ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

要約

ここで、我々は、改善された染色質、及びそれによって自動取得し、自由に利用可能なソフトウェアのImageJを用いた繊維集団の定量化を可能にする迅速な筋線維分析、のためのプロトコルを提示します。

要約

筋線維集団の定量化は、疾患、外傷、および骨格筋組成上の様々な他の影響の影響をより深く洞察を提供します。様々な時間のかかる方法は、伝統的な研究の多くの分野で、繊維集団を研究するために使用されています。しかし、最近、単一のセクションに複数の繊維の種類を識別するために迅速な代替手段を提供ミオシン重鎖タンパク質の発現に基づいて免疫組織化学的方法を開発しました。ここでは、全体の断面の自動取得とImageJの有する繊維集団の自動定量化を可能にする、改良された染色質のため、迅速な信頼性及び再現性のプロトコルを提示します。この目的のために、埋め込まれた骨格筋は、細胞核染色のための二次蛍光抗体およびDAPIでミオシン重鎖抗体を用いて染色し、断面にカットされています。全体の断面は、高解像度の複合体を得るためにスライドスキャナを使用して自動的に走査されます試料全体の絵。ファイバー人口分析は、その後、ImageJのための自動化されたマクロを使用して、遅い中間と高速繊維を定量化するために実施されています。我々は以前、この方法は、±4％の程度まで確実繊維集団を識別することができることを示しています。加えて、この方法は、ユーザ間のばらつきを低減し、大幅にオープンソースプラットフォームのImageJを用いて分析時間当り。

概要

骨格筋組成物は、加齢^1、2、運動^{3、4、5、6、7、}またはそのような疾患^8、9、10または外傷¹¹などの病態生理学的プロセスのような生理学的プロセス中深い変化を受けます。したがって、研究のいくつかのフィールドは、機能的な変化を理解するために、これらのプロセスの構造的な影響に集中します。筋肉の機能を決定する重要な側面の一つは、筋線維の組成物です。筋線維は、異なるミオシン重鎖（MHC）タンパク質を発現し、それにより^{、 図13に示す}よう^に 、低速、中間、又は高速繊維^7、12に分類され ^{>、14、15、16、17。}生理学的に、筋肉は体にその機能に応じて、異なる筋線維組成を有します。筋線維タイプを使用して、繊維集団は、生理的または病態生理学的過程^7,17に適応を同定するために定量化することができます。歴史的に、時間のかかる方法の数は、筋線維の種類を区別するために適用されています。この目的のために、筋線維は、種々のpHレベルまたは筋肉酵素活性におけるミオシンATPアーゼの反応のいずれかにより分類しました。異なる繊維品質が単一のセクションで評価することができなかったように、複数の断面は^、全ての筋線維を識別し、手動定量^{14、16、17を}可能にするために必要でした= "XREF"> ^{18、19、20、21、22。}対照的に、最近の刊行物は、急速に、単一の断面における複数の繊維タイプを染色するためにミオシン重鎖タンパク質に対する免疫組織化学（IHC）を用いました。この手順の利点に基づいて、それは今筋線維人口分析^19、23、24におけるゴールドスタンダードと考えられています。改善IHC染色プロトコルを使用して、我々は最近、全体の筋肉の断面の完全自動取得とその後の自動筋繊維の定量化は、オープンソースプラットフォームのImageJを使用して実現可能であることを示すことができました。手動定量に比べ、我々の手順を^{4〜25％、±}正確ながらスライドごとに必要な時間の有意な減少（手動分析の約10％）を得ましたアップ。

この方法の全体的な目標は、オープンソースのプラットフォームを使用して、全ラットの筋肉中に自動筋繊維定量化への迅速な、信頼性の高い、ユーザーから独立したガイドを記述することです。また、我々は、マウスまたはヒトの筋肉などの他の検体のためのその使用を可能にする可能性のある変更について説明します。

プロトコル

FELASA ²⁶で推奨されているように、動物の被験者を含むすべての手順は、実験動物のケアの原則を遵守して行われました。 BMWF-66.009 / 0222-WF / II / 3B /：ウントForschung、参照番号Wissenschaft Bundesministeriumのfuer：承認前の研究と科学のためのウィーン医科大学の施設内倫理委員会とオーストリア省の調査（BMWFに得られました2014）。

1.筋肉の収穫

注：孟らによる以前の刊行。 ^27は非常に詳細に筋肉標本の正しい凍結を記述可能です。

1. すぐに動物の安楽死した後、全体の断面を取得するために全体の筋肉や十分な組織を入手します。
   1. 麻酔をかけたか、安楽死させたラットからの全体の筋肉を削除します。ピンセットやハサミで筋肉を取り巻くすべての結合組織や腱を削除します。以下のためにnesthesiaや安楽死、FELASA ²⁸の国際的なガイドラインに従ってください。
2. 校正精度のスケールを使用して筋肉を秤量します。このクイックステップは、特に介入手順の後、筋肉のサンプル間の比較分析を可能にします。
3. すべての側面に1mm程度の安全マージンで筋肉の大きさに応じて、OCT化合物を用いて完全に充填された容器の中に筋肉を置く（ 例えば 、アルミニウム箔からなります）。
4. 約2分間で凍結液体窒素を使用してイソペンタンを予冷。イソペンタンは容器の底に白い結晶を示し始める必要があります。
   注：この手順は、筋肉の正しいアーキテクチャを維持するために不可欠であるし、それによって正しい染色と繊維が^27を分析することができます。
5. ストアサンプルを-80℃で少なくとも24時間OCTで保存します。サンプルは、しかし、corre場合、数ヶ月または数年もの間-80°Cで保存することができます CTLY冷却しました。
6. クライオトームを用いて-20℃で筋の中央部から10μmの横断切片を切断します。 10ミクロンに切断することは不可能である場合、20μmの最大値までが2μmのステップの厚さを増します。十分に鋭利な切断刃は、この工程のために不可欠です。
7. 断面にスライドを近似することにより、接着剤のスライドにセクションを適用します。断面は、自動的に接着剤をスライドに固執します。一晩染色の前に-20℃でスライドを保管してください。

2.染色

注：ミオシン重鎖タンパク質に対する抗体の大多数が利用可能です。しかし、高品質な抗体は自動取得と分析のために不可欠です。希釈液及び抗体への参照は、 表1を参照されたいです。 スプレッドシートファイルが正しい希釈を計算し、必要な溶液量の数を確認するために、参照source.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplementalファイル1。

1. 解凍し、染色手順の前に10分間の凍結筋肉切片を空気乾燥させます。
2. 洗浄は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）+ 0.05％トリトンX 10分間、次いで5分間で慎重にスライドします。トリトンは大幅染色の質を改善することが示されています。詳細については説明を参照してください。
3. 2分間の切片の空気乾燥させると、（抗体の必要量を最小限にするために）と15分間追加の乾燥を可能にする疎水性のペンを使用して、各スライド上の個々の断面の輪郭を描きます。
4. 室温で1時間、10％ヤギ血清を含むPBS + 0.05％トリトンX（PBST）を有するすべてのスライドを阻止します。
5. 10％ヤギ血清を含むPBS + 0.05％トリトンX（PBST）のカクテルのすべての一次抗体（ 表1）を希釈します。適用の前に十分に混ぜます。トリトンX全体断面の等しい染色のために必須です。計算します断面あたりの一次抗体カクテルの約30μL。
6. 手順2.7から2.13のために光から十分な保護を確保します。薄暗い部屋の照明やカバー染色トレイには、十分な保護を提供します。また、染色中に湿った環境を提供し、乾燥を防ぐために、下部に流体で染色トレイを埋めます。
7. 室温で湿った染色トレイに1時間にわたりスライドを一次抗体（ 表1）カクテルを適用します。
8. 5分間新しいPBSTで、10分間、PBS + 0.05％トリトンXでスライドを洗浄し。
9. PBS + 0.05％トリトンX（PBST）+ 10％ヤギ血清のカクテルで二次抗体を希釈します。断面あたりの一次抗体カクテルの30μLを計算します。
10. 1時間スライドを二次抗体カクテルを適用します。
11. 洗浄を10分間、さらに5分間新しいPBSTとPBS + 0.05％トリトンX（PBST）で摺動します。
12. DAPI核染色キット（好ましくは、読み取りに使用できる溶液）FOを適用しますR 15分間または細胞核を染色するために製造業者の指示に従って。
13. 洗浄は1分間、PBS + 0.05％トリトンX（PBST）を用いて簡単にスライドします。その後、スライドを空気乾燥簡単にしましょう。
14. 蛍光封入剤とカバースリップを適用します。 4°Cで保存し、光から保護し、24〜48時間以内、最適に撮像を行います。

3.顕微鏡

1. 負荷はスライドスキャナにスライド。 12枚のスライドの最大値は、スライドスキャナに応じて可能です。
2. 新しいプロジェクトを開始します。プレビュー用DAPIチャネル及び2.5倍のレンズをセット。詳細な分析のためにDAPI、GFP、FITC及びCy5チャネルと20Xの目的を使用しています。オートフォーカスは、DAPIチャネルにおけるプロジェクト全体が取得されます。
3. DAPIの-Blue、FITC：グリーン、テキサスレッド：赤、Cy5の：黄色チャネルごとに以下の色を使用します。
4. DAPIチャネルを使用して、各スライドのプレビューを作成します。このためには、最初の試料にマニュアルフォーカスを適用すると、プレビュー全体でそれを使用します分析は、各試料のプレビュー画像を取得します。
5. 詳細な取得プロセスに含まれるべき各断面の輪郭を描きます。関心の領域全体のキャプションを確保するために、試料のエッジに近い輪郭を描画しないでください。
6. 各チャネルごとに露光時間を設定します。ほとんどの場合、異なるチャネルの露光パラメータは、すべての断面で同一です。
7. 自動画像取得を実行します。初期の自動プロセスで不正取得を防ぐために、ビューの最初のフィールドの正しい取得を確認してください。
8. 必要な場合は、デスクトップのミラーリングソフトウェアを使用してリモートコントロールを確立します。これは、任意のネットワークまたはインターネット接続を介して別のコンピュータにスライドスキャナのコンピュータの画面をミラーリングすることにより、画像取得処理の遠隔監視を可能にします。変更が使用されたスライドに関する物理的なセットアップを行うことはできません、が、画像取得ソフトウェアの仮想環境を監視できます画像の正確なピントや露出時間。また、完了までの推定時間は、定期的にチェックすることができます。
9. 画像取得が完了した後、繊維構造、個々の繊維及び様々な繊維タイプが識別可能である場合は、手動で制御することにより、全ての画像の正確なオートフォーカスを制御します。
10. 再取得誤っビューまたは関心の全体領域の単一フィールドの画像領域に焦点を当てました。単一領域の再取得のために、プロジェクト全体を通して、地域や画像をマークし、マニュアルフォーカスでの領域を再取得。ほとんどの場合、異なる焦点レベルでの追加イメージの詳細が間違って集中した画像につながります
11. 最終的な分析に含まれるべきすべての断面については、個別にJPEGファイルとして（DAPIを除く）各チャンネルをエクスポートします。テキサスレッド、FITC及びCy5という名前のフォルダにさらさチャンネルに応じてファイルに名前を付けて並べ替えます。

4.自動ファイバー分析

10トン ">注：マクロは、以下のWebページから入手できます。https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

1. プレビュー各画像は、分析の前に、従来の画像編集ソフトを使用して染色された繊維と背景との間の十分なコントラストをチェックします。必要に応じて、明るさとコントラスト調整コマンドを使用して、差を大きくするために、コントラストと明るさを調整します。
2. ImageJのか、フィジーを開きます。コマンドを使用してマクロを開く「 - マクロ - プラグイン。編集」これは、マクロのソースコードを示しており、パラメータの迅速な適応を可能にします。必要に応じて、マクロのソースコード内のチャネルごとにフォルダのディレクトリを変更します。
   注：筋線維の分析のための値は、ラットの上腕二頭筋と虫様筋、他の種または異なる値を必要とするかもしれない筋肉に基づいています。
3. マクロを開始するには、「実行」コマンドを使用します。フォルダのすべての画像は現在のマクロにロードされ、連続した順序で定量化されています。結果がshoあります新しいウィンドウでWN。このステップでは、分析されているデータの量に応じて、数時間秒からかかる場合があります。
4. スプレッドシートファイルとして結果ウィンドウをエクスポートします。正（迅速）繊維のC​​y5（遅い）、FITC（中間体）及びテキサスレッドを計数し、総繊維数の合計の値を識別する。

結果

全体のラットの筋肉断面がMHC I、IIAおよびIIBの筋線維を識別するために、免疫組織化学を使用して、急速に染色しました。蛍光顕微鏡スライドスキャナを使用して、全体の断面を自動的に自動化された筋線維のために取得したがImageJを用いて解析します。手続きの概念は、筋線維の定量化のために、簡単で信頼性が高く、時間効率的なワークフローを提供することに?...

ディスカッション

ここでは、勉強と自動的に時間効率的な方法で免疫組織化学を経由して、ラットの断面の筋線維集団を定量化するために広くアクセス方法論を示しています。再現性のために、我々は、ステップの説明及び本研究に記載されていない他の種における用途のための潜在的な変更による詳細なステップを示します。さらに、我々は、最適な機能とその限界のための前提条件を手順の利点を議?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
O.C.T compound	Tissue-Tek, Sakura, Netherlands		For embedding of muscle tissue
Isopentane			for adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slides	Thermo Scientific, Germany	1014356190	adhesive slides
phosphate buffered saline
Triton X-100	Thermo Scientific, Germany	85112	Detergent Soluation
Goat serum	Thermo Scientific, Germany	50197Z	Goat Serum
DAKO Fluorescent Mounting Medium	Dako Denmark	S3023
Dako pen	Dako Denmark	S200230-2
TissueFAXSi plus	TissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b	Thermo Scientific, Germany	A-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1)	Thermo Scientific, Germany	A-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain)	Thermo Scientific, Germany	A-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent	Thermo Scientific, Germany	R37606