Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Resumo

Aqui, apresentam-se um protocolo para a fibra muscular rápida análises, o que permite melhor qualidade de coloração, e assim aquisição automática e quantificação de populações de fibras utilizando o software ImageJ livremente disponíveis.

Resumo

A quantificação de populações de fibra muscular proporciona um conhecimento mais profundo dos efeitos da doença, trauma, e várias outras influências sobre a composição do músculo esquelético. Vários métodos demorados têm sido tradicionalmente usados ​​para estudar as populações de fibra, em muitos campos da investigação. No entanto, recentemente desenvolvido métodos imuno-histoquímicos com base na expressão da proteína de cadeia pesada de miosina fornecer uma alternativa rápida para identificar vários tipos de fibra em uma única secção. Aqui, nós apresentamos um protocolo rápido, fiável e reprodutível para a melhoria da qualidade de coloração, permitindo a aquisição automática de secções transversais integrais e quantificação automática de populações de fibras com ImageJ. Para esta finalidade, os músculos esqueléticos incorporadas são cortados em secções transversais, coradas utilizando anticorpos da cadeia pesada de miosina com anticorpos fluorescentes secundárias e DAPI para coloração de núcleos de células. secções transversais inteiras são depois digitalizados automaticamente utilizando um scanner de slides para obter compósitos de alta resoluçãoimagens de todo o espécime. análises de população fibra são subsequentemente realizada para quantificar fibras lentas, intermediários e rápido usando um macro automatizado para ImageJ. Foi anteriormente demonstrado que este método pode identificar populações de fibras de forma fiável a um grau de ± 4%. Além disso, este método reduz a variabilidade inter-utilizador e tempo por análises usando significativamente o ImageJ plataforma aberta fonte.

Introdução

Composição músculo esquelético sofre alterações profundas durante processos fisiológicos tais como o envelhecimento ^{de 1, 2,} exercício ^{3, 4, 5, 6, 7,} ou processos patofisiológicos, tais como a doença de ^{8, 9, 10} ou ¹¹ trauma. Assim, vários campos de concentrado de pesquisa sobre os efeitos estruturais destes processos para compreender as mudanças funcionais. Um dos aspectos fundamentais que determinam a função do músculo, é a composição de fibras musculares. As fibras musculares expressar diferentes proteínas de cadeia pesada de miosina (MHC) e são assim classificados em fibras lentas, intermediários, ou rápidos ^{7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17.} Fisiologicamente, os músculos têm composições de fibras musculares diferentes, dependendo da sua função no corpo. Utilizando fibra muscular digitação, populações de fibras pode ser quantificado para identificar adaptação aos processos fisiológicos ou fisiopatológicos ^{7, 17.} Historicamente, um número de métodos demorados foram aplicadas para diferenciar entre tipos de fibras musculares. Para esta finalidade, as fibras musculares foram classificadas tanto por reactividade de ATPase miosina, a vários níveis de pH ou a actividade da enzima muscular. Como diferentes qualidades de fibras não podia ser avaliada num único ponto, múltiplas secções transversais foram necessários para identificar todas as fibras musculares e permitir manual de quantificação ^{14, 16, 17,}= "refex"> ^{18, 19, 20, 21, 22.} Em contraste, publicações recentes utilizados imuno-histoquímica (IHQ) contra a proteína de cadeia pesada de miosina para corar rapidamente vários tipos de fibra em um único secções transversais. Com base nas vantagens do presente processo, considera-se agora o padrão de ouro na análise da população das fibras musculares ^{19, 23, 24.} Usando melhoradas protocolos de coloração IHC, que foram recentemente capaz de mostrar que a aquisição automática de secções transversais músculo integrais e subsequente quantificação da fibra muscular automática é possível utilizar o ImageJ plataforma aberta fonte. Em comparação com o manual de quantificação, o nosso processo proporciona-se um decréscimo significativo no tempo (cerca de 10% de Manual analisa) necessária por lina ao mesmo tempo que uma precisão de ± 4% ²⁵ .

O objectivo global do presente método é o de descrever uma guia rápida, de confiança, independente pelo utilizador para quantificação automática da fibra muscular no músculo de rato inteiro utilizando uma plataforma de fonte aberta. Além disso, descreve-se potenciais modificações que permitem a sua utilização para outros espécimes tais como ratinhos ou músculos humanos.

Protocolo

Todos os procedimentos, incluindo indivíduos animais foram realizadas em conformidade com os princípios de cuidados com animais de laboratório, como recomendado pelo FELASA ^26. A aprovação foi obtida antes do estudo pelo conselho de revisão institucional da Universidade Médica de Viena eo Ministério austríaco de Investigação e Ciência (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, número de referência: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3-B / 2014).

1. Muscle Colheita

NOTA: A publicação anterior por Meng et al. ²⁷ está disponível descrevendo o congelamento correcta de amostras de músculo em grande detalhe.

1. Obter músculos inteiros ou tecido suficiente para adquirir secções inteiras imediatamente após a eutanásia dos animais.
   1. Retire o músculo inteiro de um rato anestesiado ou sacrificados. Remover todo o tecido conjuntivo e tendões que cercam o músculo com uma pinça e tesouras. Para umnesthesia ou a eutanásia, siga as diretrizes internacionais de FELASA ^28.
2. Pesar muscular usando uma balança de precisão calibrado. Este passo rápido permite análises comparativos entre amostras musculares, especialmente depois de procedimentos de intervenção.
3. Coloque muscular dentro de um vaso, completamente preenchido com o composto OCT, de acordo com o tamanho do músculo com uma margem de segurança de cerca de 1 mm a todos os lados (por exemplo, feito de folha de alumínio).
4. Congelá-lo em cerca de 2 minutos pré-arrefecido isopentano usando azoto líquido. O isopentano deve começar a mostrar cristais brancos na parte inferior do recipiente.
   NOTA: Este passo é essencial para preservar a arquitectura correcta do músculo e, assim, permite que a coloração correcta e analisa fibra ^27.
5. Armazenar as amostras conservadas em OCT durante pelo menos 24 h a -80 ° C. As amostras podem, no entanto, ser armazenadas a -80 ° C durante vários meses ou mesmo anos, se corre ctly arrefecida.
6. Cortar 10 seces transversais da porção média do músculo a -20 ° C utilizando um Criótomo. Se o corte a 10? M não é viável, aumentar a espessura em intervalos de 2 um até um máximo de 20 um. Suficientemente lâminas de corte afiadas são essenciais para esta etapa.
7. Aplicar as seções para lâminas adesivas, aproximando os slides para as seções transversais. As secções transversais vão ficar automaticamente para os slides adesivas. Armazenar as lâminas a -20 ° C durante a noite antes da coloração.

2. coloração

NOTA: Um grande número de anticorpos contra proteínas de cadeia pesada de miosina estão disponíveis; No entanto, os anticorpos de alta qualidade são essenciais para aquisição e análise automatizada. Para diluições e de referência a anticorpos, ver Tabela 1. Para um arquivo de planilha para calcular as diluições corretas e ver o número de quantidades de solução necessários, consultesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental arquivo 1.

1. Descongelar e ar-secar as secções musculares congeladas durante 10 min antes do processo de coloração.
2. Lave as lâminas cuidadosamente com solução salina tamponada de fosfato (PBS) + 0,05% de Triton X durante 10 min e, em seguida, durante 5 min. Triton foi mostrado para melhorar a qualidade de coloração de forma significativa. Veja a discussão para mais detalhes.
3. Deixe secções de ar seco, durante 2 min e delinear secções transversais individuais em cada lâmina utilizando uma caneta hidrófobo (para minimizar a quantidade necessária de anticorpo) e permitir a secagem adicional durante 15 min.
4. Bloquear todas as lâminas com PBS + 0,05% de Triton X (PBST) contendo soro de cabra a 10% durante 1 h à temperatura ambiente.
5. Dilui-se todos os anticorpos primários (Tabela 1) num cocktail de PBS + Triton X (PBST) contendo soro de cabra a 0,05% a 10%. Misturar suficientemente antes da aplicação. Triton X é essencial para igual coloração da totalidade das secções transversais. Calcularcerca de 30 mL de cocktail de anticorpo primário por secção transversal.
6. Para obter etapas 2.7-2.13 garantir uma protecção suficiente da luz. luzes da sala se apagaram e bandejas para corar cobertos fornecer proteção adequada. Além disso, encher o tabuleiro de coloração com o fluido na parte inferior para fornecer um ambiente húmido durante a coloração e evitar a secagem.
7. Aplicar o anticorpo primário (Tabela 1) cocktails para as lâminas durante 1 h num tabuleiro de coloração húmido em temperatura ambiente.
8. Lavagem das lâminas com PBS + 0,05% de Triton X durante 10 min e, em seguida, com novo PBST, durante 5 min.
9. Diluir anticorpos secundários num cocktail de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) + soro de cabra a 10%. Calcular 30 pL de cocktail de anticorpo primário por secção transversal.
10. Aplicar cocktail anticorpo secundário para as lâminas por 1 h.
11. Lavagem das lâminas com PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 10 min e com novo PBST durante mais 5 min.
12. Aplicar um kit de coloração nuclear DAPI (de preferência soluções lidos de usar) for 15 min ou de acordo com as instruções do fabricante para corar os núcleos das células.
13. Lavagem das lâminas brevemente com PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 1 min. Depois disso, vamos lâminas brevemente ar seco.
14. Aplique meio de montagem fluorescente e lamelas. Armazenar a 4 ° C protegida da luz e realizar imagem optimamente dentro de 24-48 h.

3. Microscopia

1. Carga desliza para dentro do scanner de slides. Um máximo de 12 slides é viável dependendo do scanner de slides.
2. Inicie um novo projeto. Para visualização definir o canal DAPI ea lente 2,5X. Para a análise detalhada utilizar canais DAPI, GFP, FITC e Cy5 e o objetivo 20X. Autofocus é adquirido ao longo do projeto no canal DAPI.
3. Use as seguintes cores para cada canal: -blue DAPI, FITC: verde, vermelho Texas: vermelho, Cy5: amarelo.
4. Criar visualizações de cada lâmina utilizando o canal DAPI. Para este fim, aplique foco manual na primeira amostra e usá-lo durante toda a pré-visualizaçãoanálise para adquirir imagens de visualização de cada espécime.
5. Delinear cada seção transversal que deve ser incluído para o processo de aquisição detalhado. Não desenhar esboços perto das bordas do espécime, para garantir a legenda de toda a área de interesse.
6. Definir os tempos de exposição para cada canal. Na maioria dos casos, os parâmetros de exposição dos diferentes canais são idênticos para todas as seções transversais.
7. Executar aquisição de imagem automática. Verifique aquisição correta para o primeiro campo de pontos de vista, para impedir a aquisição incorretos no início do processo automatizado.
8. Se necessário, estabelecer um controle remoto com um programa de espelhamento desktop. Isso permite que o monitoramento remoto do processo de aquisição de imagem por espelhar a tela do computador do scanner de slides para um computador diferente através de qualquer rede ou ligação à Internet. Embora, nenhuma mudança pode ser feita para a configuração física sobre os slides usados, o ambiente virtual do software de aquisição de imagem permite monitorar a foco ou a exposição horários corretos das imagens. Além disso, o tempo estimado para a conclusão pode ser verificada regularmente.
9. Depois de se completar a aquisição da imagem, controlar a focagem automática correcta de todas as imagens por meio do controle manualmente se a arquitectura da fibra, as fibras individuais e os vários tipos de fibra são distinguíveis.
10. Readquirir incorretamente focada áreas de imagem para os campos de vista único ou áreas inteiras de interesse. Para reaquisição de áreas individuais, marcar áreas ou imagens ao longo de todo o projeto e readquirir áreas com foco manual. Na maioria dos casos, um detalhe de imagem adicional em um nível de foco diferente leva às imagens focadas incorretamente
11. Para cada seção transversal que deve ser incluído nas análises finais, exportar cada canal (excluindo DAPI) separadamente como arquivos JPEG. Nome e classificar arquivos de acordo com os canais expostos em pastas nomeadas Texas Red, FITC e Cy5.

4. Análise Automated Fiber

tenda "> NOTA: A macro pode ser obtido na página web seguinte: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

1. Prévia cada imagem utilizando um software de edição de imagem convencional antes de análises e verificar a existência de contraste suficiente entre as fibras coradas e fundo. Se necessário, ajustar o contraste e o brilho para melhorar a diferença, usando os comandos de ajustamento de brilho e contraste.
2. Abrir ImageJ ou Fiji. Abra a macro usando o comando "Plugins - Macros - Editar". Isso mostra o código-fonte macros e permite a adaptação rápida dos parâmetros. Se necessário, mude o diretório pasta para cada canal no código-fonte da macro.
   NOTA: Os valores para as análises de fibras musculares são baseados em bíceps rato e músculos lumbricais, outras espécies ou músculos podem requerer diferentes valores.
3. Use o comando "Executar" para iniciar a macro. Todas as imagens da pasta são agora carregados no macro e quantificadas por ordem consecutiva. Os resultados são shown em uma nova janela. Este passo pode levar de segundos a várias horas, dependendo da quantidade de dados a serem analisados.
4. Exportar a janela de resultados como um arquivo de planilha. Identificar valores para Cy5 contadas positivamente (lenta), FITC (intermediário) e fibras de Texas Red (rápido) e resumir-se para o número total de fibras.

Resultados

secções transversais de músculo de rato inteiro foram coradas rapidamente usando imuno-histoquímica para identificar MHC I, IIA e IIB fibras musculares. Utilizando um scanner de slides de microscópio fluorescente, secções transversais inteiras foram então adquirida automaticamente por fibra muscular automatizado analisa com ImageJ. O conceito do procedimento baseia-se no fornecimento de um fluxo de trabalho simples, fiável e eficiente tempo para a quantificação de fibras muscu...

Discussão

Aqui, demonstramos uma metodologia amplamente acessível para estudar e quantificar as populações de fibras de músculo de rato de secções transversais através de imuno-histoquímica de uma maneira eficiente o tempo automaticamente. Para a reprodutibilidade, apresentamos um detalhado passo descrição passo e modificações potenciais para aplicações em outras espécies não descritas neste estudo. Além disso, são discutidas as vantagens do procedimento, pré-requisitos para a função óptima e suas limi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
O.C.T compound	Tissue-Tek, Sakura, Netherlands		For embedding of muscle tissue
Isopentane			for adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slides	Thermo Scientific, Germany	1014356190	adhesive slides
phosphate buffered saline
Triton X-100	Thermo Scientific, Germany	85112	Detergent Soluation
Goat serum	Thermo Scientific, Germany	50197Z	Goat Serum
DAKO Fluorescent Mounting Medium	Dako Denmark	S3023
Dako pen	Dako Denmark	S200230-2
TissueFAXSi plus	TissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b	Thermo Scientific, Germany	A-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1)	Thermo Scientific, Germany	A-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain)	Thermo Scientific, Germany	A-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent	Thermo Scientific, Germany	R37606