Un protocole automatisé pour l'analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

Résumé

Nous présentons ici un protocole d'analyse des fibres musculaires rapides, ce qui permet une meilleure qualité de coloration, et ainsi l'acquisition automatique et la quantification des populations de fibres à l'aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement.

Résumé

Quantification des populations de fibres de muscle donne une idée plus précise des effets de la maladie, un traumatisme, et d'autres influences sur la composition du muscle squelettique. Diverses méthodes chronophages ont traditionnellement été utilisées pour étudier les populations de fibres dans de nombreux domaines de recherche. Cependant, récemment mis au point des méthodes immunohistochimiques basées sur l'expression des protéines de chaîne lourde de la myosine fournir une alternative rapide pour identifier les types de fibres multiples dans une seule section. Nous présentons ici un protocole rapide, fiable et reproductible pour une meilleure qualité de coloration, ce qui permet l'acquisition automatique des sections entières et la quantification automatique des populations de fibres avec ImageJ. A cet effet, les muscles squelettiques sont coupés intégrés dans les sections transversales, colorées à l'aide des anticorps chaînes lourdes de myosine avec des anticorps fluorescents secondaires et DAPI pour la coloration des noyaux de cellules. des sections transversales entières sont ensuite balayées automatiquement à l'aide d'un scanner de diapositives pour obtenir composite à haute résolutionimages de l'échantillon entier. Les analyses de la population des fibres sont ensuite effectuées pour quantifier les fibres lentes, intermédiaires et rapides en utilisant une macro automatique pour ImageJ. Nous avons déjà montré que cette méthode permet d'identifier les populations de fibres de manière fiable à un degré de ± 4%. De plus, cette méthode réduit la variabilité inter-utilisateur et le temps par des analyses en utilisant de manière significative la plate-forme open source ImageJ.

Introduction

Composition du muscle squelettique subit de profondes modifications au cours des processus physiologiques tels que le vieillissement ^{1, 2, 3 exercice, 4, 5, 6, 7} ou processus pathophysiologiques telles que la maladie ^{8, 9, 10} ou ¹¹ traumatisme. Par conséquent, plusieurs champs de concentré de recherche sur les effets structurels de ces processus pour comprendre les changements fonctionnels. L'un des aspects clés qui déterminent la fonction musculaire est la composition des fibres musculaires. Les fibres musculaires expriment différentes chaînes lourdes de myosine (MHC) des protéines et sont ainsi classés en fibres lentes, intermédiaires, ou rapides ^{7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17.} Physiologiquement, les muscles ont différentes compositions de fibres de muscle selon leur fonction dans le corps. En utilisant typage des fibres musculaires, les populations de fibres peuvent être quantifiés pour identifier l' adaptation à des processus physiologiques ou physiopathologiques ^{7, 17.} Historiquement, un certain nombre de méthodes qui prennent du temps ont été appliquées à la différence entre les types de fibres musculaires. A cet effet, les fibres musculaires ont été classés soit par la réactivité de la myosine ATPase à différents niveaux de pH ou de l'activité enzymatique musculaire. Comme différentes qualités de fibres ne peuvent pas être évalués en une seule section, les sections transversales multiples ont été nécessaires pour identifier toutes les fibres musculaires et de permettre la quantification manuelle ^{14, 16, 17,}= "xref"> ^{18, 19, 20, 21, 22.} En revanche, les publications récentes utilisées immunohistochimie (IHC) contre la protéine de chaîne lourde de myosine pour colorer rapidement plusieurs types de fibres dans une seule des sections transversales. Sur la base des avantages de cette procédure, il est maintenant considéré comme l'étalon-or dans l' analyse de la population des fibres musculaires ^{19, 23, 24.} En utilisant l'amélioration des protocoles de coloration IHC, nous avons récemment pu montrer que l'acquisition automatique des sections entières de croix musculaire et la quantification ultérieure des fibres musculaires automatique est possible en utilisant la plate-forme open source ImageJ. Par rapport à la quantification manuelle, notre procédure a fourni une diminution significative du temps (environ 10% des analyses manuelle) requise par diapositive tout en étant précis à ± 4% ²⁵ .

L'objectif global de cette méthode est de décrire un guide rapide, fiable, indépendante de l'utilisateur à la quantification des fibres musculaires automatique dans les muscles entiers de rat en utilisant une plate-forme open source. De plus, nous décrivons les modifications potentielles qui permettraient son utilisation pour d'autres spécimens tels que des souris ou des muscles humains.

Protocole

Toutes les procédures , y compris des sujets animaux ont été menées dans le respect des principes de protection des animaux de laboratoire tel que recommandé par FELASA ^26. L'approbation a été obtenue avant l'étude par le comité d'examen institutionnel de l'Université médicale de Vienne et le Ministère autrichien de la recherche et de la Science (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numéro de référence: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).

1. Muscle récolte

NOTE: Une publication précédente par Meng et al. ²⁷ est disponible décrivant le gel correct des échantillons musculaires en détail.

1. Obtenir l' ensemble des muscles ou des tissus suffisante pour acquérir des coupes transversales entières immédiatement après l' euthanasie des animaux.
   1. Retirez le muscle entier d'un rat anesthésié ou euthanasiés. Retirez tout le tissu conjonctif et les tendons entourant le muscle avec des pinces et des ciseaux. Pour unnesthesia ou l' euthanasie, suivez les directives internationales de FELASA ^28.
2. Peser musculaire en utilisant une échelle de précision calibrée. Cette étape rapide permet des analyses comparatives entre les échantillons musculaires, en particulier après les procédures d'intervention.
3. Mettre muscle dans un récipient, rempli entièrement avec un composé OCT, en fonction de la taille du muscle avec une marge de sécurité d'environ 1 mm sur tous les côtés (par exemple, faite d' une feuille d'aluminium).
4. Congeler à environ 2 min prérefroidi isopentane utilisant de l'azote liquide. Le isopentane doit commencer à montrer des cristaux blancs au fond du récipient.
   REMARQUE: Cette étape est essentielle pour la préservation de l'architecture correcte du muscle et permet ainsi la bonne coloration et analyse des fibres ^27.
5. Conserver les échantillons conservés dans l'OCT pendant au moins 24 h à -80 ° C. Les échantillons peuvent toutefois être conservés à -80 ° C pendant plusieurs mois, voire des années, si corre refroidi cte.
6. Couper 10 um sections transversales de la partie médiane du muscle à -20 ° C en utilisant un cryotome. Si l'on coupe à 10 pm est pas possible, augmenter l'épaisseur par palier de 2 um jusqu'à un maximum de 20 pm. lames de coupe sont essentiels d'une netteté pour cette étape.
7. Appliquer les sections aux diapositives adhésives en rapprochant les diapositives des sections transversales. Les sections collera automatiquement aux diapositives adhésives. Conserver les diapositives à -20 ° C pendant la nuit avant la coloration.

2. Staining

NOTE: Un grand nombre d'anticorps dirigés contre les protéines de chaîne lourde de myosine sont disponibles; Cependant, les anticorps de haute qualité sont essentiels pour l'acquisition et l'analyse automatisée. Pour des dilutions et référence aux anticorps, voir le tableau 1. Pour un fichier tableur pour calculer les dilutions correctes et voir le nombre de quantités de solution nécessaires, voirsource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental Fichier 1.

1. Dégeler et sécher à l'air les sections musculaires congelés pendant 10 minutes avant la procédure de coloration.
2. Laver les lames avec précaution avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 0,05% de Triton X pendant 10 minutes, puis pendant 5 min. Triton a été montré pour améliorer considérablement la qualité de coloration. Voir la discussion pour plus de détails.
3. Laisser sécher à l'air les sections pendant 2 min et de définir des sections transversales individuelles sur chaque diapositive à l'aide d'un stylo hydrophobe (pour minimiser la quantité requise d'anticorps) et permettre un séchage supplémentaire pendant 15 minutes.
4. Bloquer toutes les lames avec du PBS + 0,05% de Triton X (PBST) contenant du sérum de chèvre à 10% pendant 1 h à température ambiante.
5. Diluer tous les anticorps primaires (Tableau 1) dans un cocktail de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) contenant 10% de sérum de chèvre. Mélanger suffisamment avant l'application. Triton X est essentielle pour la coloration égale de l'ensemble des sections. Calculerenviron 30 uL de cocktail d'anticorps primaire par section transversale.
6. Pour connaître les étapes 2.7-2.13 assurer une protection suffisante de la lumière. lumières de la pièce grisés et des plateaux de coloration couvertes assurent une protection adéquate. En outre, remplir le bac de coloration avec le fluide au fond de fournir un environnement humide pendant la coloration et prévenir le dessèchement.
7. Appliquer l' anticorps primaire (tableau 1) cocktails sur les lames pendant 1 h dans un plateau de coloration humide à la température ambiante.
8. Laver les lames avec du PBS + 0,05% de Triton X pendant 10 min puis avec de nouveaux PBST pendant 5 min.
9. Diluer Anticorps secondaires dans un cocktail de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) + 10% de sérum de chèvre. Calculer 30 uL de cocktail d'anticorps primaire par section transversale.
10. Appliquer un cocktail d'anticorps secondaire sur les lames pendant 1 h.
11. Laver les lames avec du PBS + 0,05% de Triton X (PBST) pendant 10 min et à nouveau PBST pendant 5 min.
12. Appliquer un kit de coloration nucléaire DAPI (de préférence des solutions de lecture à utiliser) for 15 min ou selon les instructions pour colorer les noyaux des cellules du fabricant.
13. Laver les lames brièvement avec du PBS + 0,05% de Triton X (PBST) pendant 1 min. Ensuite, laissez-diapositives brièvement à l'air sec.
14. Appliquer support et des lamelles de montage fluorescent. Conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière et d'effectuer l'imagerie de façon optimale à l'intérieur de 24 à 48 h.

3. Microscopie

1. Charger glisse dans le scanner de diapositives. Un maximum de 12 lames est réalisable en fonction du scanner de diapositives.
2. Démarrez un nouveau projet. Pour régler le canal aperçu DAPI et la lentille 2.5X. Pour l'analyse détaillée des canaux utiliser DAPI, GFP, FITC et Cy5 et l'objectif 20X. L'autofocus est acquis tout au long du projet dans le canal DAPI.
3. Utilisez les couleurs suivantes pour chaque canal: DAPI -bleu FITC: vert, rouge Texas: rouge, Cy5: jaune.
4. Créer des aperçus de chaque diapositive en utilisant le canal DAPI. A cet effet, appliquer mise au point manuelle sur le premier échantillon et l'utiliser tout au long de l'aperçuanalyse d'acquérir des images d'aperçu de chaque spécimen.
5. Décrire chaque section qui devrait être inclus dans le processus d'acquisition détaillé. Ne pas tirer contours près des bords de l'échantillon, afin d'assurer la légende de toute la zone d'intérêt.
6. Régler les temps d'exposition pour chaque canal. Dans la plupart des cas, les paramètres d'exposition des différents canaux sont identiques pour toutes les sections.
7. Exécutez l'acquisition automatique d'images. Vérifiez correcte acquisition pour le premier champ de vues, afin d'empêcher l'acquisition incorrecte au début du processus automatisé.
8. Si nécessaire, établir un contrôle à distance en utilisant le logiciel de mise en miroir de bureau. Cela permet la surveillance à distance du processus d'acquisition de l'image en miroir de l'écran d'ordinateur du scanner de diapositives à un autre ordinateur par l'intermédiaire d'un réseau ou une connexion Internet. Bien que, aucune modification ne peut être à la configuration physique en ce qui concerne les diapositives utilisées, l'environnement virtuel du logiciel d'acquisition d'images permet de surveiller la mise au point ou corriger les temps d'exposition des images. De plus, le temps estimé pour l'achèvement peut être vérifié régulièrement.
9. Après l'achèvement de l'acquisition de l'image, le contrôle de la mise au point correcte de toutes les images en contrôlant manuellement si l'architecture de fibres, les fibres individuelles et les différents types de fibres peuvent être distingués.
10. Réacquérir les zones d'image focalisée de manière incorrecte pour les champs de vue uniques ou des domaines d'intérêt tout entier. Pour réacquisition des zones simples, marquer des zones ou des images tout au long de l'ensemble du projet et réacquérir les zones avec mise au point manuelle. Dans la plupart des cas, un détail d'image supplémentaire dans un niveau de mise au point différent conduit à mal les images centrées
11. Pour chaque section qui devrait être inclus dans les analyses finales, exporter chaque canal (hors DAPI) séparément sous forme de fichiers JPEG. Nom et trier les fichiers selon les canaux exposés dans des dossiers nommés Texas Red, FITC et Cy5.

4. Analyse automatisée de fibres

tente "> NOTE: La macro peut être obtenue à partir de la page Web suivante: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

1. Aperçu de chaque image à l'aide d'un logiciel d'édition d'image classique avant les analyses et vérifier un contraste suffisant entre les fibres colorées et fond. Si nécessaire, ajuster le contraste et la luminosité pour augmenter la différence, en utilisant les commandes de luminosité et de réglage du contraste.
2. Ouvrez ImageJ ou Fidji. Ouvrez la macro en utilisant la commande « Plugins - macros - Modifier ». Cela montre le code source de macros et permet une adaptation rapide des paramètres. Si nécessaire, modifiez le répertoire du dossier pour chaque canal dans le code source de la macro.
   REMARQUE: Les valeurs pour les analyses de fibres musculaires sont basées sur des biceps de rat et les muscles lombrical, d'autres espèces ou les muscles peuvent exiger des valeurs différentes.
3. Utilisez la commande « run » pour lancer la macro. Toutes les images du dossier sont maintenant chargés dans la macro et quantifiés dans un ordre consécutif. Les résultats sont shoWN dans une nouvelle fenêtre. Cette étape peut prendre de quelques secondes à plusieurs heures, en fonction de la quantité de données en cours d'analyse.
4. Exporter la fenêtre de résultats dans un fichier tableur. Identifier les valeurs de Cy5 compté positivement (lent), les fibres FITC (intermédiaire) et le rouge Texas (rapide) et résumé pour le nombre total de fibres.

Résultats

musculaires de rat Le total des sections ont été colorées par immunohistochimie rapidement pour identifier le CMH I, IIA et IIB fibres musculaires. L'utilisation d'un scanner de diapositives de microscope à fluorescence, des sections transversales entières ont été acquises alors automatiquement pour fibre musculaire automatisé avec analyse ImageJ. Le concept de la procédure est basée sur la fourniture d'un flux de travail simple, fiable et efficace du temps pour la ...

Discussion

Ici, nous démontrons une méthodologie largement accessible pour étudier et quantifier automatiquement les populations de fibres musculaires des sections de rat par immunohistochimie dans un temps de manière efficace. Pour la reproductibilité, nous présentons une étape détaillée par la description de l'étape et les modifications potentielles pour des applications dans d'autres espèces ne sont pas décrites dans cette étude. De plus, nous discutons des avantages de la procédure, les conditions p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
O.C.T compound	Tissue-Tek, Sakura, Netherlands		For embedding of muscle tissue
Isopentane			for adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slides	Thermo Scientific, Germany	1014356190	adhesive slides
phosphate buffered saline
Triton X-100	Thermo Scientific, Germany	85112	Detergent Soluation
Goat serum	Thermo Scientific, Germany	50197Z	Goat Serum
DAKO Fluorescent Mounting Medium	Dako Denmark	S3023
Dako pen	Dako Denmark	S200230-2
TissueFAXSi plus	TissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b	Thermo Scientific, Germany	A-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1)	Thermo Scientific, Germany	A-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain)	Thermo Scientific, Germany	A-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent	Thermo Scientific, Germany	R37606