Производство и поставка снадобья Применение шелкового наночастицами

Резюме

Наночастицы появляются в качестве перспективных систем доставки лекарственных средств для широкого спектра показаний. Здесь мы опишем простой , но мощный способ изготовления наночастиц из шелка с использованием обратной инженерии тутовый шелкопряд шелк. Эти шелковые наночастицы могут быть легко загружены с терапевтическим полезной нагрузки, а затем исследовали для применения доставки лекарств.

Аннотация

Шелк является перспективным биополимер для биомедицинских и фармацевтических применений из-за его выдающиеся механические свойства, биосовместимость и биодеградация, а также его способность защищать и впоследствии освободить свою полезную нагрузку в ответ на спусковой крючок. В то время как шелк может быть приготовлена ​​в различных форматах материалов, наночастицы шелка появляются в качестве перспективных систем доставки лекарств. Поэтому в данной статье рассматриваются процедуры обратного инженерного коконов с получением регенерированного шелкового раствора, который можно использовать для создания стабильных наночастиц шелка. Эти наночастицы характеризуются впоследствии, наполненные лекарством, и исследовали в качестве потенциальной системы противоопухолевый доставки лекарственного средства. Вкратце, шелковые коконы обратной инженерии сначала дегуммирования коконов, а затем шелковой растворения и очистки, с получением водного раствора, шелка. Затем регенерированный шелк раствор подвергают nanoprecipitation с получением наночастиц шелка - это простой, но мощный методчто создает однородные наночастицы. Шелковые наночастицы характеризуются в соответствии с их размером, зета-потенциал, морфологии и стабильности в водной среде, а также их способность запутать полезной нагрузки химиотерапевтического и убить клетки рака молочной железы человека. В целом, описанная методика дает однородные наночастицы шелка, которые могут быть легко разведанные для множества приложений, в том числе их использование в качестве потенциального наномедицины.

Введение

Наноразмерные системы доставки лекарственных средств часто используются для контроля высвобождения лекарственного средства и доставлять разнообразный набор терапевтических полезных нагрузок - например, белки, пептиды и малых препаратов молекулярного веса - в клетки-мишени и ткани. Эти терапевтические полезные нагрузки часто включены в различные макромолекулярных носителей лекарственных средств, таких как липосомы, водорастворимые полимеры ( в том числе и дендримеров), а также микро- и наночастицы ^1. Наночастицы ( которые, как правило , в диапазоне размеров от 1 нм до 1000 нм) , которые в настоящее время широко исследованы в качестве потенциальных носителей лекарственных средств, в частности , для противораковой доставки лекарственных средств ^2. Успешное внедрение Abraxane (120 нм наночастицы размером альбумина на основе загружен с паклитакселом) в повседневную клиническую практику ³ стало катализатором поле, так что многие другие наночастицы для доставки лекарственных средств в настоящее время вступают клинические испытания ^4. Солидные опухоли обычно показывают плохое лимфатический дренаж и имеют протекающие кровеносные сосуды, что означает, что пanoparticles до 200 нм будет пассивно направлены на этих опухолей после внутривенного введения. Это пассивное явление называется нацеливание Улучшенную проницаемость и удерживающую способность (ЭПР) и был впервые описан в 1986 году ^5. ЭПР эффект может привести к 50- до 100-кратного увеличения концентрации препарата в опухоли микроокружения для данной дозы препарата при полезная нагрузка препарат поставляется с использованием макромолекулярную подход носителя лекарственного средства, а не свободное лекарственное средство без носителя. Лекарственное наночастицы загруженным , предназначенные для противораковой доставки лекарственного средства должны достичь микросреды опухоли и часто должны ввести определенный внутриклеточный отделение, как правило , путем эндоцитоза поглощения, для лекарственного средства для достижения ее желаемого терапевтического эффекта ^3. Наночастицы, предназначенные для внутриклеточной доставки лекарственного вещества используют эндоцитоз в качестве шлюза в клетку, а также пути преодоления механизмов лекарственной устойчивости. Высвобождение лекарственного средства из наночастиц часто специально разработан для оCCur в лизосомах (т.е. лизосомотропный доставки лекарственного средства) ⁶ , где рН отзывчивость носителя наночастицами (лизосомальная рН примерно 4,5) может служить триггером для высвобождения лекарственного средства или лизосомальных ферментов, выделяющих полезную нагрузку от носителя ^7.

Много различных классов материалов , могут быть использованы для создания наночастиц (например, металлов и целого ряда органических и неорганических материалов). Тем не менее, биополимеры появляются как привлекательные материалы из - за их известной биосовместимости, биоразлагаемости и низкой токсичностью ^8. Многие биополимеры в настоящее время изучаются, в том числе альбумин, альгинат, хитозан и шелка. Из них, шелк стала перспективным претендентом на развитие в системах доставки лекарственных средств ^9. Шелка различных типов производятся несколькими членистоногих, включая пауков (например, Nephila clavipes) и шелкопрядов (например, тутовый шелкопряд). Шелкопряд шелк используется гораздо больше EXTENключительно, чем шелка паука, потому что шелкопряд полностью одомашнены и, таким образом, его шелк представляет собой воспроизводимое исходный материал. Шелкопряд шелк является Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило материал для использования человеком, в частности, в качестве шовного материала; он имеет надежную показатели безопасности в организме человека и , как известно, разлагаются в естественных условиях ^10. Профиль деградации из шелка может быть доработаны в диапазоне от нескольких часов (низкий кристаллический шелк) до 12 месяцев или более (высокий кристаллический шелк). Шелковые продукты разложения являются нетоксичными и метаболизируются в организме ^10. Шелк структура придает способность связывать небольшие соединения молекулярной массой и макромолекулярных препаратов ¹¹ белка, что делает его хорошим материалом для контролируемого высвобождения лекарственного средства. Белковые препараты (например, антитела) , чувствительны к денатурации, агрегации, протеолитическое расщепление и клиренса иммунной системы. Тем не менее, шелк стабилизирует терапевтические протеины из-за буферной способности его нанокристаллической регионов и его способность адаптировать содержание воды на наноуровне ^11. Эти уникальные особенности обеспечивают физическую защиту и уменьшить полезную нагрузку мобильности ¹¹ и , как правило , не видели с другими (био) полимеров. Многие системы доставки противоракового лекарственного средства, например шелка на основе гидрогелей ^12, пленки ^13-15 и наночастиц ^16,17, в настоящее время разработаны , чтобы использовать эти функции (обзор в ссылках ^18,19)

Здесь наночастицы шелка были охарактеризованы путем определения их размера и заряда в течение длительного периода времени. Доксорубицин, клинически значимый противораковое лекарственное средство, использовали в качестве модельного лекарственного средства для загрузки лекарственного средства и цитотоксичности исследований в тройном отрицательных клеток рака молочной железы человека, обработанных наночастиц шелковых наркотиков загруженным.

протокол

1. Получение обратной инженерии шелкового решение от тутовый шелкопряд Коконы

Примечание: Данная методика основана на протоколах , описанных в других ^12,27.

1. Отрежьте 5 г сухих коконов с ножницами на 5 мм х 5 мм штук. Удалите все загрязненные слои.
2. Взвешивают 4,24 г карбоната натрия и добавить осторожно к 2 л кипящей дистиллированной воды.
   Примечание: В результате получается раствор карбоната натрия 0,02 М.
3. Добавьте нарезанные кокон кусочки в кипящий раствор карбоната натрия и кипятят в течение 60 мин до DEGUM шелковые волокна. Перемешать шелк иногда, чтобы обеспечить однородную обработку образца.
4. Удалите Degummed шелк и промывают 1 л дистиллированной воды в течение 20 мин; повторить стадию промывки по меньшей мере, 3 раза.
5. Удалите промытого шелк и отожмите ее, чтобы удалить лишнюю жидкость, а затем развязать / тянуть шелк вручную. Поместите РАЗВЯЗАЛ шелк в вытяжном шкафу, чтобы высохнуть на воздухе в течение ночи. Как правило, это дает 3,6 г Degummed сИЛК волокна.
6. На следующий день, отвешивают 5 г высушенных на воздухе Degummed шелковые волокна и упаковать шелк плотно в дно стакана емкостью 50 мл.
7. Приготовить свежий раствор 9,3 М LiBr. Растворите шелковые волокна в LiBr с использованием 1 г шелка соотношении 4 мл LiBr. Накройте образец шелка LiBr с алюминиевой фольгой для предотвращения испарения и позволить шелка до полного растворения при 60 ° C. Этот шаг занимает до 4 часов и помогали периодически перемешивая.
8. Влажный диализной кассеты (молекулярная масса отсечки 3500 Da) в воде в течение 5 мин. Вводят 15 мл шелк LiBr раствор в диализной кассеты 15 мл и с помощью иглы и шприца, чтобы удалить пузырьки воздуха.
9. Диализировать против 1 л дистиллированной воды и менять воду на 1, 3 и 6 часов (то есть, 3 изменения в первый день) и снова на следующее утро и вечером (то есть, 2 меняется на второй день), и снова на следующее утро (то есть, 1 смена на третий день).
10. Соберите шелковые Solutiна из диализной кассеты и центрифугировать раствор в течение 20 мин при температуре 5 ° C при 9,500 х г. Восстановление супернатант и повторите этот процесс центрифугирования в два раза больше.
11. Определите вес пустого взвешенную лодочку (W1) и добавьте 1 мл раствора шелка. Запишите вес снова (W2), а затем высушить образец, оставив лодку весом при 60 ° С в течение ночи. Затем определяют общий сухой вес (W3) (высушенный шелк и весом лодки). Концентрация шелкового раствора (вес / объем) составляет:% = (W3-W1 / W2-W1) х 100.

2. Получение шелкового наночастицами от обратного проектирования шелкового решения

1. Добавление 5% (вес / объем) по каплям раствор шелка в ацетоне при сохранении> 75% (об / об) раствора ацетона. Например, можно добавить 9 мл 5% -ного (вес / объем) по каплям раствор шелка (10 мкл / капли со скоростью 50 капель / мин) до 34 мл ацетона.
2. Центрифуга осадок при 48000 х г в течение 2 часов при температуре 4 ° С.
3. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют Pelleт в дистиллированной воде, сначала выбивании осадок с помощью шпателя, а затем добавлением 20 мл дистиллированной воды. Используйте пипетку советы для удаления осадка из шпателем. После того, как встряхиванием в течение 20 секунд с последующими двумя циклами обработки ультразвуком с использованием ультразвукового зонда при амплитуде 30% в течение 30 сек, доливают центрифугу трубку к емкости с дистиллированной водой.
4. Повторите центрифугирования и ресуспендирования шаг, по крайней мере в два раза.
5. Ресуспендируют осадок в 6 мл дистиллированной воды, как указано в 2.3, и хранят при температуре 4 ° С до использования. Для исследования клеточных культур, шелковые запасы наночастиц может быть гамма - излучением ^17.

3. Определение концентрации шелкового наночастиц

1. Наночастицы шелковые центрифуге при 48000 х г в течение 2 ч при 4 ° С.
2. Соберите все наночастицы в 3 мл дистиллированной воды, а затем два цикла обработки ультразвуком при амплитуде 30% в течение 30 сек.
3. Разделите запас наночастиц шелка 3 мл на 2 мл и 1 мл много и передачи в пре-взвешивают 2 мл пробирки. Регистрируют общий вес образца 2 мл. Хранить много 1 мл при 4 ° С до использования; это 1 мл образца будет использоваться для создания калибровочной кривой.
4. Мгновенного замораживания, а затем лиофилизацией 2 мл шелка наночастицами много в сублимационной сушилке в течение ночи. После сушки вымораживанием, МЛ повторное взвешивание трубки 2 и рассчитать количество наночастиц шелка (мг), который был первоначально присутствует в образце 2 мл.
5. Развести 1 мл шелковое наночастицами запас дистиллированной водой для создания 5-балльной калибровочной кривой (0.04-7 мг / мл). Убедитесь в том, что образцы не превышают максимальную оптическую плотность.
6. Определить оптическую плотность каждого стандартного разведения при 600 нм. Это лучше всего сделать с помощью 96-луночного установки плиты. Участок поглощения в зависимости от концентрации (мг / мл) для стандартной кривой. Затем с помощью стандартной кривой обычно для определения концентрации наночастиц шелка в суспензии.

4. Подготовка Доксорубицин-нагруженной шелкового наночастицами

1. Приготовление раствора доксорубицина
   1. Растворить 1,2 мг доксорубицина HCl в 8 мл дистиллированной воды.
   2. Изготавливают до 10 мл дистиллированной воды, чтобы получить рабочий запас 116 мкг / мл (0,2 мкмоль / мл).
2. Получение Доксорубицин-нагруженной шелкового наночастицами
   1. Смешайте 2 мл 0,2 мкмоль / мл доксорубицина раствора с 200 мкл 10, 30 или 50 мг / мл наночастиц шелка в 2 мл пробирку.
   2. Выдержите шелка-доксорубицин суспензии при комнатной температуре (25 ° С) в течение ночи на миксере.
   3. Далее, центрифугирование шелковую-доксорубицин суспензии при 194000 х г в течение 30 мин. Вымойте доксорубицин загружены шелковые наночастицы с дистиллированной водой и повторите эту процедуру еще два раза.
   4. Бассейн супернатант и отмечают общий объем (в этом примере используется для определения эффективности инкапсулирования).
   5. Ресуспендируют доксорубицин загружены шелковые наночастицы в дистиллированной воде, защищенном от света и хранить при температуре 4 ºC ипсезам использования.
3. Определение Encapsulation эффективности и наркомании Загрузка
   1. Пипеткой 200 мкл надосадочной жидкости со стадии 4.2.4 в черную планшет для микротитрования.
   2. С помощью флуоресцентного микропланшет-ридера для измерения доксорубицин-ассоциированной флуоресценции при установке фиксированной ФЭУ.
   3. Установите длину волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 590 нм и записать значения флуоресценции.
   4. Генерация калибровочной кривой доксорубицин. Обеспечение измерения приобретаются с одинаковыми параметрами прибора (т.е. с фиксированной настройкой ФЭУ). По калибровочной кривой, вычислить концентрацию доксорубицина в комбинированном супернатанта. Повторите это измерение в трех независимых экспериментах.
   5. С помощью уравнения (1) для определения эффективности инкапсулирования:
      

5. Характеристика шелкового Nanoчастицы

1. Оценка размера и дзета-потенциал свежеприготовленную и сохраняемого шелкового наночастицами.
   1. шелковые наночастицы Хранить в дистиллированной воде при температуре 4 ° С и 25 ° C.
   2. Измерьте размер и дзета-потенциал шелковых наночастиц в дни 0, 14 и 28 с использованием динамического рассеяния света (DLS). Установить показатели преломления 1,33 для дистиллированной воды и 1,60 для белка ^17. Расчет размеров частиц с помощью программного обеспечения пользовательского интерфейса.
2. Морфологическое Оценка шелковых наночастицами методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
   1. Поместите клейкую углерода диск на заглушке в РЭМ, а затем присоединить кремниевую пластину.
   2. Развести наночастицы шелка до концентрации 1 мг / мл. Внесите 10 мкл образца на кремниевой подложке, замерзают образца при температуре -80 ° С и лиофилизации в течение ночи с использованием системы для сублимационной сушки в соответствии с инструкциями изготовителя.
   3. Покрыть образец с золотой слой толщиной до 20 нмс использованием низкого вакуума дл покрыти распылением.
      Примечание: Настройки прибора зависит от модели. Используемая здесь модель полностью автоматизирована и работает только толщиной.
   4. Образцы изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа при 5 кВ и увеличении в 40000 раз.

6. В Vitro цитотоксичности управления и доксорубицин-нагруженной шелкового наночастицами

1. Жизнеспособность клеток после воздействия шелкового наночастицами.
   1. Культура клеток MDA-MB-231 в среде RPMI 1640 с добавлением 10% об / об FBS. Пластина клеток на культуре ткани обрабатывают полистирол и инкубировать в увлажненной 5% CO ₂ атмосферы при температуре 37 ° С. Субкультуры в плановом порядке 80% слияния каждые 2-3 дня.
   2. Пластина клеток MDA-MB-231 при плотности 2 х 10 ⁴ клеток / см ² в 96-луночных планшетах. Разрешить клеткам восстановиться в течение ночи.
   3. Добавить (I) 0,001-1 мкг свободно диффундирующего доксорубицина, (II) 0,001-0,5 мг наночастиц шелка и 0,1 мг шелка наночастицызагружен с 0,001-1 мкг доксорубицина в 96-луночные планшеты (конечный объем 100 мкл на лунку).
   4. Определение жизнеспособности клеток и половину максимальной ингибирующей концентрации (IC ₅₀₎ путем добавления (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ 5 мг / мл в PBS) в 72 ч. Инкубируйте в течение 5 часов, осторожно слейте лунки пипеткой и растворить формазана 100 мкл диметилсульфоксида. Измерьте оптическую плотность при 560 нм. Повторите это измерение в трех независимых экспериментах.
      Примечание: Значения оптической плотности необработанных контрольных служат в качестве опорного значения для 100% жизнеспособности клеток.
2. СЭМ клетках, подвергнутых шелкового наночастицами.
   1. Семенной клетки MDA-MB-231 на стерильные покровные стекла при плотности 2 × 10 ⁴ клеток / см ^2. Разрешить клеткам восстановиться в течение ночи. Защиту клетки к желаемому условий обработки в течение 72 ч.
   2. Закрепить клеток с 2% об / об глутаральдегида в PBS в течение 30 мин, промывают диуспокоены воды дважды, обезвоживают с серией этанола, и критическая точка высушить образцы, как подробно описано в другом месте ^28.
   3. Sputter пальто образцы с золотой слой до 20 нм толщиной с использованием низкого вакуума для нанесения покрытий распылением.
      Примечание: Настройки прибора зависит от модели. Используемая здесь модель полностью автоматизирована и работает только толщиной.
   4. Изображение образцы помощью сканирующего электронного микроскопа с использованием электронного ускорения 5 кВ и увеличение 700-кратное.

Результаты

Данные были статистически проанализированы , как описано ранее ^17. Т-тест Стьюдента используется для пар проб и один дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим многоуровневым сравнением Бонферрони постфактум тест для нескольких образцов. Звездочка обозначает стат...

Обсуждение

Существуют различные методы для получения наночастиц из шелка, в том числе поливинилового спирта смешивания ^20, распылительная сушка ^21, высаливания ^22, капиллярный MicroDot печати ²³ сверхкритического СО ₂ осадков ²⁴ и nanoprecipitation ^16,25 (обзор в ссылке ^26)....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11		DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system