
5. Amplicons de corte e plasmídeo com enzimas apropriadas de restrição (visão global de restrição em referência ^27), utilizando volumes, tempos e temperaturas de incubação recomendado pelo provedor de enzima; e purifica-se tal como no passo 1.4. Ligadura amplicons restritas ao plasmídeo sob condições recomendadas pelo fornecedor.
6. Prepare uma cont negativorol (DNA plasmídeo restrito, sem inserção, mas com ligase) e um controle positivo (plasmídeo irrestrita com resistência à canamicina). Executar transformações de plasmídeos padrão de E. competente coli DH5a ²⁸ usando misturas de ligação ^27.
7. Incubar transformada E. coli em 1 ml de Caldo de Luria-forma (LB) (preparado de acordo com as instruções ²⁷⁾ com agitação durante 1 h a 37 ° C. transformantes espalhadas em placas de LB contendo 50 ug / ml de canamicina e incubar a 37 ° C durante a noite.
8. Escolha várias colónias a partir das α STAT3 e placas STAT3 beta usando palitos estéreis ^27. Transferir cada 2 ml de LB. Crescer as culturas durante a noite a 37 ° C numa incubadora com agitação.
9. Purifica-se plasmídeos a partir de culturas bacterianas, seguindo as instruções fornecidas num kit de purificação de ADN. plasmídeos armazenar a -20 ou -80 ° C.
10. plasmídeos de sequência de várias colónias, preparando 20 reacções de sequenciação mL. pipeta 3tampão de reacção de sequenciação l, 2 ul mistura de reacção de sequenciação, 12 mL de água ultrapura, um plasmídeo ul como modelo e 2 ul sequenciamento primer.
    NOTA: Se estiver usando o vector pET-28a, use sequenciamento 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 '.
    1. Avaliar electrophoretograms de plasmídeos que codificam cada variante: Sα, Sβ, ΔSα e ΔSβ ^25.
11. Medida concentração de ADN de plasmídeo puro em ng / mL. Se ler absorvâncias a 260 nm usando um espectrofotômetro, calcular a concentração de DNA usando a lei de Beer-Lambert ^29:
    
    Onde c = concentração, A = absorbância, ε (coeficiente de extinção) = 0,02 (ig / mL) ^-1 cm ^-1 para o ADN e L = comprimento do caminho de cadeia dupla da luz (geralmente 1 cm).
12. Usando os pesos moleculares de STAT3 splicing ADNc variante AMplicons e o vector, calcular o número de cópias por ul.
    NOTA: O peso molecular por par de bases (pb) é estimado como 650 Da.
    

2. Analisando Primer especificidade para Absolute qPCR

1. Prepare 1 em 10 séries de diluição de plasmídeos STAT3, com ~ 10 ⁸ 10 ³ cópias por ul (20 ul) com água ultrapura. Concentração medida de mais concentrada (~ 10 ⁸ cópias por ml, veja o passo 1.11).
2. Use plasmídeos diluído para preparar quatro mixes "não-alvo" (ie., Controle negativo STAT3 ΔSβ contendo concentrações iguais de STAT3 Sα, ΔSα, Sβ mas nenhum ΔSβ) em 10 ⁶ cópias por mL cada. Prepare uma mistura de "destino" com concentrações iguais de todos os quatro modelos de cada um em 10 ⁶ cópias por mL.
3. Preparar a solução par de primerss para cada variante de processamento (ver Quadro 1b e Figura 1), fazendo ~ 60 ul de iniciadores cada um a uma concentração de 7 uM (concentração final na amostra irá ser 560 nm).
4. Dilui-se ADN polimerase / ligação-dsDNA mistura de corante 7: 5 com _H2O puro
5. Defina-se um ensaio numa placa de 96 poços de PCR tal como mostrado no modelo (Tabela 3).
   1. Adicionar 21 mL diluídas DNA polimerase / dsDNA de ligação mistura de corante, em seguida, 2 ul de mistura de iniciadores e 2 ul de template (conforme tabela 2b). Em vez de molde, adicionar 2 ul filtrados H ₂ O para o controlo sem modelo (NTC) bem. Configure reações em duplicado para avaliar a repetibilidade ^30.
6. placa de vedação qPCR com cobertura adesiva e centrifugar durante 5 minutos a 1200 xg a 12 ° C.
7. Se estiver usando software listados em Materiais, configurar experimento como descrito.
   1. Ligue máquina qPCR e inserção selado placa qPCR. Clique em Arquivo &# 62; Novo> Next> Selecione "New detector", escolha repórter, quencher e fornecer nome. Criar um "novo detector" para cada variante de processamento.
   2. Selecione Avançar e configurar padrões conforme solicitado na página placa de amostra Configuração, garantindo quantidades são introduzidos na tabela e detectores apropriados são selecionados. Clique em Concluir.
   3. Configurar bicicleta conforme a Tabela 2b. Certifique-se de que a fluorescência leitura (para determinar Ct) ocorre durante o passo de 72 ° C de cada ciclo. Selecione Executar.
   4. Quando executado estiver concluída, clique na guia Resultados> guia trama de amplificação. Avaliar trama de amplificação de saída para avaliar a qualidade dos dados (procure por uma parcela exponencial, como na Figura 2).
      NOTA: Certifique-se de parcelas de amplificação são principalmente exponencial e que o limiar de ciclo pode ser definido na parte exponencial da trama. Garantir NTCs não são amplificados e outros pontos padrão demonstram um baixo valor de Ct com uma alta ΔRn.
   5. para expresulta ort para o software de planilhas, clique em File> Export> Resultados.

3. Avaliação Absolute qPCR Assay Especificidade e repetibilidade

1. repetibilidade
   1. Use os dados do Passo 2.7.5 para calcular desvio padrão de Ct (ciclo limiar de fluorescência) valores.
      
      Em que n = número de amostras (2, se feito em duplicado), = Ct e da amostra = Amostra Ct dizer. Verifique se o desvio-padrão dos valores Ct de duplicatas é ≤0.2. Verifique se os valores Ct em todos, mas poços NTC são menores do que 38.
   2. Se repetibilidade é pobre parâmetros otimizar ciclismo por tanto tempo aumentando ou diminuindo de recozimento.
2. Plot cópia log dormenteser (tal como determinado no passo 1.12 e preparada no Passo 2.1) vs valor Ct para criar uma curva padrão; obtendo-se a seguinte equação:
   
   Em que Y é Ct, o símbolo m representa o gradiente, X é o log (número de cópias), e b é o valor de intercepção.
   NOTA: O valor de R ² da regressão linear será ≥0.95 para bons dados.
3. Calcular a eficiência de amplificação usando curva padrão e a equação:
   
   NOTA: Aponte para a eficiência ≥75%.
4. Calcule especificidade do ensaio qPCR 1 usando a fórmula de Too:
   
   Onde ^alvo Δ Ct ^Too = Ct - Ct ^não-alvo, descrevendo a diferença no número de ciclo limite para amp específica e não específicalification
   NOTA: Especificidade deve exceder quatro ordens de grandeza (isto é, o fator de especificidade ≥4.).
   1. Se especificidade é pobre, otimizar, diminuindo a concentração primer. Defina-se ensaios (conforme descrito nos passos 2,5-2,7) com concentrações finais de iniciadores que variam de 100 nM a 500 nM.

4. Execução relativos ensaios qPCR

1. Tratar células com citocinas para promover a transcrição.
   1. Para eosinófilos recém doados, preparar amostras em duplicado de 2,5 x 10 ⁶ culas / ml em meio de cultura celular (RPMI 1640) e trata-se com 50 ng / ml de interleucina-3 (IL-3) e / ou 50 ng / ml de factor α de necrose tumoral ( TNFa) por períodos de 3, 6, 9 e 20 h a 37 ° C sob 5% de CO ₂ e 10% de humidade.
2. Preparar cDNA a partir de amostras de eosinófilos (pelo menos 1 x 10 ⁶ células por preparação), conforme as instruções do fabricante e utilizando os kits de extracção de ARN e a síntese de cDNA.
3. Preparar diluições em série de duas alíquotas de cDNA (amostra de controlo ou de amostras de repouso), com uma série de diluições a partir de "1" para diluição "1 em 1024".
   1. Para a diluição de 1 em 4, 1 pipeta ADNc ul e 3 ul de água ultrapura.
   2. Para o 1 em 16 de diluição, pipeta de 1 mL da 1 em cada 4 diluição e 3 mL de água ultrapura, etc.
4. Configurar PCR em placa de 96 poços com 25 reações ul como passos descritos 2,3-2,5 mas com várias concentrações de primers para STAT3 pan e GUSB (ver modelo no Tabela 4).
5. Adicionar "novo detector" para GUSB e siga os passos 2,6-2,7, utilizando os parâmetros de ciclismo descritas na Tabela 2c.
6. Gerar curvas padrão (veja os passos 3.2 e 3.3) para determinar quais as concentrações de primers resultar em eficiência de amplificação 95-100%.
7. Configurar placa com amostras preparadas de cDNA (do passo 4.2) e concentrações de primers otimizados(ver Tabela 2c para os parâmetros de ciclismo, reagentes e Tabela 5 modelo de placa de 96 poços).
8. Execute os passos 2,6-2,7. Repetir o ensaio verifique pelo menos uma vez e qualidade dos dados.
9. Calcule o valor médio Ct da amostra em duplicado Cts tanto para STAT3 e GUSB gene housekeeping.
10. Obter valores Δ Ct para cada amostra.
    
11. Designar amostra de repouso (geralmente tem menor concentração de transcrição de interesse) como Amostra 0. Calcular ΔΔ Ct ³¹ para cada amostra (aqui designada como amostra X):
    
12. Calcule vezes de aumento para cada amostra:
    
13. reprodutibilidade
    1. Calcular o coeficiente de variação (CV) do número de cópias para pan-STAT3 e GUSB.
       
       Onde N = número de amostras, = número de cópias calculado de amostra e = média da amostra. Verifique se CV de cada amostra (múltiplos ensaios) é ≤10%.

5. Analisando Absolute qPCR dados para amostras desconhecidas

1. Comparar os valores Ct obtidos em relação qPCR (como descrito no passo 4.9) para GUSB gene arrumação para garantir que as concentrações de cDNA "amostras estão dentro de uma ordem de grandeza.
   1. Dilui-se ADNc em conformidade (por exemplo, se a amostra 1 tem um valor de Ct de ~ 17.5, e os valores de Ct de outras amostras são ~ 21, a amostra 1 é aproximadamente 2 ^(21-17.5) = 11 vezes mais concentrada Realizar uma mistura 1:. 1 com diluição água ultrapura dentro do mesmo intervalo sem diluir mais do que o necessário).
      NOTA: As concentrações de partida muito diferentes vai viés da análise de regressão linear (passo 4.12).
2. Configurar ensaio qPCR absoluta de amostras. Prepare ensaio de placa de modelo de 2a para Sα e Sβ conforme a Tabela 6; e preparar 2b ensaio para ΔSα e ΔSβ conforme a Tabela 7. Realizar ensaios conforme descrito nas etapas 2.6-2.7.3 (e Tabela 2b). Repita os ensaios pelo menos uma vez.
3. Verifique a qualidade dos dados e exportação como descrito nos passos 2.7.4-2.7.5.
4. Configurar absoluta qPCR placa de 96 poços com 25 ul utilizando os iniciadores reacções pan-STAT3 (iniciadores na Tabela 1C, modelo no Quadro 8) a 400 uM e uma mistura de todos os quatro plasmídeos ou de um único plasmídeo em concentrações totais listados.
   NOTA: Eficiência não importa para absoluta qPCR, mas optimizando a eficiência destes iniciadores é importante para o parente qPCR (Passo 4).
5. placa de vedação qPCR com cobertura adesiva e centrifugar durante 5 minutos a 1200 xg a 12 ° C.
6. Configurar "novo detector" para o Pan- STAT3 tal como nos passos 2.7.1-2.7.3.
7. Configurar ciclismo para pan-STAT3 conforme a Tabela 2c (mesmas condições que relativamente qPCR). Certifique-se de que a fluorescência leitura (para determinar Ct) ocorre durante o passo de 72 ° C de cada ciclo. Repetir o ensaio pelo menos uma vez para garantir a reprodutibilidade.
8. Verifique a qualidade dos dados e exportação (ver passos 2.7.4-2.7.5).
   1. Se parcelas de amplificação não são exponencial (ver Figura 2), dilui-se ADNc da amostra (1:10) e repetir o ensaio, tal como descrito (passo 5.7).
9. Utilizando a equação da curva padrão (ver 3.2, Figura 3) e os valores de Ct de amostras, calcular o número de cópias de cada variante de splicing e da STAT3 pan em cada amostra.
   
10. Log plot (valores numéricos cópia absolutos qPCR obtidos para STAT3 pan) vs log (valores de número de cópias cumulativos absolutos qPCR para STAT3 variantes de processamento).
    NOTA: regressão linear Ideal e inclinação valores ambos seriam ~ 1.
11. Calcule repetibilidade (Passo 3.1) e reprodutibilidade (Passo 4,13).

6. A fusão absoluta e relativa dos dados qPCR

1. Multiplicar a proporção da variante com a STAT3 dobra-aumento total para calcular vezes de aumento de cada variante de splicing.
2. Calcular os desvios padrão (ver Passo 3.1.1) dos valores absolutos e relativos à conta para a propagação de erro. Determinar erro padrão de medição (SEM), como mostrado:
   

Resultados

QPCR dados de boa qualidade vai gerar uma trama de amplificação sigmoidal (Figura 2a), significando aumento exponencial de transcrições no decurso da ciclagem. A presença de demasiado molde pode resultar num fundo de fluorescência elevada, ou seja, uma linha de base inadequado é estabelecida nos primeiros poucos ciclos. Se os dados não fornecem uma curva exponencial (Figura 2b), uma maior optimização é necessário (descrito nas etapas 3.1 e 3.4). Para mais informações sobre a solução de problemas resultados qPCR, referem-se a referência ^32. As curvas padrão geradas para os plasmídeos modelo de calibrador indicará a eficiência de amplificação (curva para STAT3 Sα mostrado na Figura 3). Eficiências entre 83 e 95% foram observados nas condições descritas. A equação para a especificidade (Passo 3.4) assume a mesma eficiência, o que é improvável ^25, de modo que a especificidadeé provável que seja maior do que o factor especificidade sugere.

A fim de avaliar a congruência dos níveis de STAT3, os valores absolutos de cada uma das quatro variantes de splicing foram medidos, bem como o nível de STAT3 total, a estes últimos, utilizando iniciadores que amplificam uma região comum para todas as quatro variantes de splicing (Figura 4). Idealmente, a regressão linear (indicação de correlação) e inclinação (proporção de STAT3 pan às variantes de emenda somados) devem ambos estar próximo de 1.

Os dados absolutos qPCR são apresentados como gráficos de pizza para mostrar as proporções das quatro variantes de processamento ao longo do tempo pós-estimulação com citocinas (Figura 5a). Eosinófilos de repouso (0 h) teve a menor proporção de STAT3 Sα, embora esta variante sempre foi o mais abundante. Multiplicando a fração de STAT3 variantes β emenda (S ^6; + ΔSβ) por a fracção de variantes de splicing STAT3 Ds (ΔSα + ΔSβ) deu um valor consistentemente mais baixo do que o valor experimental-gravados para ΔSβ. Se os eventos de splicing foram independentes, seria de esperar que a fracção de multiplicação Ds variantes por a fracção de variantes p iria dar um valor que está de acordo com o valor determinado experimentalmente. Níveis mais altos de ΔSβ do que o esperado de eventos de splicing independentes sugere existe um viés co-splicing.

Mesclar dados absolutos e relativos qPCR demonstraram que os níveis de todas as variantes de processamento STAT3 aumentou pós-estimulação com citocinas IL3 e TNF, com níveis de pico de 6 horas pós-estimulação (Figura 5b - e). Para três dos quatro variantes de processamento, os níveis de transcritos foram cerca de 3 vezes maior em IL3 + TNFa eosinófilos tratados (6 horas) em comparação com eosinófilos no mediano mesmo ponto de tempo. Sα níveis STAT3 foram 3,5 vezes mais elevada em IL3 + TNFa eosinófilos tratados em comparação com os eosinófilos no meio a este ponto de tempo. A maior incerteza (maior erro padrão de medição) foi visto na ΔSβ (Figura 5e), que compreende a menor fracção do total da STAT3 em todas as amostras. Este não foi surpreendente, pois os níveis mais baixos estão associados com maiores valores Ct. Exigindo mais ciclos para atingir o ciclo limiar será composto de incerteza devido à variação de ciclo-a-ciclo da eficiência de amplificação.

Figura 1: Representação esquemática dos pares de iniciadores utilizados para realizar qPCR de variantes de splicing STAT3 e pan-STAT3 Os iniciadores utilizados para amplificar especificamente cada uma das variantes de splicing da STAT3 (Sα, Sβ, ΔSα e ΔSβ respectivamente) são s.hown. Primers para a frente (STAT3 "S" e "Ds") abrangem a junção entre exons 21 e 22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. A amplificação de parcelas de dados qPCR (a) tramas de amplificação sigmoidais significa amplificação fiável. Estes dados foram obtidos a partir de qPCR de duas diluições em série de plasmídeo contendo STAT3 Sα, com cada par de linhas coloridas que representam os níveis de fluorescência de amostras em duplicado diluído ao longo de 40 ciclos (eixo-X). A amostra mais concentrada (verde-cinzenta) foi suficientemente amplificado pelo ciclo 17 (com o corante de fluorescência proporcional à, mostrada no eixo-y-dsDNA de ligação) exceder o valor limiar de fluorescência (baseline como seta verde). Seu valor Ct seria 17. (b) parcelas não-exponencial sugerem que o limiar de fundo-de fluorescência não foi correctamente estabelecida nos primeiros ciclos. Isto pode ser devido à presença de um inibidor, ou modelo altamente concentrada ou iniciadores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Curva padrão do log (número de cópias de STAT3 Sα) vs Ct Existe uma relação linear entre o logaritmo do número de cópias e o limiar de ciclo de cada variante de splicing de STAT3 (Ct).. Criando uma curva padrão a partir de DNA plasmídeo imita o ADNc de amostras e assimfornece uma medida melhor do que uma curva criada a partir de produtos de amplificação de PCR diluídos. Os dados apresentados são os valores Ct obtidos a partir de qPCR de duas diluições em série de plasmídeo contendo STAT3 Sα. A partir desta curva, o número de cópias presentes em cada amostra pode ser interpolada, e calculada a eficiência de amplificação (83,9%). Embora intercepta Y- são menos reprodutível de inclinação, a intercepção sugere 42,2 ciclos seria necessário ter a certeza nenhum DNA alvo está presente. As barras de erro indicam SEM, n = 3. curvas comparáveis foram construídos para STAT3 Sβ, ΔSα e ΔSβ (não mostrado). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação de pan quantificada STAT3 vs variantes STAT3 emenda cumulativos. A regressão da emenda STAT3 acrescentou variantes vs STAT3 total deve ter inclinação (proporção de pan a cumulativo) e R valor ² (correlação) perto de 1. Valores a partir de 17 amostras (eosinófilos e LDGCB) incluído. As barras de erro indicam SEM de determinações x-a-Y, n ≥ 2 para cada. Figura adaptado da referência ^20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5:. Níveis variante de splicing STAT3 flutuou durante o curso do tratamento de citoquinas (a) Os gráficos circulares que indicam as percentagens de cada variante de splicing STAT3em eosinófilos durante o tratamento com IL-3 e TNFa. (B - e) Variação de variantes de splicing STAT3 em eosinófilos tratados com várias combinações de citoquinas, calculada pela combinação dos dados relativos e absolutos qPCR Sα (B), Sβ (c), ΔSα (d), e ΔSβ (e) níveis de STAT3. flutuado ao longo do pós-estimulação tempo. Níveis inicialmente aumentou, atingindo um máximo de 6 horas pós-estimulação. A combinação IL3 + TNFa provocou maior expressão de todas as variantes de processamento de quatro STAT3 do que sozinho IL3. SEM calculado para cada ponto de dados representando a propagação de erro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Os iniciadores utilizados para a amplificação (a), absoluta (b), e relativa (c) por PCR quantitativa. Primers de clonagem têm sequências de restrição e 5'-extensões para o corte eficiente. Sítios de restrição KpnI e NheI são indicadas em negrito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Tabela 2. Parâmetros de ciclismo PCR (esquerda) e os volumes de reagente (à direita) para a amplificação (a), relativa (b), absoluto (c) PCR quantitativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

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Tabela 3:. Molde para o ensaio de calibração plasmídeo absoluta qPCR Este ensaio é necessário para avaliar a reprodutibilidade e eficiência, bem como a geração de curvas padrão a partir do qual a interpolação de dados. As misturas "não-alvo" vai dar uma estimativa de especificidade. Otimização pode ser necessário para atingir a consistência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Tabela 4:. Template para o parente qPCR (STAT3 pan e limpeza GUSB gene) ensaio de calibração Ao contrário absoluta qPCR, o ponto deste ensaio é determinar as condições em que a eficiência de amplificação é de aproximadamente 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Tabela 5:.. Molde para o ensaio relativamente amostra de qPCR para medir pan-STAT3 e gene housekeeping GUSB curvas padrão são repetidas em conjunto com amostras para garantir eficiência comparável dos ensaios Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Tabela 6: Modelo para ensaio absoluta amostra qPCR para medir as variantes S curvas padrão são repetidas em conjunto com amostras para garantir FEP comparáveis. iciency dos ensaios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Tabela 7:.. Molde para o ensaio absoluta amostra qPCR para medir variantes Ds curvas padrão são repetidas em conjunto com amostras para garantir eficiência comparável dos ensaios Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Tabela 8: Molde para o ensaio absoluta amostra qPCR para medir STAT3 pan.large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Discussão

Nós desenvolvemos este protocolo, a fim de avaliar os níveis e proporções de transcrições variantes STAT3 emenda em eosinófilos e células de linfoma e aprender se a estimulação de citocinas afetou os níveis e proporções. STAT3 é de particular interesse por causa da sua funcionalidade e pleiotrópico incerto, com relatórios contraditórios sobre se ela age como uma oncoproteína ou supressor de tumor no cancro (revisto em ³³ de referência). As diferenças de STAT3 função α e variante de splicing β tinha sido previamente caracterizado ^34,35, e o nosso protocolo facilitada uma análise knock-down re-expressão / que sugere uma necessidade de uma relação óptima de S e Ds transcritos ^19.

quantificação precisa de variantes de processamento distintas irá facilitar as investigações de se relacionar função STAT3 heterogêneo para emendar composição variante. O protocolo integra dados absolutos e relativos qPCR, combinando a capacidade de Absoluto qPCR para calcular as proporções de variantes de splicing, e relativo qPCR para medir mudanças na expressão geral STAT3. Esta abordagem permite distinguir diferenças subtis na sequência e simultaneamente medir as razões de splicing em dois locais de splice alternativas mais de 50 nucleótidos à parte. Determinar os rácios dos eventos de splicing individualmente não teria desenvolvido, se o constatação notável de que uma polarização de co-ligação tais que existiam níveis ΔSβ são mais elevados do que o previsto, se as utilizações dos dois locais são unidas aleatoriamente ^25.

Criticamente, qPCR absoluta com o uso de curvas de calibração de plasmídeo permite a quantificação (a eficiência sub-óptima) do splicing variações que resultam em sequências altamente semelhantes. Prevemos um ensaio qPCR splicing sutil romance deve levar cerca de dois meses para otimizar. Etapas fundamentais do desenvolvimento de ensaio são a criação de plasmídeos STAT3 utilizados na geração de curvas padrão para absoluta qPCR; experimentalmentedeterminar sequências iniciadoras ideais e parâmetros de ciclismo para garantir especificidade e reprodutibilidade; ea integração de dados relativos qPCR derivado de quantificar pan-STAT3 expressão relativa à expressão GAPDH. A correlação do número de cópias quantificada por pan-STAT3 contra quantificação cumulativa (Sα ΔSα + + + Sβ ΔSβ) mostra que o protocolo produz resultados fiáveis.

Uma advertência da técnica é o extenso processo de validação. É necessário avaliar a variabilidade intra-ensaio (repetibilidade), a variabilidade inter (reprodutibilidade) e especificidade. O protocolo descreve maneiras de obter resultados numéricos para esses parâmetros. Nós considerada a eficiência ≥75%, fator de especificidade ≥4, coeficiente de variação (reprodutibilidade) ≤10% e desvio padrão Ct (repetibilidade) ≤0.2 limiares adequados ^30. As mutações ou deleções dos aminoácidos da sequência da STAT3 1-690 não será Discovevermelho por este protocolo, embora possam influenciar os rácios de emenda. Proporções transcrição pode não ser proporcional à proteoform proporções ^36.

Desde amostras têm diferentes montantes iniciais de cDNA total absoluta qPCR é adequado para a comparação de números de cópias de variantes de processamento dentro de uma amostra, mas não para a comparação inter-amostra, salvo se juntamente com relativa qPCR utilizando um gene de manutenção estabelecido. O método descrito obedece às orientações MIQE qPCR para a reprodutibilidade ^30. parâmetros dos ciclos de PCR e concentração de iniciador, pode precisar de ser modificados para obter dados reprodutíveis se outro equipamento é usado. especificidade perfeita não é possível sem a eficiência drasticamente comprometer, mas o alvo foi amplificada com mais eficiência, maior do que quatro ordens de magnitude.

DNA linear é mais facilmente amplificado do que circular. Se um plasmídeo alternativo não fornecer as curvas de nível satisfatório ^(R2 <; 0,95), considere linearização do plasmídeo por única restrição local antes da quantificação. Optimizar qPCR é crucial para a obtenção de dados de boa qualidade (Figura 1). A maioria dos protocolos qPCR dependem de ciclismo de dois passos, e as máquinas são otimizados de acordo. aquecimento não uniforme do bloco de aquecimento pode ser exacerbada no ciclismo de três etapas, contribuindo para a má capacidade de repetição. Os ensaios devem ser configurados em condições estéreis com pontas de pipeta de filtro e água ultrapura, de preferência em uma capela de fluxo laminar dedicado. Porque contaminantes pode levar a resultados inconsistentes, os ensaios devem ser criados em condições estéreis com pontas de pipeta de filtro e água ultrapura, de preferência em uma capela de fluxo laminar dedicado. Para mais informações sobre otimização de qPCR, consulte Bustin et al ^32.

Quantificação da STAT3 pode levar a uma maior visão num número de contextos. STAT3 auto-regula a sua própria expressão ^37, e o protocolo descrito acima pode ajudarelucidar se proporções de variantes de splicing STAT3 contribuir para regular este ciclo de feedback positivo. O protocolo pode ser utilizado para estudar a mudanças nos índices de variante de splicing como observado em células em diferentes densidades de ³⁸ ou ao longo de desenvolvimento: sabe-se que os α razão E / β STAT3 alterações ao nível da proteína durante a hematopoiese ^16. Sundin et ai. descobriram que um polimorfismo de nucleotídeo único splicing tendenciosa intrônica do exão 12 em STAT3 de um paciente com síndrome ³⁹ de Jó. É concebível que uma das muitas SNPs presentes nos intrões entre os exões 21 e 22, ou exão 22 e 23 podem contribuir para os rácios de splicing de Ds / S e α / β respectivamente. O ensaio pode ser utilizado para quantificar transcritos de STAT3 em células cancerosas, em que mutações ou alterações na regulação de splicing podem introduzir viés para o processo de splicing ^40. As mutações em fatores de splicing (como SF3B1), como observed em síndromes mielodisplásicas ⁴¹ também podem levar a mudanças que podem ser medidos por este protocolo.

Em termos mais gerais, esta abordagem detecta especificamente co-associação em splicing, que não é viável com convencional de ARN-Seq, nem qPCR padrão. Enquanto o fenômeno de splicing exão mutuamente exclusivos demonstra a coordenação das decisões de emenda, o co-associação de outros eventos de splicing não tem sido bem pesquisado. Um método alternativo recentemente descrito, no qual o RNA-Seq foi modificado de modo a interrogar ADNc de comprimento completo, sugere eventos de splicing distante são mais co-dependente que se pensava ^42.

STAT3 contém um local de dador de splicing em tandem. Aceitador de splicing locais em tandem são mais frequente ⁴³ e os princípios do protocolo delineado poderia servir como um ponto de partida para o desenvolvimento de ensaios para a detecção de coincidência NAGNAG splicing e outros eventos de splicing a menos de 200 nucleótidos. Outros potenaplicações ciais incluem quantificação de coincidência de outras diferenças de sequência sutis, como indels ou polimorfismos duplos / triplos nucleotídeos ^44.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	GMI	N/A	Used for standard PCR
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	N/A	qPCR machine
GS-6R	Beckman Coulter	N/A	centrifuge for 96-well plates
Nanodrop 2000 sprectrophotometer	ThermoFisher Scientific	N/A
RPMI-1640 medium	Sigma Aldrich	R8758	cell culture medium
PfuTurbo DNA Polymerase	Agilent Technologies	600410	DNA polymerase for standard PCR
KpnI	New England Biosciences	R0142S
NheI	New England Biosciences	R0131S
SYBR Green PCR Master Mix	Qiagen	330523	qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74204	RNA extraction kit
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen (ThermoFisher Scientific)	18080-044	cDNA synthesis kit
Primers	Integrated DNA Technology	N/A
NEBuffer 1.1	New England Biosciences	B7201S
GenePure LE Agarose	ISC BioExpress	E-3120-500	component of TAE gel
Pipettors	Major lab suppliers (MLS)	N/A
Filter pipette tips	Neptune Scientific	BT10XL, BT20, BT200
EU One Piece Thin Wall Plate	MidSci	ABI7501
ThermalSeal A Sealing Film	MidSci	TSA-100	96 well plate seal
pET-Elmer (variant of pET-28a)	Novagen; modified in Mosher lab	N/A	Details in PMID: 20947497
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	A1460	Plasmid purification
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	ThermoFisher Scientific	4337455	Sequencing kit
QIAEX II Gel Extraction kit	Qiagen	20021	Amplicon purification
DH5α competent cells	ThermoFisher Scientific	18265-017	available from several providers, see PMID: 2162051
kanamycin	Research Products International Corp.	K22000-5.0
Tris base	ThermoFisher Scientific	BP152-5	component of TAE buffer
Acetic acid, glacial	ThermoFisher Scientific	A38C-212	component of TAE buffer
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)	E-5134	component of TAE buffer
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	component of Luria Broth
Bacto Yeast extract, technical	BD Biosciences	288620	component of Luria Broth
Sodium chloride	ThermoFisher Scientific	S271-10	component of Luria Broth
Sodium hydroxide	ThermoFisher Scientific	SS255-1	component of Luria Broth
Bacto Agar	BD Biosciences	214010	component of Luria Broth plate
Lasergene SeqBuilder	DNASTAR		Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR)