Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Özet

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.

Özet

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Giriş

Kısa menzilli alternatif alıcı veya donör siteleri birbirine yakın olan (tandem) alternatif ekleme, memeliler ^1, omurgasızlar ² ve bitkilerde ³ yaygındır. Memeli genlerinin% 20, alternatif ekleme bölgeleri birbirinden 2-12 nükleotidleri ⁴ içeren olduğu tahmin edilmektedir. Bu sitelerin çoğu 3 nükleotid arayla ve tek bir kodon dahil veya hariç sonuçlanabilir. Diğerleri doku özgüllüğü ⁸ dayalı düzenleme sonucuna ise yapıştırma motifi farklılıkları, seçim stokastik ⁷ böylece ince olan savundular bu sitelerde ^5,6 de yapıştırma düzenlemenin doğası hakkında tartışmalar vardır.

Tandem bağlantı yeri seçimi modifiye kılcal elektroforez ⁷ ve yüksek çözünürlüklü jel elektroforez ⁸ kullanarak yarı kantitatif analiz edilmiştir. RNA devamı (RNA dizi), her bir ek yeri de ekleme oranları ölçmek için kullanılabilir okurbir site. Bu şekilde, RNA-Seq verileri ikili bağlantı bölgeleri ⁹ düzenlenmesi hakkında fikir sağlamıştır. Ayrıca nükleotid motifi ¹⁰ dayanarak beklenen bağlantı varyantı oranlarının tahmin sağladı. içeren ya da tek bir kodon (N herhangi nükleotid =) NAGNAGs olarak bilinen daha sık görülen tandem alıcı ekleme bölgeleri, üzerinde olmuştur dışlayan yapıştırma vurgu çoğu.

(E pirimidin = GYNGYN tanıma motifi, dahil) veya tek bir kodon hariç Tandem donör alternatif ekleme siteleri tandem alıcıları daha az yaygındır. Sinyal ileticisi ve 3 (STAT3) aktivatörü ikili verici alternatif bağlantı ^1,11 geçiren temel genidir. Tandem donör ekleme siteleri ekzon 21 ve 22 katılmak ve serin-701 (S veya ΔS sırasıyla) ^1,11 için kodonu dahil veya hariç sonuçlanabilir. (40 nükleotid birbirinden) aşağı akış alternatif alıcı siteleri katılmadan ekzon 22 veTransaktivasyon domenini (α) ya da 7 eşsiz C-terminal kalıntılarla (β) ¹¹ olan bir tepe bölümü kesik transaktivasyon alanına 55 terminal kalıntılarını da dahil edilmesi de 23a / b sonucu. Bu nedenle, dört ekleme varyantları mümkündür.

STAT3 protein sayıda hücre tipleri ¹² bir transkripsiyon faktörü ve büyük sinyal entegratörü ve mutasyona zaman onun kurucu aktivasyon (referans ¹³ gözden) birçok kanser fenotipleri katkıda bulunur. Eyüp Sendromu, IgE yüksek düzeyde ile karakterize bir immün yetmezlik bozukluğu, ayrıca STAT3 mutasyonlar neden olur (referans ¹⁴ gözden). STAT3 a ve β bağlantı varyantı proteinler için ayrı roller önce yapılmış ¹⁵ tarif var. Başlangıçta, STAT3 β STAT3 a en transkripsiyonel aktivitesini antagonize, dominant-negatif bir şekilde ¹⁶ hareket düşünülen, ancak sonraki iş bağımsız hedef genleri ¹⁷ sahiptir öne sürüldü Yukarı. tandem yapıştırma incelik rağmen, yokluğunu ya da serin-701 (Ser701) etkiler fonksiyonun varlığını inanmak için bir neden yoktur. Sadece Ser701 tirozin 705 için (STAT3 aktivasyon ¹⁸ fosforile kalıntı) yakın olmakla birlikte, yeni bir çalışma STAT3 S ve ΔS ekleme varyantları STAT3 bağımlısı Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma (DLBLCL) canlılığı hem gerekli olduğunu göstermektedir hücreler ^19. Biyolojik önemi keşfedilmeyi beklemektedir. bağlantı varyantı kompozisyon fonksiyonunu etkileyebilir göz önüne alındığında, biz oranın eozinofil sitokin uyarımı ile tedirgin olup olmadığını keşfetmek için çaba gösterdi.

Başlangıçta S ek yeri varyantları, Afel spesifik enzim kısıtlama ürünlerin ayrılması ve ardından STAT3 a ve β varyantlar için PCR spesifik kullanarak, iki bağlayıcı olayları arasındaki bağlantıyı keşfetmek için çalışmıştır. Ser701 R olduğu ürünleri dansitometrisi dahil belirtilmedikçeğı ile on kat daha sık STAT3 a ve p hem de onun ihmal (ΔS) daha (veriler gösterilmemiştir). Bununla birlikte, bu yarı-kantitatif bir yaklaşım yeterli tekrarlanabilir olmadığını ve dört bağlantı aynı zamanda varyantları ölçmek için etkili bir şekilde kullanılabilir olabilir. dört adet ek varyantı, her oranlarını analiz etmek için, sıkı teknik (belirli bir numunenin, pek çok tayinde) vermiştir kantitatif PCR (qPCR) protokolünü kurmak için gerekli çoğaltır.

Bağıl qPCR belli bir seviyede ²⁰ eksprese olduğu bilinen standart bir ya da ev bakıcısı geni için ilgi konusu bir genin karşılaştırılmasına dayanır ve ilgi ve temizlik genin gen benzer bir verim ile amplifiye edilir, uygun bir. Bir çift sarmallı (ds) DNA bağlayıcı flüoresan (siyanin) boyası PCR amplikonlarının ²¹ bağlanır ve belirli bir döngü sayısı sonra yeterli bir amplifikasyon tespit için flüoresan için oluştu. yüksek başlangıç ​​seviyesitranskript, alt eşik döngüsü (Ct) değeri. CDNA preparatlar konsantrasyonu farklı olduğundan, bir eozinofil ²² glukuronidaz-β (GUSB) gibi tüm örneklerde tutarlı düzeyde ifade edildiği bilinen bir transkript, konsantrasyonuyla Konuşma metninin konsantrasyon karşılaştırma gerekmektedir.

Bağıl qPCR ikili uc uca eklendiği birleşme yeri varyantları görüldüğü gibi, yüksek oranda benzer diziler için uygun değildir. özellikle ekleme varyantları yükseltmek için gerekli olan katı koşullar düşük verimlilik ile sonuçlanmaktadır. Bunun yerine, mutlak miktar ²³ kullanılmalıdır. Bu ilgi eklenmiş transkriptin bilinen konsantrasyonları ile bir standart eğri hazırlamak gerektirir ve sağlanması PCR koşulları özgüllük ²⁴ optimize eder. tarif edildiği gibi, özel bir gen için mutlak ve göreli qPCR veriler, belirli bir hücre türü genin ekspresyonunun ortaya koyması birleştirilebilirdeğişik uyarılan eozinofil ²⁵ bu durumda STAT3.

Burada STAT3 ekleme varyantı ölçümü yöntemi diğer tandem yapıştırma etkinlikleri hedeflenen çalışmalara adapte edilebilir beklentisi ile tarif edilir. Optimizasyon çeşitli konsantrasyonlarda ve bisiklet parametreleri çok sayıda tekrarlamalar birkaç primer çiftleri birkaç ay boyunca test edilmiştir uzun bir süreçtir, oldu. protokolün temel özellikleri ekleme varyantları bilinen konsantrasyonları ile standart eğrileri dayalı astar özgüllük doğrulama ve miktar vardır. birlikte göreli qPCR bizim uygulama için yararlı oldu ama gerekli değildir.

Protokol

NOT: Periferik kan eozinofil Sağlık Bilimleri Kurumsal Değerlendirme Kurulu Wisconsin-Madison Merkezi'nin Üniversitesi tarafından bir protokol onaylandı (# 2013-1570) ile uyum içinde tanımlayıcı bilgiler olmadan alındı. donörden imzalı bilgilendirilmiş olur araştırma her numune kullanılarak elde edilmiştir.

1. Şablon Standartları olarak plazmidler oluşturma

1. Tablo 1a başına 5'Kpnl ve Nhel kısıtlama siteleri (ve 5'-uzantıları) ile, hem STAT3 ekleme siteleri kapsayan bir amplikon için primerler oluşturun.
   Not: Kpnl ve Nhel siteleri uçlar sağlamak üzere seçilmiştir kanamisin direnci ^25,26 olan bir tadil edilmiş, pET-28a vektörüne lige edilmesi Kpnl sitesi çok sayıda klonlama yerine ilave edilmiştir..
2. Hücre kültür ortamı içinde 2.5 x 10 ⁶ hücre / ml'lik iki kopya halindeki numunelerin hazırlanması Taze bağışlanan eozinofil kullanılarak (Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 ortamı). % 5 _CO2 ve% 10 nem altında 37 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin.
   1. RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi kitleri kullanılarak üreticinin talimatlarına göre (Hazırlık başına en az 1 x 10 ⁶ hücre) örnekleri, tamamlayıcı (c) DNA hazırlamak.
3. Şablon cDNA aşama 1.2.1 hazırlanan itibaren, STAT3 ekleme Tablo 2a başına amplifikasyon PCR kullanılarak varyantları yükseltmek.
4. % 2'lik agaroz Tris-asetat-etilendiamintetraasetat (TAE) jel ²⁷ amplikonları giderin. jelden tüketim bantları ve gel eksizyonu kiti talimatlarına göre saflaştırılması.
5. Miktarlar, inkübasyon süreleri ve sıcaklıklar kullanılarak, uygun sınırlandırma enzimleri (referans ²⁷ sınırlama genel bakış) ile kesilmiştir amplikonlar ve plazmid enzimi sağlayıcı tarafından; ve adım 1.4 olarak arındırmak. sağlayıcı tarafından önerilen koşullar altında plazmide sınırlı amplikonları Arter.
6. Negatif cont hazırlayınROL (ligazı parçasız fakat sınırlı plazma DNA) ve bir pozitif kontrol (kanamisine dirençli sınırsız plazmid). Yetkili E. standart plazmid dönüşümleri gerçekleştirmek E. coli DH5α ²⁸ kullanılarak ligasyon karışımları ^27.
7. Dönüştürülmüş E. inkübe 1 ml Luria-Broth (LB) ortamı içinde E. coli, 37 ° C'de 1 saat çalkalanarak (talimat ²⁷ gibi hazırlandı). 50 ug / ml kanamisin ug ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe ihtiva eden LB plakaları üzerine yayıldı dönüştürücüler.
8. Steril kürdan ²⁷ kullanılarak STAT3 a ve STAT3 β plakaları birkaç koloniler seçin. 2 ml LB her transfer bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca kültür büyütün.
9. DNA saflaştırma kiti sağlanan yönergeleri takip ederek bakteri kültürlerinden plazmidler arındırın. -20 Veya -80 ° C'de saklayın plazmidler.
10. 20 ul sekanslama hazırlayarak Pek çok koloniden, sekans plazmid. pipet 3ul sıralaması reaksiyon tamponu, 2 ul sıralaması Reaksiyon karışımı, 12 ul ultra saf su, şablonu ve 2 ul sekanslanma primeri olarak 1 ul plazmit kullanmak avantajlıdır.
    NOT: pET-28a vektör kullanıyorsanız, 'sıralama primer 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 kullanın.
    1. Sα, Sβ, ΔSα ve ΔSβ ^25: Her varyantını kodlayan plasmidlerin Elektroforetogramların değerlendirin.
11. ng / ul saf plazmid DNA Tedbir konsantrasyonu. Bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de absorbans okuma durumunda, Beer-Lambert kuralına ²⁹ kullanılarak DNA konsantrasyonunun hesaplanması:
    
    C = konsantrasyon A = absorbans, ε (yok olma katsayısı) = 0.02 (ug / ml) ¹ cm ^-1 ışık çift şeritli bir DNA ve L = yol uzunluğu (genellikle 1 cm) dir.
12. STAT3 uç uca ekleme varyantı cDNA am moleküler ağırlığıplicons ve vektör ul başına kopya sayısını hesaplamak.
    NOT: Baz çifti başına molekül ağırlığı (bp) 650 Da olarak tahmin edilmektedir.
    

2. Mutlak qPCR için primer Özgüllük Analiz

1. Ultra saf su ile ul başına ~ ¹⁰ Ağustos-10 Mart kopya (20 ul) ile, STAT3 plazmidlerin 10 dilüsyon serisinde 1 hazırlayın. En konsantre Tedbir konsantrasyonu (ul başına ~ 10 ⁸ kopya, adım 1.11 bakınız).
2. Dört "hedef dışı" karışımları hazırlamak için seyreltilmiş plazmidler kullanın (yani., STAT3 Sα, ΔSα, Sβ ama hiçbir ΔSβ eşit konsantrasyonlarını içeren STAT3 ΔSβ negatif kontrol) her ul başına 10 ⁶ kopya olarak. Ul başına 10 ⁶ kopya olarak dört şablonları her eşit konsantrasyonları ile bir "hedef" karışımı hazırlayın.
3. primer çifti çözüm hazırlayınHer bir bağlantı varyant için S (560 nM olacak örnek nihai konsantrasyon), 7 uM konsantrasyonu ~ yaparak primerlerin her biri 60 ul (Tablo 1b ve Şekil 1 'e bakınız).
4. Saf _H2O ile 5: DNA polimeraz / dsDNA bağlayıcı boya karışımı 7 seyreltin
5. Şablon (Tablo 3) 'de gösterildiği gibi, bir 96-yuvalı PCR plaka tahlil 1. ayarlayın.
   1. DNA polimeraz / boya karışımı dsDNA bağlayıcı seyreltilmiş 21 ul ekleyin, sonra primer karışımının 2 ul ve şablon 2 ul (Tablo başına 2b). Bunun yerine şablon, iyi hiçbir şablon kontrolü (NTC) H ₂ O süzülmüş 2 ul ekleyin. Iki nüsha halinde kurmak reaksiyonlar tekrarlanabilirliği ³⁰ değerlendirmek için.
6. Yapışkan kapağı ve 12 ° C'de 1.200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj ile mühür qPCR plaka.
7. Açıklandığı gibi Materyalleri listelenen yazılımları kullanıyorsanız, deney kurdu.
   1. qPCR makine ve insert açın qPCR plaka mühürlü. Dosya Click &# 62; Yeni> İleri> "Yeni dedektörü" seçeneğini seçin muhabir seçin, içki ve adını sağlar. Her ekleme varyantı için "yeni bir dedektör" kurmak.
   2. miktarlarda sağlanması, İleri'yi seçin ve Set Up Numune Plaka sayfasında istendiğinde standartları kurmak tabloya girilir ve uygun dedektörler seçilir. bitirmek tıklayın.
   3. Tablo 2b göre bisiklet ayarlayın. (Ct belirlemek için) okuyan floresan sağlamak her döngünün 72 ° C adımı sırasında oluşur. Çalıştır seçin.
   4. çalışma tamamlandığında, sonuçlar sekmesi> Büyütme arsa sekmesini tıklayın. (Şekil 2 deki gibi bir üstel arsa arayın) veri kalitesini değerlendirmek için çıkış amplifikasyon arsa değerlendirin.
      NOT: emin olun amplifikasyon araziler çoğunlukla üstel ve çevrim eşik arsa üstel kısmında ayarlanabilir vardır. Sağlamak NTSC amplifiye değildir ve diğer standart noktaları yüksek ΔRn ile düşük bir Cr değeri elde göstermektedir.
   5. export Dosya> Dışa Aktar> Sonuçları tıklayın tablo yazılımı sonuçlanır.

3. Mutlak qPCR Testi Özgüllük ve Tekrarlayabilme değerlendirilmesi

1. Tekrarlanabilirlik
   1. Ct standart sapması değerleri (floresan için eşik döngüsü) hesaplamak için Adım 2.7.5 verileri kullanır.
      
      Burada n = numune sayısı (2 kopya halinde yapıldığı takdirde), = Numunenin Ct ve = Ct ortalama numune. Çiftleri Ct değerlerinin standart sapması ≤0.2 olup olmadığını kontrol edin. NTC kuyularda ama tüm Ct değerleri 38 daha küçük olup olmadığını kontrol edin.
   2. tekrarlanabilirlik ya artan ya da azalan tavlama zaman kötü optimize bisiklet parametreleri ise.
2. Arsa günlüğü kopya uyuşmuşer (as Adım 1.12 belirlenen ve Adım 2.1 hazırlanan) Ct değeri vs bir standart eğri oluşturmak için; aşağıdaki denklem elde edilmiştir:
   
   Y Ct Nerede, m degrade olduğunu x log (kopya sayısı) ve b kesmek değeridir.
   NOT: lineer regresyon R ² değeri iyi veri ≥0.95 olacaktır.
3. Standart eğri ve denklem kullanılarak amplifikasyon verimi olarak hesaplanır
   
   NOT: verimlilik ≥75% hedefleyin.
4. Çok formülü kullanılarak qPCR tahlil 1 özgüllüğü hesaplayın:
   
   Burada Δ Ct ^çok = Ct ^hedefi - spesifik ve spesifik olmayan amplifikatör için eşik döngüsü sayısının farkı tarif Ct ^{hedef olmayan,}lification
   NOT: Özgünlük büyüklük dört siparişleri aşmalıdır (yani, özgüllük faktörü ≥4.).
   1. özgüllüğü kötüyse, astar konsantrasyonunu düşürerek optimize. 100 nM ila 500 nM arasında değişen nihai primer konsantrasyonları ile (adımları 2.5-2.7 tarif edildiği gibi) deneyleri ayarlayın.

4. Bağıl qPCR Tahliller Sahne

1. Transkripsiyon Destekleme Sitokinlerle Hücreler davranın.
   1. Taze bağışlanan eozinofiller için, hücre kültür ortamı içinde 2.5 x 10 ⁶ hücre / ml (RPMI 1640 ortamı) ve iki kopya halindeki numunelerin hazırlanması ve (50 ng / ml, interlökin-3 (IL3) ve / veya 50 ng / ml, tümör nekroz faktörü α ile muamele % 5 _CO2 ve% 10 nem altında 37 ° C'de 3, 6, 9 ve 20 saat arasında süre için TNFa).
2. RNA ekstraksiyonu, ve cDNA sentezi kitleri kullanılarak üreticinin talimatlarına göre eozinofil örnekleri (Hazırlık başına en az 1 x 10 ⁶ hücre) için cDNA hazırlanır.
3. "1 1024" seyreltme "1" den bir seyreltme aralığı, iki örnek cDNA alikotları (kontrol veya dinlenme örnekleri) seri dilüsyonları hazırlayın.
   1. 1 seyreltme 4, pipet 1 ul cDNA ve 3 ul ultra saf su için.
   2. 1 16 seyreltme için, 1 pipet 1 ul 4 seyreltme ve 3 ul ultra-saf su, vs
4. Açıklanan adımlar 2.3-2.5 olarak ama pan STAT3 ve GUSB (Tablo 4'te şablonu bakınız) için çeşitli astar konsantrasyonları ile 25 ul reaksiyonlar ile 96-plaka PCR ayarlayın.
5. GUSB için "yeni dedektör" ekleyin ve Tablo 2c açıklanan bisiklet parametreleri kullanılarak, adımları 2,6-2,7 uygulayın.
6. standart eğrileri astar konsantrasyonu% 95-100 amplifikasyon verimliliği neden olduğunu belirlemek için (adımları 3.2 ve 3.3) oluşturun.
7. (Kademe 4,2) hazırlanan cDNA örnekleri ve optimize edilmiş astar konsantrasyonları ile kurmak plaka(bisiklet parametreleri, reaktifler ve Tablo 5 ile 96 oyuklu plaka şablon Tablo 2c bakınız).
8. adımlar 2.6-2.7 gerçekleştirin. Tekrarlayın tahlil en az bir kez ve veri kalitesini kontrol edin.
9. STAT3 ve temizlik gen GUSB hem yinelenen örnek CTS ortalama Ct değerini hesaplayın.
10. Her bir numune için Δ Ct değerleri elde edilir.
    
11. Örnek olarak (genellikle ilgi transkriptinin düşük konsantrasyonuna sahiptir) dinlenme örnek belirleyin 0 hesaplama ΔΔ (on Örnek X olarak gösterilen), her bir numune için Ct ^31:
    
12. Her numune için kat-artış hesaplayın:
    
13. Tekrarlanabilirlik
    1. Pan ST için kopya sayısının varyasyon (CV) katsayısı hesaplamakAT3 ve GUSB.
       
       N = numune sayısı, = numunenin hesaplanan kopya sayısı ve = örnek Nerede anlamına gelir. Her numune (çoklu analizler) bu CV kontrol ≤10% 'dir.

5. Bilinmeyen Örnekleri için mutlak qPCR Veri Analizi

1. Numunelerin cDNA konsantrasyonları bir mertebe dahilinde sağlamak için ev bakıcısı geni GUSB için (adım 4.9 de tarif edildiği gibi) göreceli qPCR olarak elde edilen Ct değerleri karşılaştırın.
   1. Buna göre (cDNA seyreltilir örneğin örnek 1 Ct değeri ~ 17.5 ve diğer numunelerin Ct değerleri varsa, örnek 1 kabaca 2 ^(21-17,5) = 11 kat daha fazla konsantre olup, ~ 21 olduğu bir 1 yapın. 1 seyreltme gereğinden fazla inceltilmeden aynı aralıkta saf su).
      NOT: Büyük ölçüde farklı başlangıç ​​konsantrasyonları önyargı lineer regresyon analizi (4.1 adım olacaktır2).
2. Örneklerin mutlak qPCR tahlil ayarlayın. Tablo 6 uyarınca Sα ve Sβ için tahlil 2a şablon levha hazırlanması; ve. Tablo 7'deki gibi ΔSα ve ΔSβ için tahlil 2b hazırlanması adımlarda açıklandığı gibi deneyleri yürütmek 2.6-2.7.3 (Tablo 2b). en az bir kez tahlilleri tekrarlayın.
3. adımlarda 2.7.4-2.7.5 açıklandığı gibi veri kalitesi ve ihracat kontrol edin.
4. Pan-STAT3 primerleri (Tablo 1c primerler, Tablo 8'de şablonu) 400 uM ve tüm dört plazmid bir karışımını ya belirtilen toplam konsantrasyonlarda tek plasmidi kullanılarak 25 ul reaksiyonlar mutlak qPCR 96 plaka ayarlayın.
   Not: Verim mutlak qPCR madde, ancak bu primerlerin verimliliğini optimize görece qPCR (Adım 4) için önemlidir etmez.
5. Yapışkan kapağı ve 12 ° C'de 1.200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj ile mühür qPCR plaka.
6. pan "yeni dedektör" kurmak- Adım 2.7.1-2.7.3 gibi STAT3.
7. Tablo 2c başına (göreceli qPCR aynı koşullara) STAT3 pan için bisiklet ayarlayın. (Ct belirlemek için) okuyan floresan sağlamak her döngünün 72 ° C adımı sırasında oluşur. Tekrarlayın tahlil en az bir kez tekrarlanabilir sağlamak.
8. (2.7.4-2.7.5 adımlara bakın) veri kalitesi ve ihracat kontrol edin.
   1. Amplifikasyon çizimini (bakınız Şekil 2) üstel değilseniz numune cDNA (1:10) seyreltin ve (adım 5.7) de tarif edilen deney tekrar edin.
9. Standart eğri denklemi kullanarak, her ekleme varyantının ve her bir numune içindeki pan STAT3 kopya sayısını hesaplamak ve örneklerin Ct değerleri (Şekil 3 3.2).
   
10. Arsa günlüğü STA için günlük (kümülatif mutlak qPCR kopya sayısı değerleri vs (pan-STAT3 için elde edilen mutlak qPCR kopya sayısı değerleri)T3 ekleme) varyantları.
    NOT: İdeal lineer regresyon ve eğim değerleri hem ~ 1 olur.
11. tekrarlanabilirlik (Adım 3.1) ve tekrarlanabilirlik (Adım 4.13) hesaplayın.

6. birleştirme Mutlak ve Bağıl qPCR Veri

1. Her ekleme varyantının kat artış hesaplamak için toplam STAT3 kat artış ile varyant oranını çarpın.
2. standart sapmalar hesaplayın hata yayılması için hesap mutlak ve bağıl değerleri (Adım 3.1.1 bakınız). gösterildiği gibi standart ölçme hatası (SEM) belirleyin:
   

Sonuçlar

Kaliteli qPCR veri bisiklet boyunca transkript üstel artış gösteren, bir sigmoidal amplifikasyon arsa (Şekil 2a) üretecektir. Çok fazla şablonun bulunması uygun olmayan bir başlangıç ​​ilk birkaç döngü kurulmuştur, yani yüksek bir floresan arka plan neden olabilir. Veri üstel eğri (Şekil 2b) vermezseniz, başka optimizasyonu (adımlarda 3.1 ve 3.4 özetlenen) gereklidir. Giderme qPCR sonuçları hakkında daha fazla bilgi için, ³² başvuru bakın. Şablon kalibratör plasmidler için oluşturulan standart eğrilerle amplifikasyonu (STAT3 Sα için eğrinin Şekil 3'te gösterildiği gibi) etkinliğini gösterir. 83 ve% 95 arasında verimler tarif edilen koşullar altında gözlendi. Özgüllük (3.4 Adım) denklemi eşit olası ^25'tir verimliliği, yani özgüllüğü varsayarözgüllük faktörü göstermektedir daha büyük olması muhtemeldir.

STAT3 seviyelerinin congruency değerlendirmek için, dört adet ek varyantı, her mutlak değerleri, toplam STAT3 tüm dört adet ek varyantı ortak bir bölge amplifiye ikinci primerler kullanılarak (Şekil 4) seviyesinde hem de ölçüldü. İdeal lineer regresyon (korelasyon göstergesi) ve eğim (özetlenebilir ekleme varyantları pan STAT3 oranı) her ikisi de 1'e yakın olmalıdır.

Mutlak qPCR veri pasta grafikler zamanla sitokinler (Şekil 5a) post-stimülasyon dört ekleme varyantları oranlarını göstermek için sunulmuştur. Bu varyant her zaman en bol olmasına rağmen istirahat eozinofiller (0 saat), STAT3 Sα küçük oranda vardı. STAT3 β ekleme varyantları fraksiyonu (çarparak S ^6; STAT3 ΔS ek varyantlarının fraksiyonu tarafından + ΔSβ) (ΔSα + ΔSβ) sürekli ΔSβ deneysel kaydedilmiş değerinden daha düşük bir değer vermiştir. yapıştırma olayları bağımsız olsaydı, bir ΔS kısmını çarparak deneysel belirlenmiş değer ile kabul bir değer verecek β türevleri fraksiyonu tarafından varyantları beklenebilir. Bağımsız ekleme olaylardan beklenenden daha ΔSβ yüksek seviyeleri eş-yapıştırma önyargı var göstermektedir.

Mutlak ve göreli qPCR veri birleştirme Tüm STAT3 ekleme varyantları Seviyeleri 6 saat sonrası uyarımı zirve ile sitokinler IL3 ve TNFa ile sonrası stimülasyon da artırılabilir (Şekil 5b - e). Dört ekleme varyantları için üç, transkript seviyeleri medyada eozinofil kıyasla IL3 + TNFa tedavi eozinofiller (6 saat) kabaca 3 kat daha yüksektirAynı zaman noktasında. STAT3 Sα seviyeleri bu zaman noktasında medyaya eozinofil kıyasla IL3 + TNFa tedavi eozinofil 3.5 kat daha yüksektir. Büyük belirsizlikler (ölçüm en büyük standart hatası), tüm örneklerde toplam STAT3 en küçük kısmını ihtiva ΔSβ (Şekil 5e) görülmüştür. Düşük düzeyde daha yüksek Ct değerleri ile bağlantılı olarak bu durum şaşırtıcı değildir. Daha fazla çevrimleri Gerektiren eşik döngüsü nedeniyle amplifikasyon verimliliğine çevrim-to-döngüsü varyasyona belirsizliği bileşik olacaktır ulaşmak için.

Şekil 1:. STAT3 ek yeri varyantları ve pan-STAT3 özellikle STAT3 ek yeri varyantları (sırasıyla Sα, Sβ, ΔSα ve ΔSβ) her yükseltmek için kullanılan primerler şunlardır s qPCR gerçekleştirmek için kullanılan primer çiftleri şematikhown. İleri primerler (STAT3 "S" ve "ΔS") ekson 21 ve 22 arasındaki kavşak yayılan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. QPCR veri amplifikasyon çizimini, (a) Sigmoidal amplifikasyon çizimini güvenilir bir amplifikasyon anlamına gelir. Bu veriler, 40 döngü (x-ekseni) boyunca yinelenen seyreltilmiş numunelerin floresan seviyeleri temsil renkli çizgiler, her çift, STAT3 Sα içeren plazmidin iki seri dilüsyonları qPCR elde edilmiştir. (Yeşil-gri) en konsantre numune yeterince (eşik floresan değerini aşan baseli için (y-ekseni üzerinde gösterilen floresan orantılı boya, dsDNA bağlayıcı ile) döngüsü 17 ile büyütüldüYeşil) okla gösterildiği gibi KD. Onun Ct değeri 17 (b) Non-üstel araziler background-floresan eşik doğru ilk birkaç döngüleri kurulmuş değildi öneririz olacaktır. Bu durum bir inhibitör ya da yüksek konsantre şablon veya primerlerin varlığı olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: günlüğü Standart eğri Ct vs (STAT3 Sα kopya sayısı) her STAT3 ekleme değişkenin kopya sayısı ve eşik döngüsü (Ct) log arasında doğrusal bir ilişki vardır.. Örneklerin cDNA ve böylece plazmid DNA standart bir eğri taklit oluşturmaseyreltilmiş PCR amplikonlarının oluşturulan bir eğrinin daha iyi bir ölçüm sağlar. Sunulan veriler STAT3 Sα içeren plazmidin iki seri dilüsyonları qPCR elde edilen Ct değerleri vardır. Bu eğriden, her numunede kopya sayısı mevcut interpolasyon edilebilir ve amplifikasyon verimliliği (83.9%) hesaplandı. Y yakaladığını yamaç daha az tekrarlanabilir olmasına rağmen, önünü 42.2 devir hiçbir hedef DNA mevcut emin olmak için gerekli olacaktır göstermektedir. Hata çubukları SEM gösterir, n = 3 Karşılaştırılabilir eğrileri STAT3 Sβ, ΔSα ve ΔSβ (gösterilmemiştir) için inşa edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: sayısallaştırılmış panolarında Karşılaştırılması kümülatif STAT3 ekleme varyantları vs STAT3. eklenen STAT3 eklemenin regresyon eğimi (kümülatif için pan oranı) ve R ² değeri 17 numuneler (eozinofiller ve DBBHL) 1. Değerler yakın (korelasyon) olmalıdır toplam STAT3 vs varyantları dahil. Hata çubukları, X-To-Y belirlemelerinin ortalama ± SEM'i göstermektedir, n için ≥ 2. Referans ²⁰ uyarlanmıştır Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5:. STAT3 uç uca ekleme varyantı seviyeleri sitokin tedavisi boyunca dalgalanma (a) her bir STAT3 ekleme varyantı yüzdelerini gösteren Pasta grafiklerIL3 ve TNFa ile tedavi sırasında eozinofillerinde. (B - E) göre ve mutlak qPCR değerlerin birleştirilmesiyle ölçülen sitokinler çeşitli kombinasyonları ile muamele eozinofillerde STAT3 ek yeri varyantları değişiklikler STAT3 Sα (b) Sβ (c) ΔSα (d) ve ΔSβ (e) seviyeleri. zaman sonrası uyarılması üzerine dalgalanma. Seviyeleri başlangıçta 6 saat sonrası stimülasyon zirve arttı. IL3 + TNFa kombinasyonu, tek başına IL3 daha dört STAT3 ekleme varyantları yüksek ifadesini ortaya çıkardı. SEM hata yayılması için muhasebe her veri noktası için hesaplanan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1: Amplifikasyonu (a), mutlak (b) ve görece (c), niceliksel PCR için kullanılan primerler. Klonlama primerleri kısıtlama dizileri ve verimli kesim için 5'-uzantıları vardır. Kpnl ve Nhel kısıtlama siteleri kalın olarak gösterilir. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 2. PCR bisiklet parametreleri (solda) ve büyütme için reaktif hacimleri (sağ) (a), bağıl (b), mutlak (c) kantitatif PCR. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3 / 54473tbl3.jpg "/>
Tablo 3:. Mutlak qPCR plazmid kalibrasyon deneyi için şablon Bu deney, tekrarlanabilirlik ve verimlilik, hem de veri sokmak için standart eğrileri oluşturmak değerlendirilmesi gereklidir. "Hedef dışı" karışımlar özgüllük bir tahmin verecektir. Optimizasyon tutarlılığı sağlamak için gerekli olabilir. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 4:. Göreli qPCR (pan-STAT3 ve temizlik gen GUSB) Kalibrasyon deneyi için Şablon mutlak qPCR aksine, bu testin noktası büyütme verimi ~% 100 olduğundaki koşullarını belirlemektir.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 5:.. Pan STAT3 ve temizlik gen GUSB ölçmek için göreceli qPCR örnek testi için Şablon standart eğriler testlerin karşılaştırılabilir verimliliği sağlamak için örnekleri ile birlikte tekrarlanan bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 6: varyantları ölçmek için mutlak qPCR Örnek deneyi için şablon standart eğriler benzer eff sağlamak için numune ile birlikte tekrar edilir. tahlillerin nasıl etkin. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 7:.. ΔS varyantları ölçmek için mutlak qPCR örnek testi için Şablon standart eğriler testlerin karşılaştırılabilir verimliliği sağlamak için örnekleri ile birlikte tekrarlanan bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 8: pan-STAT3 ölçmek için mutlak qPCR örnek testi için Şablon.large.jpg "target =" _ blank "> Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Biz eozinofiller ve lenfoma hücrelerinde düzeyleri ve STAT3 bağlantı varyantı transkript oranlarını değerlendirmek ve sitokin uyarı seviyeleri ve oranlarını etkileyip etkilemediğini öğrenmek için bu protokolü geliştirdi. STAT3 kanser bir onkoproteinin veya tümör baskılayıcı gibi davranan konusunda çelişkili raporlar ile, nedeniyle pleiotropik ve belirsiz işlevsellik özel ilgi (referans ³³ gözden). STAT3 α ve β bağlantı varyantı fonksiyonu farklılıklar daha önce ^34,35 karakterize olmuştu, ve bizim protokol S optimal oranı için bir ihtiyaç olduğunu açıkça göstermektedir bir knock-down / yeniden ifade analizini kolaylaştırdı ve ΔS ¹⁹ transkript.

farklı ekleme varyantları doğru ölçümü varyant kompozisyon splice heterojen STAT3 fonksiyonu ile ilgili daha fazla soruşturma kolaylaştıracaktır. protokol ab yeteneğini birleştirerek, mutlak ve bağıl qPCR verileri entegreÇözünen qPCR bağlantı varyantı oranlarını hesaplamak için, ve göreli qPCR genel STAT3 ifade değişikliklerini ölçmek için. Bu yaklaşım bir 50'den fazla nükleotid arayla iki alternatif bağlantı yerlerinde yapıştırma oranları sırayla ince farkları ayırt eder ve aynı anda ölçmek için sağlar. Bireysel ekleme olayların oranlarını belirleme ko-yapıştırma önyargı ΔSβ seviyeleri iki site kullanımları rastgele ²⁵ spliced eğer beklenenden daha yüksek olacak şekilde varlığını dikkate değer bulgu elde olmazdı.

Kritik olarak, plazmid kalibrasyon eğrileri kullanılarak Mutlak qPCR çok benzer dizileri neden bağlantı varyasyonları (optimal verimde) ölçümü sağlar. Biz yeni bir ince ekleme qPCR tahlil optimize etmek için yaklaşık iki ay sürer tahmin ediyoruz. Tahlil gelişiminde önemli adımlar mutlak qPCR için standart eğrileri üreten kullanılan STAT3 plazmid yaratılması; deneyselözgüllük ve tekrarlanabilirliği sağlamak için en uygun astar dizileri ve bisiklet parametrelerini belirlemek; ve bağıl qPCR veri entegrasyonu GAPDH ifade pan-STAT3 ifade göreli miktarının elde. Kümülatif ölçümü karşı STAT3 pan ile ölçülebilir kopya sayısının korelasyon (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) protokolü güvenilir sonuçlar ürettiğini göstermektedir.

tekniğin uyarı geniş doğrulama işlemidir. Test içi değişkenlik (tekrarlanabilirlik), interassay değişkenliği (tekrarlanabilirlik) ve özgüllüğü değerlendirmek için gereklidir. protokol bu parametreler için sayısal çıkışları almak için yollar özetliyor. Biz, verimlilik özgünlüğü faktörü ≥4, varyasyon (tekrarlanabilirlik) katsayısı ≤10% ve Ct standart sapma (tekrarlanabilirlik) ≤0.2 olarak uygun eşik ³⁰ ≥75% sayılır. STAT3 sekansı amino asitler 1-690 mutasyonlar veya silme discove olmayacakonlar ekleme oranlarını etkileyebilir, ancak bu protokol ile kırmızı. Transkript oranları oranları ³⁶ proteoform orantılı olmayabilir.

örnekler, toplam cDNA başlangıç ​​farklı miktarlarda beri mutlak qPCR kurulu bir ev bakıcısı geni kullanarak görece qPCR ile birlikte sürece arası Örnek karşılaştırma için bir örnek içinde, ek yeri varyantlarının kopya sayısını karşılaştırarak ancak için uygundur. Yöntem tekrarlanabilirliği ³⁰ MIQE qPCR kurallarına uyan, tarif. PCR çevrim parametreleri ve primer konsantrasyonları diğer ekipman kullanıldığında tekrarlanabilir verileri elde etmek için modifiye edilmesi gerekebilir. Mükemmel özgüllük ölçüde ödün verim olmadan mümkün değildir, ancak hedef büyüklüğe arasında daha büyük dört ile daha etkili bir şekilde büyütülmüştür.

Lineer DNA, daha kolay bir şekilde dairesel daha yükseltilir. Alternatif bir plazmid tatmin edici standart eğrileri vermezse ^(R2 <; ) 0.95, miktarının öncesinde tek bir site kısıtlaması ile plazmid linnerleştirilmesi düşünün. QPCR Optimize kaliteli verileri (Şekil 1) elde etmek için çok önemlidir. En qPCR protokolleri iki aşamalı bisiklet güveniyor ve makineler buna göre optimize edilmiştir. Isıtma bloğunun düzgün olmayan ısıtma zayıf tekrarlanabilirlik katkıda üç adımlı bir bisiklet şiddetlenebilir. Tahliller ideal özel bir laminer akış kaputu, filtre pipet uçları ve ultra saf su ile steril şartlar altında kurulmalıdır. kirleticiler tutarsız sonuçlara yol açabilir, çünkü tahliller ideal özel bir laminer akış kaputu, filtre pipet uçları ve ultra saf su ile steril şartlar altında kurulmalıdır. QPCR optimizasyonu hakkında daha fazla bilgi için, Bustin ark bakın. ³²

STAT3 nicel bağlamda bir dizi daha fazla fikir neden olabilir. STAT3 kendi ifadesini ³⁷ otomatik düzenler ve yukarıda açıklanan protokol yardımcı olabilirSTAT3 ekleme varyantları oranları bu pozitif geri besleme döngüsü düzenleyen katkısı olup olmadığını aydınlatmak için. Protokol farklı yoğunluklarda ³⁸ ya da gelişimi boyunca hücrelerinde görüldüğü gibi uç uca ekleme varyantı oranlarında vardiya çalışma için kullanılabilir: Bu bilinmektedir hematopoez ¹⁶ sırasında protein düzeyinde STAT3 α / β oranı değişir. Sundin ve ark. bulundu Eyüp'ün sendromlu ³⁹ hastanın STAT3 içinde ekson 12 bir intronik tek nükleotid polimorfizm önyargılı ekleme. Ekson 21 ve 22 ya da ekson 22 ve 23 arasında intronlar mevcut birçok SNP biri, sırasıyla ΔS / S ekleme oranları ve α / p katkıda bulunabilir düşünülebilir. Tahlil yapıştırma düzenlenmesinde mutasyonlar ya da değişiklikler yapıştırma işlemi ⁴⁰ yanlılık olabilir kanserli hücrelerin içinde STAT3 transkript ölçmek için kullanılabilir. Ekleme faktörlerindeki mutasyonlarla (SF3B1 gibi) Gözlem olarakmiyelodisplastik sendromlarda ⁴¹ ed da bu protokol ile ölçülebilir değişikliklere yol açabilir.

Daha geniş anlamda, bu yaklaşım özellikle klasik RNA Sek, ne de standart qPCR ile mümkün değildir yapıştırma co-dernek, algılar. dışlayan ekson yapıştırma fenomen yapıştırma kararlarının koordinasyonu gösterirken, diğer birleştirme olayların ortak dernek iyi araştırılmış değil. Tam boy cDNA sorguya şekilde RNA Seq değiştirildiği bir en son tarif edilen alternatif bir yöntem, uzak bağlama olaylan daha fazla ko-bağımlı önce ⁴² düşünülenden daha olduğunu düşündürmektedir.

STAT3 bir donör tandem ekleme sitesi içerir. Alıcı tandem ekleme siteleri ⁴³ daha sıktır ve özetlenen protokol esasları NAGNAG yapıştırma ve 200 nükleotid içindeki diğer yapıştırma olayların tesadüf tespiti için deneyler geliştirmek için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir. diğer Potentansiyel uygulamaları indellerin veya çift / üçlü nükleotid polimorfizmlerinin ⁴⁴ gibi diğer ince dizi farklılıkları, tesadüf ölçümü içerir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	GMI	N/A	Used for standard PCR
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	N/A	qPCR machine
GS-6R	Beckman Coulter	N/A	centrifuge for 96-well plates
Nanodrop 2000 sprectrophotometer	ThermoFisher Scientific	N/A
RPMI-1640 medium	Sigma Aldrich	R8758	cell culture medium
PfuTurbo DNA Polymerase	Agilent Technologies	600410	DNA polymerase for standard PCR
KpnI	New England Biosciences	R0142S
NheI	New England Biosciences	R0131S
SYBR Green PCR Master Mix	Qiagen	330523	qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74204	RNA extraction kit
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen (ThermoFisher Scientific)	18080-044	cDNA synthesis kit
Primers	Integrated DNA Technology	N/A
NEBuffer 1.1	New England Biosciences	B7201S
GenePure LE Agarose	ISC BioExpress	E-3120-500	component of TAE gel
Pipettors	Major lab suppliers (MLS)	N/A
Filter pipette tips	Neptune Scientific	BT10XL, BT20, BT200
EU One Piece Thin Wall Plate	MidSci	ABI7501
ThermalSeal A Sealing Film	MidSci	TSA-100	96 well plate seal
pET-Elmer (variant of pET-28a)	Novagen; modified in Mosher lab	N/A	Details in PMID: 20947497
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	A1460	Plasmid purification
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	ThermoFisher Scientific	4337455	Sequencing kit
QIAEX II Gel Extraction kit	Qiagen	20021	Amplicon purification
DH5α competent cells	ThermoFisher Scientific	18265-017	available from several providers, see PMID: 2162051
kanamycin	Research Products International Corp.	K22000-5.0
Tris base	ThermoFisher Scientific	BP152-5	component of TAE buffer
Acetic acid, glacial	ThermoFisher Scientific	A38C-212	component of TAE buffer
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)	E-5134	component of TAE buffer
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	component of Luria Broth
Bacto Yeast extract, technical	BD Biosciences	288620	component of Luria Broth
Sodium chloride	ThermoFisher Scientific	S271-10	component of Luria Broth
Sodium hydroxide	ThermoFisher Scientific	SS255-1	component of Luria Broth
Bacto Agar	BD Biosciences	214010	component of Luria Broth plate
Lasergene SeqBuilder	DNASTAR		Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR)