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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für schnelle Muskelfaseranalysen, die eine verbesserte Färbequalität ermöglicht und dadurch die automatische Erfassung und Quantifizierung von Faserpopulationen die frei verfügbare Software ImageJ.

Zusammenfassung

Quantifizierung von Muskelfaserpopulationen stellt einen tieferen Einblick in die Auswirkungen der Krankheit, Trauma und verschiedene andere Einflüsse auf die Skelettmuskelmasse. Verschiedene zeitaufwendige Verfahren sind traditionell verwendet worden, Faserpopulationen in vielen Bereichen der Forschung zu studieren. Doch vor kurzem immunhistochemischen Methoden basierend auf Myosin Proteinexpression bietet eine schnelle Alternative entwickelt, um mehrere Fasertypen in einem einzigen Abschnitt zu identifizieren. Hier präsentieren wir ein schnelles, zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll für eine verbesserte Qualität der Färbung, so dass die automatische Erfassung ganzer Querschnitt und die automatischen Quantifizierung von Faserpopulationen mit ImageJ. Zu diesem Zweck werden eingebettete Skelettmuskulatur in Querschnitte geschnitten, gefärbt unter Verwendung von schweren Myosinketten der Antikörper mit fluoreszierenden sekundären Antikörper und DAPI für Zellkerne Färbung. Ganze Querschnitte werden dann hochauflösendes Verbund automatisch über einen Schiebe Scanner gescannt zu erhaltenBilder der gesamten Probe. Faserpopulation Analysen werden anschließend langsam, mittel und schnell Fasern unter Verwendung eines automatisierten Makro für ImageJ ausgeführt zu quantifizieren. Wir haben zuvor gezeigt, dass diese Methode Populationen Faser identifizieren kann zuverlässig auf ein Maß von ± 4%. Darüber hinaus reduziert diese Methode inter Benutzer Variabilität und Zeit pro signifikant die Open-Source-Plattform ImageJ Analysen mit.

Einleitung

Skelettmuskelmasse erfährt tiefe Veränderungen während der physiologischen Prozesse , wie Alter 1, 2, Aufgabe 3, 4, 5, 6, 7 oder pathophysiologische Prozesse wie Krankheit 8, 9, 10 oder 11 Trauma. mehrere Forschungsfelder konzentrieren sich auf die strukturellen Auswirkungen dieser Prozesse daher zu funktionellen Veränderungen zu verstehen. Einer der wichtigsten Aspekte der Muskelfunktion bestimmt, ist die Zusammensetzung der Muskelfasern. Muskelfasern exprimieren verschiedene Myosin schwere Kette (MHC) -Proteinen und dadurch klassifiziert in langsam, mittel oder schnell Fasern 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Physiologisch haben Muskeln unterschiedliche Muskelfaserzusammensetzungen in Abhängigkeit von ihrer Funktion im Körper. Verwendung von Muskelfasern Typisierung, Faserpopulationen kann quantifiziert werden 7 Anpassung an physiologische oder pathophysiologische Prozesse zu identifizieren, 17. Historisch gesehen, wurde zwischen den Muskelfasertypen zu unterscheiden, eine Anzahl von zeitraubenden Methoden angewandt. Zu diesem Zweck wurde Muskelfasern entweder bei verschiedenen pH-Werten oder Muskelenzymaktivität durch die Reaktivität von Myosin ATPase eingestuft. Da unterschiedliche Faserqualitäten nicht in einem einzigen Abschnitt, mehrere Querschnitte erforderlich waren , bewertet werden könnten alle Muskelfasern zu identifizieren und 14 manuelle Quantifizierung ermöglichen, 16, 17,= "Xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Im Gegensatz dazu verwendeten jüngste Veröffentlichungen Immunhistochemie (IHC) gegen Myosin schweren Kette-Protein kodiert, um schnell mehrere Fasertypen in einer einzelnen Querschnitte beflecken. Auf der Grundlage der Vorteile dieses Verfahrens ist es nun der Goldstandard in der Muskelfaserpopulationsanalyse betrachtet 19, 23, 24. Mit verbesserten IHC Färbeprotokollen, waren wir, dass die vollautomatische Erfassung ganzer Muskelquerschnitt und die anschließenden Faser Quantifizierung automatischer Muskels zu zeigen, vor kurzem der Lage möglich ist, die Open-Source-Plattform ImageJ. Im Vergleich zu manueller Quantifizierung, vorausgesetzt unser Verfahren eine signifikante Abnahme in der Zeit (etwa 10% der manuellen Analysen) erforderlich pro Folie während genauer wobei 4% bis ± 25 .

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle, zuverlässige, benutzerunabhängige Anleitung zur automatischen Muskelfaser Quantifizierung in ganzen Ratten Muskeln unter Verwendung einer Open-Source-Plattform zu beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir mögliche Änderungen, die seine Verwendung für andere Proben wie Mäuse oder menschliche Muskeln erlauben würden.

Protokoll

Alle Verfahren einschließlich Tierversuchspersonen wurden in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Labortierhaltung durchgeführt , wie von FELASA 26 empfohlen. Genehmigung erhalten wurde vor der Studie der Institutional Review Board der Medizinischen Universität Wien und das Bundesministeriums für Forschung und Wissenschaft (BMWF: Bund fuer Wissenschaft und Forschung, Referenznummer: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).

1. Muskel-Ernte

HINWEIS: Eine frühere Veröffentlichung von Meng et al. 27 ist verfügbar , um das richtige Einfrieren von Muskelproben im Detail zu beschreiben.

  1. Erhalten gesamte Muskeln oder ausreichend Gewebe zu erwerben gesamte Querschnitte unmittelbar nach der Tötung der Tiere.
    1. Entfernen Sie den gesamten Muskel von einer narkotisierten oder eingeschläfert Ratte. Entfernen Sie die gesamte Bindegewebe und Sehnen rund um den Muskel mit einer Pinzette und Schere. Für einnesthesia oder Euthanasie, folgen Sie den internationalen Richtlinien von FELASA 28.
  2. Wiegen Muskel eine kalibrierte Präzisionsskala. Dieser schnelle Schritt ermöglicht vergleichende Analysen zwischen Muskelproben, vor allem nach interventionellen Verfahren.
  3. Setzt Muskel in ein Gefäß, gefüllt vollständig mit OCT - Verbindung, entsprechend die Größe des Muskels mit einem Sicherheitsabstand von etwa 1 mm auf allen Seiten ( zum Beispiel aus Aluminiumfolie).
  4. Einfrieren in ca. 2 min vorgekühltem Isopentan unter Verwendung von flüssigem Stickstoff. Das Isopentan muss beginnen am Boden des Behälters weiße Kristalle zu zeigen.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig für die richtige Architektur des Muskels erhalten und ermöglicht dadurch die richtige Färbung und Faseranalysen 27.
  5. Store Proben für mindestens 24 h bei -80 ° C in OCT konserviert. Die Proben können, werden jedoch bei -80 ° C für mehrere Monate oder sogar Jahre gespeichert, wenn corre ctly abgekühlt.
  6. Schnitt 10 um Querschnitte von dem mittleren Bereich des Muskels bei -20 ° C eine Kryotom verwenden. Wenn bei 10 & mgr; m Schneiden nicht möglich ist, erhöhen, die Dicke in Schritten von 2 & mgr; m bis zu einem Maximum von 20 & mgr; m. Hinreichend scharfe Schneidklingen sind für diesen Schritt notwendig.
  7. Übernehmen Sie die Abschnitte Klebstoff gleitet durch Annähern die Folien auf die Querschnitte. Die Querschnitte haften automatisch an die Kleberutschen. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C über Nacht vor der Färbung.

2. Färbung

HINWEIS: Eine große Anzahl von Antikörpern gegen Myosin-Proteine ​​zur Verfügung steht; jedoch sind qualitativ hochwertige Antikörper wesentlich für die automatisierte Erfassung und Analysen. Für Verdünnungen und Bezug auf Antikörper, siehe Tabelle 1. Für eine Tabellenkalkulationsdatei die korrekten Verdünnungen und sehen Sie die Anzahl der erforderlichen Lösungsmengen zu berechnen, siehesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental 1 Datei.

  1. Tauen und Luft trocknet die gefrorenen Muskelschnitte für 10 Minuten vor dem Färbeverfahren.
  2. Wasch gleitet vorsichtig mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) + 0,05% Triton X für 10 min und dann für 5 min. Triton hat sich gezeigt, signifikant die Färbung Qualität zu verbessern. Siehe die Diskussion für weitere Details.
  3. Lassen Abschnitte der Luft trocknet für 2 min und umreißen Einzelquerschnitten auf jeder Folie eine hydrophobe Stift (erforderliche Menge des Antikörpers zu minimieren) und ermöglicht eine zusätzliche Trocknung für 15 min.
  4. Blockiert alle Objektträger mit PBS + 0,05% Triton X (PBST) mit 10% Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. Verdünnte alle primären Antikörper (Tabelle 1) in einem Cocktail von PBS + 0,05% Triton X (PBST) mit 10% Ziegenserum. Mischen Sie ausreichend vor der Anwendung. Triton X ist von wesentlicher Bedeutung für die gleiche Färbung der gesamten Querschnitten. Berechnenetwa 30 & mgr; l des primären Antikörpers Cocktail pro Querschnitt.
  6. Für die Schritte 2,7-2,13 ausreichenden Schutz vor Licht gewährleisten. Gedimmten Raumbeleuchtung und bedeckt Färbeschalen bieten ausreichenden Schutz. Zusätzlich füllt das Färbewanne mit Flüssigkeit am Boden während der Färbung eine feuchte Umgebung bereitzustellen, und das Trocknen zu verhindern.
  7. Die primären Antikörper anwenden (Tabelle 1) Cocktails auf die Objektträger für 1 h in einer feuchten Färbeschale auf Raumtemperatur.
  8. Waschen Sie die Objektträger mit PBS + 0,05% Triton X für 10 min und dann mit neuen PBST für 5 min.
  9. Verdünnte Sekundärantikörper in einem Cocktail von PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% Ziegenserum. Berechnen von 30 & mgr; l des primären Antikörpers Cocktail pro Querschnitt.
  10. Bewerben sekundären Antikörper-Cocktail auf die Objektträger für 1 h.
  11. Waschen Sie die Objektträger mit PBS + 0,05% Triton X (PBST) für 10 min und mit neuen PBST für weitere 5 min.
  12. Tragen Sie eine DAPI Kernfärbung Kit (vorzugsweise Lese-to-use-Lösungen) for 15 min oder nach den Anweisungen des Herstellers Zellkerne anzufärben.
  13. Waschobjektträger kurz mit PBS + 0,05% Triton X (PBST) für 1 min. Danach lassen gleitet der Luft trocknen kurz.
  14. Anwenden fluoreszierendes Eindeckmediums und Deckgläser. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt und führt Bildgebung optimal innerhalb von 24-48 h.

3. Mikroskopie

  1. Last rutscht in Dia-Scanner. Es können maximal 12 Folien ist möglich, abhängig von der Dia-Scanner.
  2. Starten Sie ein neues Projekt. Für die Vorschau eingestellt den DAPI-Kanal und die 2,5X Linse. Für die detaillierte Analyse verwenden DAPI, GFP, FITC und Cy5-Kanäle und das 20x-Objektiv. Der Autofokus wird während des gesamten Projekts im DAPI Kanal erworben.
  3. Verwenden Sie die folgenden Farben für jeden Kanal: DAPI -blau, FITC: grün, Texas Rot: Rot, Cy5: gelb.
  4. Erstellen Vorschauen jeder Folie des DAPI Kanal. Zu diesem Zweck gelten manuellen Fokus auf der ersten Probe und verwenden Sie es überall in der VorschauAnalyse Vorschaubild von jeder Probe zu erwerben.
  5. Skizzieren jeden Querschnitt, der für die detaillierte Erfassung einbezogen werden sollten. ziehen Sie nicht umreißt der Nähe der Ränder der Probe, Beschriftung des gesamten Gebietes von Interesse zu gewährleisten.
  6. Set Belichtungszeiten für jeden Kanal. In den meisten Fällen Belichtungsparameter der verschiedenen Kanäle sind identisch für alle Querschnitte auf.
  7. Führen Sie eine automatische Bildaufnahme. Korrekten Erwerb für das erste Feld der Ansichten, fehlerhafte Erfassung früh im automatisierten Prozess zu verhindern.
  8. Bei Bedarf etabliert Fernbedienung Desktop-Spiegelung Software. Dies ermöglicht die Fernüberwachung des Bilderfassungsprozesses durch den Computer-Bildschirm des Dia-Scanner auf einem anderen Computer über ein beliebiges Netzwerk oder Internet-Spiegelung. Obwohl, können keine Änderungen an der physikalischen Einrichtung in Bezug auf die verwendeten Folien hergestellt werden, die virtuelle Umgebung der Bildaufnahme-Software ermöglicht die Überwachung korrekte Fokus oder Belichtungszeiten der Bilder. Darüber hinaus kann die geschätzte Zeit für die Fertigstellung regelmäßig überprüft werden.
  9. Nach Beendigung der Bildaufnahme, Steuerung des korrekten Autofokus aller Bilder, die durch manuell, wenn die Faserarchitektur zu steuern, einzelne Fasern und die verschiedenen Fasertypen unterscheidbar sind.
  10. Re-acquire fokussiert falsch Bildbereiche für einzelne Sichtfelder oder ganze Bereiche von Interesse. Für reacquisition der einzelnen Bereiche markieren Bereiche oder Bilder während des gesamten Projekts und reacquire Bereiche mit manuellem Fokus. In den meisten Fällen führt ein zusätzlicher Bildausschnitt in einer anderen Fokusebene auf die falsch fokussierten Bilder
  11. Für jeden Querschnitt, der in der endgültigen Analyse einbezogen werden soll, exportieren, jeden Kanal (ohne DAPI) separat als JPEG-Dateien. Name und sortieren Sie Dateien nach den freiliegenden Kanäle in Ordnern mit dem Namen Texas Red, FITC und Cy5.

4. Automatisierte Faseranalyse

Zelt "> Hinweis: Das Makro aus der folgenden Webseite erhältlich: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

  1. Vorschau jedes Bild eine konventionelle Bildbearbeitungssoftware vor Analysen und prüfen, ob ein ausreichender Kontrast zwischen stained Fasern und Hintergrund verwendet wird. Falls notwendig, Einstellen des Kontrasts und der Helligkeit der Differenz zu erhöhen, unter Verwendung von Helligkeits- und Kontrasteinstellung Befehle.
  2. Öffnen ImageJ oder Fidschi. Öffnen Sie das Makro mit dem Befehl „Plugins - Makros -. Edit“ Dies zeigt den Makros Quellcode und ermöglicht eine schnelle Anpassung von Parametern. für jeden Kanal in dem Quellcode des Makros Falls erforderlich, Ordner-Verzeichnis ändern.
    HINWEIS: Die Werte für Analysen Muskelfaser basieren auf Ratten Bizeps und Lumbrikalmuskel Muskeln, andere Arten oder Muskeln können unterschiedliche Werte erfordern.
  3. Verwenden Sie den Befehl „Ausführen“ das Makro zu starten. Alle Bilder des Ordners werden nun in das Makro geladen und in einer aufeinanderfolgenden Reihenfolge quantifizieren. Die Ergebnisse sind shown in einem neuen Fenster. Dieser Schritt kann von Sekunden bis zu mehreren Stunden dauern, abhängig von der Datenmenge, die analysiert werden.
  4. Exportieren Sie das Ergebnisfenster als Tabellenkalkulationsdatei. Identifizieren Sie Werte für positiv gezählt Cy5 (langsam), FITC (intermediate) und Texas Rot (schnell) Fasern und summieren für Gesamtfaserzahl.

Ergebnisse

Ganzer Rattenmuskel Querschnitt wurden gefärbt schnell Immunhistochemie unter Verwendung von MHC-I, IIA und IIB Muskelfasern zu identifizieren. Unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops Diascanners wurden ganze Querschnitte dann für automatisierte Muskelfasern automatisch erfasst Analysen mit ImageJ. Das Konzept des Verfahrens zugrunde, eine einfache, zuverlässige und zeitsparende Workflow für die Quantifizierung von Muskelfasern auf der Bereitstellung.

Diskussion

Hier zeigen wir eine allgemein zugängliche Methodik zu studieren und automatisch die Muskelfaser Populationen von Ratten Querschnitt über die Immunhistochemie in einer Zeit effiziente Art und Weise zu quantifizieren. Für Reproduzierbarkeit präsentieren wir einen detaillierten Schritt für Schritt erklärt und mögliche Modifikationen für Anwendungen in anderen Arten, die nicht in dieser Studie beschrieben. Darüber hinaus diskutieren wir die Vorteile des Verfahrens, Voraussetzungen für eine optimale Funktion...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Christian Doppler Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir möchten, dass Sabine Rauscher von der Core Facility Imaging an der Medizinischen Universität Wien, Österreich für die Unterstützung während des gesamten Projektes danken. Primäre Antikörper wurden von Schiaffino, S. entwickelt, erhalten von der Entwicklungs Studies Hybridoma Bank durch die NICHD des NIH erstellt und an der University of Iowa, Fachbereich Biologie, Iowa City, IA gehalten.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
O.C.T compoundTissue-Tek, Sakura, NetherlandsFor embedding of muscle tissue
Isopentanefor adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slidesThermo Scientific, Germany1014356190adhesive slides
phosphate buffered saline 
Triton X-100Thermo Scientific, Germany85112Detergent Soluation
Goat serumThermo Scientific, Germany50197ZGoat Serum
DAKO Fluorescent Mounting MediumDako DenmarkS3023
Dako penDako DenmarkS200230-2
TissueFAXSi plusTissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b Thermo Scientific, GermanyA-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1)Thermo Scientific, GermanyA-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain)Thermo Scientific, GermanyA-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes ReagentThermo Scientific, GermanyR37606

Referenzen

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