シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

要約

ナノ粒子は、適応症の広い範囲のための薬物送達システムを有望として浮上しています。ここでは、リバースエンジニアリングカイコの絹を使用して、絹のナノ粒子を製造するためのシンプルで強力な方法を記載します。これらの絹ナノ粒子は容易に治療的ペイロードとロードされ、その後、薬物送達用途のために探索することができます。

要約

絹は、その優れた機械的性質、生体適合性および生分解性、並びに保護及びその後のトリガに応答して、ペイロードを放出する能力の生物医学的及び医薬用途のための有望なバイオポリマーです。シルクは、様々な材料の形式に製剤化することができるが、絹ナノ粒子は、有望な薬物送達システムとして浮上しています。そこで、この記事では、安定したシルクのナノ粒子を生成するために使用することができます再生絹溶液を得リバースエンジニアリングの絹の繭のための手順を説明しています。これらのナノ粒子は、その後、薬物がロードされ、潜在的な抗癌薬物送達システムとして調査、特徴付けられます。簡単に言うと、絹の繭は逆の、繭を脱ガムすることにより、第1工学絹の溶解に続いて、水性シルク溶液を得、クリーンアップされています。次に、再生絹溶液は絹のナノ粒子を得るために、ナノ沈殿に供される - シンプルだが強力な方法それは、均一なナノ粒子を生成します。絹ナノ粒子は、そのサイズ、ゼータ電位、水性媒体中で形態および安定性、ならびに化学療法ペイロードを捕捉し、ヒト乳癌細胞を死滅させるそれらの能力に応じて特徴付けられます。全体的に、記載された方法は、潜在的なナノ医療としての使用を含む、容易に無数の用途のために検討することができます均一な絹ナノ粒子を、もたらします。

概要

細胞および組織を標的とする - 例えば、タンパク質、ペプチドおよび小分子薬物 - ナノサイズの薬物送達システムは、多くの場合、薬物放出を制御するために、および治療的ペイロードの多様なセットを提供するために使用されます。これらの治療のペイロードは、しばしば、リポソーム、（デンドリマーを含む）、水溶性ポリマー、およびマイクロおよびナノ粒子¹のような種々の高分子薬物担体に組み込まれています。 （典型的には1nm〜1000nmでのサイズ範囲の）ナノ粒子は、広く、特に抗癌薬物送達²ため、潜在的な薬物担体として検討されています。薬物送達のためのより多くのナノ粒子が、今の臨床試験^4に入っているように、日常の臨床実践³へのアブラキサンの導入に成功したが（120nmでのサイズのアルブミンベースのナノ粒子は、パクリタキセルでロード）、フィールドを触媒しました。固形腫瘍は、一般的に、そのn個を意味する貧しいリンパの流れを示し、漏出性血管を持っています200ナノメートルまでのanoparticlesは、受動的に静脈内投与後、これらの腫瘍を標的とすることになります。この受動的ターゲティング現象は、強化された透過性および保持（EPR）効果と呼ばれ、最初の1986年⁵で報告された。EPR効果が与えられた薬物用量場合の腫瘍微小環境内の薬剤濃度の50〜100倍の増加につながることができます薬物ペイロードは担体なしではなく、遊離薬物より高分子薬物担体アプローチを用いて送達されます。抗がん薬物送達のために設計された薬物担持ナノ粒子は、腫瘍微小環境に到達するために持っていると、薬物がその所望の治療効果^3を達成するためにするために、多くの場合、通常はエンドサイトーシス取り込みによって、特定の細胞内区画を入力する必要があります。細胞内薬物送達のために設計されたナノ粒子は、細胞へのゲートウェイ、ならびに薬物耐性メカニズムを克服するための経路として、エンドサイトーシスを利用します。ナノ粒子からの薬物放出は、しばしば、特にOに設計されていますリソソームにおけるccur（ すなわち 、リソソーム薬物送達）ナノ粒子のキャリア（リソソームpHは約4.5）のpH応答性薬物放出やキャリア⁷からペイロードを解放するリソソーム酵素のためのトリガーとして機能することができる^6。

材料の多くの異なるクラスは、ナノ粒子（ 例えば、金属および多くの有機及び無機材料）を生成するために使用することができます。しかし、生体高分子は、その既知の生体適合性、生分解性および低毒性⁸の魅力材料として浮上しています。多くの生体高分子は、アルブミン、アルギン酸塩、キトサン、シルクなど、探索されています。これらの中で、絹は、薬物送達システム⁹への開発のための有望な候補として浮上しています。様々な種類の絹は（ 例えば 、 カイコ ）（ 例えば 、Nephilaのclavipes）クモおよびカイコなどの節足動物の数、によって製造されています。カイコ絹ははるかにEXTENを使用されています、異常にクモの糸よりもカイコは完全に家畜化されているので、そのシルクは、このように再現可能な出発物質を表します。カイコ絹は、食品医薬品局（FDA）は、特に縫合材料として、ヒトへの使用のための材料を承認しています。それは、ヒトにおける強固な安全記録を有しており、 生体内 ¹⁰ で分解することが知られています。絹の分解プロフィールは、時間（低結晶性絹）から12ヶ月以上の範囲（高結晶性絹）に微調整することができます。シルク分解産物は非毒性であり、本体¹⁰に代謝されます。絹の構造は、薬物放出制御のための良い材料作り、低分子量化合物と高分子タンパク質薬^11を結合する能力を付与します。タンパク質薬剤（ 例えば、抗体）は、免疫系による変性、凝集、タンパク質分解的切断およびクリアランスを受けやすいです。しかし、シルクは、そのナノ結晶の再の緩衝能力に治療用タンパク質を安定化gionsナノスケール¹¹で水分含量を調整する能力。これらのユニークな機能は、物理的な保護を提供し、ペイロードモビリティ^11を削減し、典型的には、他の（バイオ）ポリマーでは見られません。例えば絹ベースのヒドロゲル^12、フィルム^13〜15ナノ粒子^16,17のための多くの抗癌薬物送達システムは、現在^（18,19参考文献に概説）、これらの機能を活用するために開発されています

ここで、絹のナノ粒子は、拡張された時間枠にわたってそのサイズと電荷を決定することによって特徴づけられました。ドキソルビシン、臨床的に関連する抗癌剤は、薬物装填絹ナノ粒子で処理したトリプルネガティブヒト乳癌細胞における薬物負荷および細胞毒性研究のためのモデル薬物として使用しました。

プロトコル

カイコの繭からリバースエンジニアリングシルクソリューションの調製

注：この方法は、他の場所^12,27記載されているプロトコルに基づいています。

1. 5ミリメートルのx 5ミリメートル片にハサミで乾燥繭の5グラムをカット。あらゆる汚れたレイヤーを削除します。
2. 炭酸ナトリウムの4.24グラムを秤量し、蒸留水を沸騰の2 Lに慎重にこれを追加します。
   注：これは、0.02M炭酸ナトリウム溶液が得られます。
3. 絹繊維を脱ガムする60分間沸騰炭酸ナトリウム溶液と沸騰にカット繭片を追加します。均質な試料処理を確実にするために時々絹をかき混ぜます。
4. 精練された絹を削除し、20分間蒸留水1Lで洗浄します。洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。
5. 洗浄絹を削除し、余分な液体を除去した後、ほどく/手で絹を引っ張るようにうまくそれを絞ります。一晩乾燥空気にドラフト内でアンタイド絹を置きます。これは、典型的には、脱ガムの3.6gのを生じます同類繊維。
6. 次の日、5グラムの空気乾燥脱ガム絹繊維を秤量し、50ミリリットルのビーカーの底にしっかりとシルクを詰めます。
7. 新鮮9.3 MのLiBr溶液を調製します。 4ミリリットルのLiBr比に1グラムの絹を使用してのLiBrシルク繊維を溶解させます。蒸発を防止し、絹を60℃で完全に溶解させるためにアルミホイルで絹のLiBrサンプルをカバーします。このステップは、4時間を要し、時折攪拌することにより支援されます。
8. 5分間水中で透析カセット（3,500ダの分子量カットオフ）を濡らします。 15ミリリットルの透析カセットに15ミリリットルに絹のLiBr溶液を注入し、気泡を除去するために、針と注射器を使用しています。
9. 蒸留水1Lに対して透析（ すなわち 、初日の3変更）し、再び次の朝と夕方に（ すなわち 、2二日目の変化）、そして再び上の1、3、6時間目に水を変更翌朝（三日目、すなわち 、1変化します）。
10. シルクsolutiを収集透析カセットと遠心9,500×gで5℃で20分間、溶液からの。上清を回収し、二回以上、この遠心分離プロセスを繰り返します。
11. 空の計量ボート（W1）の重量を測定し、絹溶液1mlを追加します。再び（W2）の重量を記録し、次いで一晩60ºCで計量ボートを残すことによって、試料を乾燥させます。次に、全乾燥重量（W3）（乾燥シルクやボートの重さ）を決定します。シルク溶液（w / v）の濃度である：％=（W3-W1 / W2-W1）×100。

リバース・エンジニアリングシルクソリューションからシルクナノ粒子の作製

1. > 75％の（v / v）のアセトン溶液を維持しながら、アセトンをシルク溶液を滴下（w / v）の5％を加えます。例えば、34ミリリットルのアセトンに5％（w / v）のシルク溶液を滴下（50滴/分の速度で10μL/ドロップ）の9ミリリットルを追加します。
2. 4℃で2時間、48,000×gで沈殿物を遠心。
3. 上清を吸引し、PELLEを再懸濁第スパチュラでペレットを取り除く、次いで20 mlの蒸留水を添加することにより、蒸留水でT。へらからペレットを除去するために、ピペットチップを使用してください。 、30秒間30％の振幅で超音波プローブを使用して、2つの超音波処理サイクル、続いて20秒間蒸留水で容量遠心管上部までボルテックスしました。
4. 少なくとも2倍の遠心分離および再懸濁ステップを繰り返します。
5. 使用するまで4℃で2.3ストアに詳述するように、蒸留水6mlにペレットを再懸濁。細胞培養研究のために、絹ナノ粒子ストックは^、γ17を照射することができます。

シルクナノ粒子濃度の3決意

1. 4℃で2時間、48,000×gで遠心分離シルクナノ粒子。
2. 30秒間30％の振幅で2超音波処理サイクルに続いて、蒸留水3ml中のすべてのナノ粒子を集めます。
3. 2ミリリットルと1ミリリットルロットに絹のナノ粒子の3ミリリットル株式を分割し、広報に移します2ミリリットルのチューブを電子秤量。 2ミリリットルのサンプルの総重量を記録します。使用するまで4℃で1ミリリットルをたくさん保管してください。この1mLのサンプルを、較正曲線を生成するために使用されます。
4. その後、スナップ凍結し、一晩凍結乾燥機で2ミリリットルシルクナノ粒子の多くを凍結乾燥します。凍結乾燥後、2ミリリットルチューブを再秤量し、2ミリリットルのサンプル中にもともと存在していた絹のナノ粒子（ミリグラム）の量を計算します。
5. 5点較正曲線（0.04から7 mg / mlで）を生成するために蒸留水で1mLの絹ナノ粒子ストックを希釈します。サンプルは吸光度の最大値を超えていないことを確認してください。
6. 600nmでの各標準希釈液の吸光度を決定します。これは最高の96ウェルプレートのセットアップを使用して行われます。標準曲線のための濃度（mg / mlで）対プロット吸光度。その後、懸濁液中のシルクナノ粒子の濃度を決定するために、日常的に、この標準曲線を使用しています。

ドキソルビシンロードシルクナノ粒子の4準備

1. ドキソルビシン溶液の調製
   1. 蒸留水8mlに塩酸ドキソルビシンの1.2ミリグラムを溶解させます。
   2. 116μgの/ mlの（0.2マイクロモル/ミリリットル）の作業ストックを得、蒸留水で10mlにメイクアップ。
2. ドキソルビシン装填シルクナノ粒子の調製
   1. 2ミリリットルチューブシルクナノ粒子の10、30または50 mg / mlで200μlの0.2モル/ mlのドキソルビシン溶液を2ミリリットルを混ぜます。
   2. 回転ミキサー上で一晩、室温（25℃）でシルクドキソルビシンサスペンションをインキュベートします。
   3. 次に、30分間、194000×gでシルクドキソルビシンサスペンションを遠心分離します。蒸留水でドキソルビシンロードシルクナノ粒子を洗浄し、二回、この手順を繰り返します。
   4. （このサンプルは封入効率を決定するために使用される）、上清をプールし、総容量に注意してください。
   5. 4ºC国連で光とストアから守る、蒸留水にドキソルビシンロードシルクナノ粒子を再懸濁使用ゴマ。
3. カプセル化効率及び薬物負荷の決意
   1. 黒のマイクロタイタープレートへのステップ4.2.4からの上清をピペットで200μlの。
   2. 固定された光電子増倍管設定でドキソルビシン関連の蛍光を測定するために、蛍光マイクロプレートリーダーを使用してください。
   3. 590 nmの485 nmおよび発光波長に励起波長を設定し、蛍光値を記録します。
   4. ドキソルビシン較正曲線を生成します。測定は同一の機器の設定（ すなわち、固定された光電子増倍管設定で）で取得されていることを確認します。較正曲線を使用して、組み合わせた上清中のドキソルビシン濃度を計算します。 3つの独立した実験では、この測定を繰り返します。
   5. カプセル化効率を決定するために、式（1）を使用します。
      

シルクナノの5キャラクタリゼーション粒子

1. 新たに調製されたとストアドシルクナノ粒子のサイズおよびゼータ電位の評価。
   1. 4℃と25℃の蒸留水にストアシルクナノ粒子。
   2. 動的光散乱（DLS）を用いて0日目、14及び28の絹のナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を測定します。タンパク質¹⁷用蒸留水の1.33と1.60に屈折率を設定します。ユーザ・インタフェース・ソフトウェアを有する粒子サイズを計算します。
2. 走査型電子顕微鏡（SEM）によるシルクナノ粒子の形態学的評価。
   1. SEMスタブ上にカーボン接着剤のディスクを置き、その後、シリコンウエハを添付します。
   2. 1mg / mlの濃度に絹ナノ粒子を希釈します。ピペットシリコンウェーハ上に10μlのサンプルを、-80℃でサンプルを凍結し、一晩、製造元の説明書に従って凍結乾燥システムを使用して凍結乾燥します。
   3. コート金でサンプルの厚さは20nmまでの層低真空スパッターコーターを用いて。
      注：インストゥルメントの設定は、モデルによって異なります。ここで使用されるモデルは、完全に自動化されており、厚さのみによって動作します。
   4. 5 kVので走査型電子顕微鏡および40,000倍の倍率で画像サンプル。

コントロールのインビトロ細胞毒性とドキソルビシンロードシルクナノ粒子6.

1. シルクナノ粒子への曝露後の細胞の生存率。
   1. 10％（v / v）のFBSを含むRPMI 1640中で培養MDA-MB-231細胞。組織培養のプレートの細胞がポリスチレンで処理し、37℃で加湿した5％CO ₂雰囲気中でインキュベートします。日常的に2〜3日毎に80％コンフルエンスで継代培養。
   2. 96ウェルプレート中で2×10 ⁴細胞/ cm ²の密度でプレートMDA-MB-231細胞。細胞は一晩を回復することを可能にします。
   3. μgの自由に拡散ドキソルビシン0.001（i）を追加し、（ii）は0.001〜0.5 mgのシルクナノ粒子および0.1mgシルクナノ粒子96ウェルプレート（最終容量ウェル当たり100μlの）に0.001から1μgのドキソルビシンを装填し。
   4. 72時間目（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT、PBS中に5mg / ml）を添加することによって、細胞の生存率および最大半量阻害濃度（IC _50）を決定する。インキュベート5時間、注意深くピペットでウェルを排出し、ジメチルスルホキシド100μlでホルマザンを溶解させる。560 nmの吸光度を測定します。3つの独立した実験では、この測定を繰り返します。
      注：未処理の対照の吸光度値は、100％の細胞生存度に対する基準値としての役割を果たす。
2. シルクナノ粒子に曝露された細胞のSEM。
   1. 2×10 ⁴細胞/ cm ²の密度でシード無菌カバーガラス上でMDA-MB-231細胞。細胞は一晩を回復することを可能にします。 72時間のための所望の処理条件に細胞を公開します。
   2. ディで洗浄し、30分間、PBS中の2％（v / v）のグルタルアルデヒドで細胞を固定他の場所²⁸に詳述したようstilled水二回、エタノール系列で脱水し、臨界点は、サンプルを乾燥させます。
   3. 金でサンプルが厚い低真空ス​​パッタコーターを使用して、20 nmのアップ層コートをスパッタ。
      注：インストゥルメントの設定は、モデルによって異なります。ここで使用されるモデルは、完全に自動化されており、厚さのみによって動作します。
   4. 画像5 kVの700倍の倍率の電子加速を使用して、SEMによるサンプル。

結果

以前に¹⁷に詳述するように、データを統計的に分析しました。スチューデントのt検定は、複数のサンプルについてボンフェローニの多重比較事後検定に続くサンプル対および一元配置分散分析（ANOVA）のために使用しました。次のようにアスタリスクは統計的有意性を示している：* P <0.05及び** P <0.001。すべてのデータは独立した実験の数を示す標準偏差?...

ディスカッション

種々の方法が^20をブレンド^するポリビニルアルコール、噴霧乾燥^21,22塩析、毛細管マイクロドット^23を印刷^し 、超臨界CO ₂沈殿^24（参照²⁶に概説）ナノ析出^16,25を含む、絹ナノ粒子を製造するために利用可能です。しかし、その全体的なシンプルさのために、ナノ析出は、絹のナノ粒子を生成するための最も人気の...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11		DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system