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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l'acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.

Abstract

La quantificazione delle popolazioni di fibra muscolare fornisce una più profonda comprensione degli effetti di malattie, traumi, e varie altre influenze sulla composizione del muscolo scheletrico. Vari metodi in termini di tempo sono stati tradizionalmente usati per studiare le popolazioni di fibra in molti campi della ricerca. Tuttavia, recentemente sviluppato metodi immunoistochimici basati su proteine ​​espressione della catena pesante della miosina fornire una rapida alternativa per identificare i tipi di fibre multiple in una singola sezione. Qui, vi presentiamo un protocollo rapido, affidabile e riproducibile per migliorare la qualità della colorazione, consentendo l'acquisizione automatica di profilati trasversali interi e quantificazione automatica delle popolazioni fibra con ImageJ. A questo scopo, i muscoli scheletrici incorporati sono tagliati in sezioni, colorati con miosina catene pesanti anticorpi con anticorpi fluorescenti secondarie e DAPI per nuclei delle cellule colorazione. intere sezioni trasversali vengono esaminati automaticamente utilizzando uno scanner diapositiva per ottenere alta risoluzione compositole fotografie dell'intera campione. analisi demografiche fibra vengono successivamente eseguite per quantificare fibre lente, intermedie e rapide utilizzando una macro automatizzato per ImageJ. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo metodo può identificare popolazioni di fibre in modo affidabile ad un grado di ± 4%. Inoltre, questo metodo riduce la variabilità inter-utente e tempo per analisi significativamente utilizzando la piattaforma open source ImageJ.

Introduzione

Composizione muscolo scheletrico subisce profonde modificazioni durante i processi fisiologici quali l'invecchiamento 1, 2, 3 esercizio, 4, 5, 6, 7, o processi patofisiologici come il morbo 8, 9, 10 o 11 trauma. Quindi, diversi campi di concentrato di ricerca sugli effetti strutturali di questi processi per capire i cambiamenti funzionali. Uno degli aspetti chiave che determinano la funzione muscolare è la composizione delle fibre muscolari. Fibre muscolari esprimono catena pesante proteine differente miosina (MHC) e sono quindi classificate in lento, intermedi, o veloce fibre 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Fisiologicamente, muscoli hanno differenti composizioni di fibre muscolari a seconda della loro funzione nel corpo. Utilizzando fibre muscolari digitazione, le popolazioni di fibre possono essere quantificati per identificare adattamento a processi fisiologici o patofisiologici 7, 17. Storicamente, sono stati applicati vari metodi richiedono tempo per distinguere tra tipi di fibra muscolare. A questo scopo, le fibre muscolari erano classificati mediante reattività della miosina ATPasi a diversi livelli di pH o enzima attività muscolare. Come differente qualità di fibra non può essere stabilita in una singola sezione, sezioni multiple sono stati richiesti per identificare tutte le fibre muscolari e permettere manuale quantificazione 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Al contrario, recenti pubblicazioni usati immunoistochimica (IHC) contro proteina miosina catena pesante di macchiare rapidamente tipi di fibre multiple in un singolo sezioni trasversali. Sulla base dei vantaggi di questa procedura, è ora considerato il gold standard per l'analisi della popolazione fibre muscolari 19, 23, 24. Utilizzando migliorate protocolli di colorazione IHC, recentemente siamo stati in grado di dimostrare che l'acquisizione completamente automatica delle sezioni trasversali muscolo intero e successiva quantificazione automatica fibra muscolare è possibile utilizzando la piattaforma open source ImageJ. Rispetto alla quantificazione manuale, la nostra procedura prevista una significativa diminuzione del tempo (circa il 10% di manuale analisi) richiesto per vetrino pur essendo precisione di ± 4% 25 .

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una guida rapida, affidabile, facile da indipendente quantificazione automatica fibra muscolare nei muscoli interi di ratto utilizzando una piattaforma open source. Inoltre, si descrivono i potenziali modifiche che avrebbero permesso il suo utilizzo per altri campioni, come topi o muscoli umani.

Protocollo

Tutte le procedure tra soggetti animali sono state condotte nel rispetto dei principi di cura degli animali da laboratorio, come raccomandato dal FELASA 26. Soddisfazione è stata ottenuta prima dello studio da parte del comitato di revisione istituzionale della Medical University di Vienna e dal Ministero austriaco per la ricerca e la scienza (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numero di riferimento: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).

1. muscolare Harvest

NOTA: una precedente pubblicazione da Meng et al. 27 è disponibile che descrive il corretto congelamento dei campioni di muscolo in grande dettaglio.

  1. Ottenere interi muscoli o tessuto sufficiente per acquisire intere sezioni trasversali immediatamente dopo eutanasia degli animali.
    1. Rimuovere l'intero muscolo da un topo anestetizzato o di eutanasia. Rimuovere tutti i tessuti connettivi e tendini che circondano il muscolo con pinze e forbici. Per unnesthesia o l'eutanasia, seguono le linee guida internazionali di FELASA 28.
  2. Pesare il muscolo utilizzando una bilancia di precisione calibrata. Questo rapido passaggio consente analisi comparative tra i campioni di muscolo, soprattutto dopo procedure interventistiche.
  3. Mettere muscolo in un recipiente, riempito completamente con OCT, a seconda delle dimensioni del muscolo con un margine di sicurezza di circa 1 mm a tutti i lati (per esempio, in alluminio).
  4. Congelare in circa 2 min preraffreddati isopentano con azoto liquido. L'isopentano deve iniziare a mostrare cristalli bianchi sul fondo del contenitore.
    NOTA: Questo passaggio è essenziale per preservare il corretto architettura del muscolo e quindi permette la colorazione corretta e fibra analisi 27.
  5. Conservare i campioni conservati in OCT per almeno 24 ore a -80 ° C. I campioni possono, tuttavia, essere conservati a -80 ° C per diversi mesi o addirittura anni, se corri raffreddato ctly.
  6. Tagliare 10 sezioni micron trasversali dalla porzione mediana del muscolo a -20 ° C usando un cryotome. Se il taglio a 10 um, non è fattibile, aumentare lo spessore a passi di 2 um fino a un massimo di 20 um. Sufficientemente lame taglienti sono essenziali per questa fase.
  7. Applicare le sezioni alle diapositive adesive mediante l'armonizzazione delle diapositive per le sezioni trasversali. Le sezioni trasversali si attaccano automaticamente alle diapositive adesive. Conservare i vetrini a -20 ° C per una notte prima della colorazione.

2. colorazione

NOTA: Un gran numero di anticorpi contro le proteine ​​miosina catena pesante sono disponibili; tuttavia, anticorpi ad alta qualità sono essenziali per l'acquisizione e analisi automatizzata. Per diluizioni e riferimento agli anticorpi, si veda la Tabella 1. Per un file foglio di calcolo per calcolare le diluizioni corrette e vedere il numero di quantità soluzione richiesta, vederesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental file 1.

  1. Scongelare e aria asciugare le sezioni muscolari congelati per 10 minuti prima che la procedura di colorazione.
  2. Lavare i vetrini accuratamente con tampone fosfato salino (PBS) + 0,05% Triton X per 10 minuti e poi per 5 min. Triton ha dimostrato di migliorare significativamente la qualità della colorazione. Vedi la discussione per ulteriori dettagli.
  3. Let sezioni asciugare per 2 minuti e contorno sezioni individuali di ciascun vetrino con una penna idrofobo (per minimizzare quantità di anticorpo) e consentire asciugatura addizionale per 15 min.
  4. Bloccare tutti i vetrini con PBS + 0,05% Triton X (PBST) contenente 10% siero di capra per 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Diluire tutti gli anticorpi primari (Tabella 1) in un cocktail di PBS + 0,05% Triton X (PBST) contenente 10% siero di capra. Mescolare sufficientemente prima dell'applicazione. Triton X è essenziale per la colorazione uguale di tutto sezioni trasversali. Calcolarecirca 30 microlitri di primaria cocktail di anticorpi per sezione trasversale.
  6. Per la procedura 2.7-2.13 garantire una sufficiente protezione dalla luce. luci della stanza in grigio e vaschette di colorazione coperti forniscono una protezione adeguata. Inoltre, riempire il vassoio colorazione con fluido in basso per fornire un ambiente umido durante la colorazione e prevenire l'essiccazione.
  7. Applicare anticorpo primario (Tabella 1) cocktail per i vetrini per 1 h in un vassoio di colorazione umido della temperatura ambiente.
  8. Lavare i vetrini con PBS + 0,05% Triton X per 10 minuti e poi con nuovo PBST per 5 min.
  9. Diluire anticorpi secondari in un cocktail di PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% siero di capra. Calcolare 30 ml di primaria cocktail di anticorpi per sezione trasversale.
  10. Applicare cocktail anticorpo secondario per i vetrini per 1 h.
  11. Lavare i vetrini con PBS + 0,05% Triton X (PBST) per 10 min e con PBST nuovo per altri 5 minuti.
  12. Applicare un kit di colorazione nucleare DAPI (preferibilmente lettura da usare soluzioni) foR 15 minuti o secondo le istruzioni del produttore per macchiare nuclei delle cellule.
  13. Lavare i vetrini brevemente con PBS + 0,05% Triton X (PBST) per 1 min. In seguito, i vetrini lasciare brevemente asciugare.
  14. Applicare fluorescente mezzo di montaggio e vetrini. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce ed eseguire l'imaging ottimale entro 24-48 ore.

3. Microscopia

  1. Carico scivola in scanner per diapositive. Un massimo di 12 vetrini è fattibile seconda dello scanner diapositiva.
  2. Avviare un nuovo progetto. Per anteprima impostare il canale DAPI e la lente 2.5X. Per l'analisi dettagliata utilizzare DAPI, GFP, FITC e Cy5 canali e l'obiettivo 20X. Messa a fuoco automatica è acquisita durante il progetto nel canale DAPI.
  3. Utilizzare i seguenti colori per ogni canale: DAPI -blu, FITC: verde, Texas Red: rosso, Cy5: giallo.
  4. Creare le anteprime di ogni diapositiva usando il canale DAPI. A tal fine, si applicano messa a fuoco manuale sul primo campione e usarlo per tutto il previewanalisi di acquisire immagini di anteprima di ogni esemplare.
  5. Outline ogni sezione che dovrebbe essere incluso per il processo di acquisizione dettagliata. Non disegnare delinea vicino ai bordi del campione, al fine di garantire caption di tutta l'area di interesse.
  6. Impostare i tempi di esposizione per ogni canale. Nella maggior parte dei casi, i parametri di esposizione dei diversi canali sono identici per tutte le sezioni.
  7. Eseguire acquisizione automatica delle immagini. Verificare la corretta acquisizione per il primo campo di punti di vista, per prevenire l'acquisizione non corretta nelle prime fasi del processo automatizzato.
  8. Se necessario, stabilire il controllo del desktop remoto tramite il mirroring del software. Ciò consente il monitoraggio a distanza del processo di acquisizione dell'immagine mirroring lo schermo del computer dello scanner diapositiva a un altro computer tramite qualsiasi connessione di rete o internet. Anche se, non è possibile apportare modifiche alla configurazione fisica relativi alle slide utilizzate, l'ambiente virtuale del software di acquisizione immagini permette di monitorare la corretta messa a fuoco o di tempi di esposizione delle immagini. Inoltre, il tempo stimato per il completamento può essere controllata regolarmente.
  9. Dopo il completamento dell'acquisizione dell'immagine, controllare la corretta messa a fuoco automatica di tutte le immagini controllando manualmente se l'architettura fibra, singole fibre ei vari tipi di fibra sono distinguibili.
  10. Riacquistare erroneamente focalizzata aree dell'immagine per i singoli campi di vista o di intere aree di interesse. Per riacquisizione di singole aree, indicare le zone o le immagini in tutto l'intero progetto e riacquistare le aree con messa a fuoco manuale. Nella maggior parte dei casi, un dettaglio ulteriore un'immagine in un livello obiettivo diverso conduce alle immagini sfocate
  11. Per ogni sezione trasversale che dovrebbe essere incluso nelle analisi finali, esportare ogni canale (escludendo DAPI) separatamente come file jpeg. Nome e ordinare i file in base ai canali esposti in cartelle denominate Texas Red, FITC e Cy5.

4. Analisi automatizzata fibra

tenda "> NOTA: La macro può essere ottenuto dalla seguente pagina web: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

  1. Anteprima ogni immagine utilizzando un software di elaborazione immagini convenzionale prima analisi e verificare sufficiente contrasto tra fibre colorate e sfondo. Se necessario, regolare il contrasto e luminosità per aumentare la differenza, utilizzando i comandi di luminosità e regolazione contrasto.
  2. Aprire ImageJ o Fiji. Aprire la macro utilizzando il comando "Plugins - Macro - Modifica." Questo dimostra il codice sorgente e le macro permette rapido adattamento di parametri. Se necessario, cambiare la directory della cartella per ogni canale nel codice sorgente della macro.
    NOTA: I valori per le analisi delle fibre muscolari si basano su bicipiti e muscoli di ratto lombricali, altre specie o muscoli possono richiedere valori diversi.
  3. Utilizzare il comando "run" per avviare la macro. Tutte le immagini della cartella sono ora caricati nel macro e quantificate in ordine consecutivo. I risultati sono shown in una nuova finestra. Questa fase può durare da secondi a diverse ore, a seconda della quantità di dati analizzati.
  4. Esportare la finestra dei risultati come file di foglio di calcolo. Identificare i valori per conteggiato positivamente Cy5 (lento), FITC (intermedio) e Texas Red fibre (veloce) e riassumere per numero totale di fibre.

Risultati

Intero ratto muscolari sezioni sono state colorate rapidamente utilizzando l'immunoistochimica per identificare MHC I, IIA e IIB fibre muscolari. Utilizzando uno scanner vetrino da microscopio a fluorescenza, intere sezioni sono state poi acquisiti automaticamente per fibra muscolare automatizzata analisi con ImageJ. Il concetto del procedimento si basa sulla fornitura di un flusso di lavoro semplice, affidabile e in tempi rapidi per la quantificazione delle fibre muscolari.

Discussione

Qui, dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare e quantificare le popolazioni di fibre muscolari di sezioni trasversali di ratto mediante immunoistochimica in modo efficiente tempo automaticamente. Per la riproducibilità, presentiamo un passo dettagliate descrizione passo e potenziali modifiche per applicazioni in altre specie non descritte in questo studio. Inoltre, si discute i vantaggi del procedimento, prerequisiti per la funzione ottimale e suoi limiti.

Attua...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Christian Doppler Research. Vorremmo ringraziare Sabine Rauscher dal Nucleo strumento Imaging presso l'Università di Medicina di Vienna, Austria per il supporto durante tutto il progetto. Gli anticorpi primari sono stati sviluppati da Schiaffino, S., ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta a L'University of Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
O.C.T compoundTissue-Tek, Sakura, NetherlandsFor embedding of muscle tissue
Isopentanefor adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slidesThermo Scientific, Germany1014356190adhesive slides
phosphate buffered saline 
Triton X-100Thermo Scientific, Germany85112Detergent Soluation
Goat serumThermo Scientific, Germany50197ZGoat Serum
DAKO Fluorescent Mounting MediumDako DenmarkS3023
Dako penDako DenmarkS200230-2
TissueFAXSi plusTissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b Thermo Scientific, GermanyA-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1)Thermo Scientific, GermanyA-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain)Thermo Scientific, GermanyA-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes ReagentThermo Scientific, GermanyR37606

Riferimenti

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