低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

要約

最小侵襲性筋埋め込み (MIME)、骨格筋組織は筋細胞ドナー細胞の筋に注入時を容易にすることができますを含む証拠に基づいていると呼んで実験手法について述べるホストの筋肉。

要約

骨格筋では、住民組織、筋肉繊維生成 (筋原性) 衛星細胞 (SCs)、右の条件の下で新しい筋繊維を形作ることができるため再生能力を所有しています。SCs は筋肉ティッシュから収穫されることが、培養結果の筋細胞は筋ホスト筋へ移植された時の促進に非常に効果的なありません。外科的ホスト筋を公開し、ドナーの筋肉組織、またはそのホスト筋に scs を活用した孤立した筋線維のセグメントを移植、筋芽細胞移植と比較してより良い筋を推進しています。最小侵襲性筋埋め込み (MIME) 呼んで新たな手法を開発しました。針トラックを介してドナー筋肉組織の一部を描画し、ホスト筋に埋め込んで、それをホスト筋の SCs のソースとして可能性がありますドナー組織を残して、ホスト筋を通して手術針を渡す、MIME が含まれます。ここで我々 はその細胞のすべての緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表す免疫不全マウス モデルで MIME を実行する手順の詳細について説明します。ホスト マウスに免疫不全がドナー組織の免疫拒絶反応のリスクを低減し、GFP 発現によりホスト筋線維 (GFP +) とドナー細胞由来筋線維 (GFP-) を簡単に識別。パイロット データは、ホスト マウス脛骨前方 (TA) 筋にドナー マウスから総指伸筋 (EDL) 筋をインプラントに MIME を使用ことができることをお勧めします。(塩化バリウム、BaCl₂) myotoxin を MIME 後ホスト筋肉に注入すると、約 5%、26%、26% 単一のホスト TA に繊維の 43% と、ホスト筋におけるドナー細胞由来筋形成の証拠があることも示唆します。筋肉ないホスト貢献、最小限のホストの貢献、適当なホストの貢献最大ホスト貢献のそれぞれを示します。

概要

分裂にもかかわらず、健全な骨格筋衛星細胞 (SCs)^1,2として知られている組織居住者筋細胞の存在のための優れた再生能力を持っています。^3,4の見直し。しかし、筋ジストロフィー、外傷や老化促進によって引き起こされる病理学の条件の下で筋再生が追いついていない筋肉の内訳、したがって、進歩的な筋肉繊維の損失は、⁵を発生します。ホスト筋筋線維の生理学的に関連する番号を生成する試みがある筋から SCs を分離し、多数の筋芽細胞 (および後である) を生成する文化でそれらを展開する効果的な方法が開発されているが⁶のみ最小限の成功をもたらした。として他の多くの細胞型を持つホスト組織に筋芽細胞を注入するだけで、細胞の大部分はない接が^7,8。人間筋芽細胞⁸注入されたホスト再生欠損マウスの筋肉におけるドナー細胞由来の筋を神経筋電気刺激 (NMES) に促進を示します。他の人は外科的移植筋生検または接続されている SCs と単一の筋線維が SCs と全体の筋線維を植え付けることがあります移植より有利なことを示唆、NMES がなくても適度な筋形成を促進することを示しています。筋細胞だけで^9,10。ドナーまたはホスト筋肉に接ぎ木した人工筋肉組織だけで細胞移植よりも良い結果を生成する、組織や組織のような構造は、ドナー細胞の生着のため、重要な手がかりを提供する可能性があります可能です。様々 な細胞タイプ^10、11,12を含む細胞療法の研究で次第に明らかになっている概念です。

最近のデータは、SCs の人間から得られるよりも 2 週間事後で生成される細胞文化¹³をお勧めします。筋組織収穫死後の生きているホストへの注入は、逆に筋線維の損失を評価する予定します。ドナー細胞由来の筋形成を促進するために生きているホストの骨格筋組織へドナー筋肉組織を移植する MIME と呼ばれる手法を開発しました。MIME は、針トラックを作成するホスト筋を通して手術針を渡す必要があります。針トラックを通してドナー筋肉組織の小さなセグメントの描画ホスト筋; に埋め込まれたままドナー組織組織接着剤の針穴の開閉。安楽死させたマウスのテクニックを練習して勉強した後他の実験においては、今、免疫不全、生きたマウスの MIME を実行しているし、緑色蛍光タンパク質 (GFP) を普遍的に表現、3 と 14 日間のフォロー アップ後 MIME。3 日後 MIME ではドナー マウス (GFP-) EDL 筋が TA (GFP +) 筋、ホスト筋に埋め込まれたままのホスト マウスに注入を確認します。14 日後 MIME BaCl₂ myotoxin 怪我の損傷や筋を誘発した後我々 を確認約 5%、26%、26%、単一のホスト TA 筋肉に繊維の 43% を示すないホストの貢献、最小限のホストの貢献、適度なホスト貢献、および最大貢献をそれぞれホストします。中心核 (変性とそれに続く再生マーカー) は、MIME および myotoxin 注入後 TA 筋線維の約 95% に見られます。

我々 は、この時点でポイントは、再生繊維の大半が集中的に核形成したとき再生の中間段階をキャプチャするため TA 筋肉を MIME + BaCl₂後 14 日と勉強します。我々 はホスト、ドナー由来の筋線維を容易に区別ができるときに我々 は最終的にホストのマウスに人間の死体の筋肉を移植、MIME のためのホストとして GFP + マウスを調べた。この筋から単繊維は TA 筋肉⁹より大きい頚筋電位を示しているので、実験的ドナー組織としてマウス EDL 筋を使用します。EDL 筋肉は、脛骨筋に相乗も、同様の繊維の種類組成を持ちます。私たちの予備的なデータは、MIME がホスト筋におけるドナー細胞由来筋形成を促進することが示唆されました。

プロトコル

ライブ動物を含むすべての研究機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウェイン州立大学、デトロイト、ミシガン州、アメリカ、によって承認され、ケアおよび実験動物の使用 (のためのガイドに従い、2011 年、第 8 版刊国民アカデミーの出版物、500 第 5 通り、NW、ロック ボックス 285、ワシントン、DC 20055、米国)。承認された IACUC プロトコルに従って痛みや苦痛を伴う手術は全身麻酔で誘導され、イソフルラン吸入 (1.5-5% の効果に) によって維持します。眼瞼の欠如と、ピンチをつま先に撤退の不足によって確認された麻酔やヒゲの応答 (イソフルランの割合は効果を維持するために必要に応じて増加した)。プロトコルの性質上低侵襲、" 滅菌ヒント " 技術が続いた。動物は麻酔でしたが、ワセリンは乾燥を防ぐため目に適用されました。必要; 特別な治療法はありませんでした。ただし、ダイエット ゲルは関与している一般的な麻酔。 捜査官が外科的ホストの公開手順を含まない以来次の MIME、鎮痛を保留する IACUC によって承認された手順に従って 24 時間動物に提供されました。筋肉、それは 1 つの後肢に限られている、通常の機能には影響しませんので、正常な筋肉の再生に影響を与える多くの一般的な鎮痛薬が知られています。

1。動物モデル

1. MIME のホスト マウス
   1. 使用 NSG GFP マウス (8-10 週、男性) ホストとして筋肉の移植研究
      。 注: これらのマウスは、理想的なホスト同種筋肉移植におけるサイトカイン シグナル、欠乏している、管または xenografting の非筋細胞の他のユーザーによって使用されている成熟 T および B リンパ球とナチュラル キラー細胞の機能を欠いているため < supクラス ="xref"> 14。ユビキタスの GFP 発現ホスト (GFP +) とドナー由来細胞 (GFP) 筋肉繊維を容易に識別できます
   。
2. MIME のドナー マウス
   1. ドナー マウスとして使用 c57bl/6 j マウス (12-16 週).
      注: これらのマウスは、ドナー マウス完全にマップされたゲノムがある彼らは任意の骨格筋病変を持って知られていないし、容易に利用可能な経済的な GFP を発現していないためです
   。

2。ドナー筋肉組織を準備する

1. 指導の縫合糸を結ぶと収穫ドナー EDL 筋肉
   1. 安楽死させる頚部転位と卓上によって管理される全身麻酔下開胸によるドナー マウス医療酸素 (イソフルラン吸入; 効果 2-5%) によって駆動されるイソフルラン気化器
   。 EDL の筋肉にアクセスする
   2. では、手術用はさみのペアを使用して、脚の前方の表面に皮膚を開きます。前脚で TA、筋肉を見つけ、TA 筋肉の後ろにある EDL 筋を視覚化する取り外します。EDL 筋肉の後ろに鉗子のペアの先端をスライドさせて、つま先が拡張するかどうか参照してくださいに優しいトラクションを適用 (これは筋肉が EDL であることを確認)。                                                                                                                                                      
      注: ドナー組織領域は外科的、収穫する前に無菌準備中をする必要があります
   。
   3. 使用 〜 10 cm セグメント 4-0 絹糸、編みこみ、非吸収性、滅菌縫合と EDL 筋の近位および遠位腱にガイディング ・縫合糸を適用する 2 つダブル ノットを作る。( 図 1 a).
   4. 近位部の腱の遠位の EDL の腱を切って、EDL 筋を反映切り
   。
   5. ドナー EDL 筋ペトリ皿の場所マウス リンガー液でいっぱい
   。

3。MIME のホスト マウスを準備

1. 麻酔
   1. 医療用酸素によって駆動される卓上イソフルラン気化器によって管理される全身麻酔 (吸入イソフルラン; 効果 1.5-5%) の下にホスト マウスを配置します
   。
   2. 誘導室の麻酔し、動物の他の手順を実行しながら麻酔を維持する鼻の円錐形にマウスを転送します。動物は麻酔下にパッドを加熱等温ゲル熱サポートを提供します
   。
2. 皮膚の準備
   1. 動物を削除する ' s 毛皮、左の後ろ脚の前部側面に脱毛クリームを適用します。右脚は、以後の手順をコントロールの脚として機能します
   。 リン酸に浸したワイプで
   2. 戸建と一緒に脱毛クリームを 2 分クリーンに脱毛クリームを残す毛皮緩衝生理食塩水 (PBS)。毛皮除去後ポビドン ヨード洗浄ソリューションと 70% のエタノールの 3 つの交互おしりふきで肌をスクラブします
   。
3. ホスト TA 筋針トラックを作成する
   1. TA 筋肉筋肉に沿ってホストの中心を通って 18 ゲージ (1 in ロング) の手術針を渡す ' s 長い軸 ( 図 1 b)。TA 筋の筋腹 ( 図 1 b) の中心を通る長さに沿って cephalo 尾側方向に針を渡します
      。 注: この手順の目的は、ドナーの筋の部分を埋め込むことができます針トラックを作成します。TA 筋の中心にドナー ティッシュを埋め込むことが悪意のある移行し、全体のホストの間で筋を促進するドナー組織から SCs 脛骨筋
   。
4. ホスト脛骨筋の針のトラックに埋め込みドナー組織
   1. 手術針がホスト TA 筋肉内、合格指導縫合手術針の内腔を通じてドナー組織の一方の端に、caudo 頭部方向 ( 図 1).
   2. Caudo 頭部方向にホスト TA 筋から針を撤回針トラックを介してドナー組織を描画します
   。
   3. は、ドナー組織の配置を調整するのにドナー組織の尾と頭部の両端にガイドの縫合糸を使用します。ドナー組織がホスト脛骨筋 ( 図 1) 以内に落ち着いていることを確認します
   。
   4. ドナー組織配置を最適化すると、先の細いピンセットでドナー組織配置に最終的な調整を行うガイディング ・縫合糸を切断します
   。
   5. シール皮膚針傷 ( 図 1E -F) 鉗子で傷のエッジを近似し 27 ゲージ手術針の先端で獣医組織接着剤を適用します
   。

4。誘発する協調筋変性と再生に Myotoxin 投与

1. 後 MIME を注入ホスト筋における広範な筋線維損傷を誘発するホスト TA 筋 50 60 μ L 1.2% BaCl ₂ (myotoxin) のとドナー組織内に埋め込まれている ¹⁵。
   1. 注入 BaCl ₂ ホスト TA の長さに沿って 3 つのサイトで筋肉 (近位、中間および遠位 3 分の 1 の筋腹).
      注: 骨格筋の BaCl ₂ cardiotoxins と notexin のような myotoxins の注入再生 ¹⁶ 続いて協調筋線維損傷を誘発する
   。

5。手続き後動物ケア

1. 後 MIME や BaCl ₂ 注入、きれいにホスト マウス ' s 左後肢足のエタノールと皮膚を保護するためにワセリンの薄層を適用
。
2. 後手続きスキンケア後鼻の円錐形からホスト マウスを削除します
。
3. は、寝具なしで孤独な回復ケージにマウスを配置します。熱等温ゲルパッド暖房を通して回復動物サポート配置下で回復ケージの半分を提供します
   。 注: いずれか半分は温水ではありませんので、その動物が必要に応じて加熱パッドから離れて移動可能性があります
。
4. ホスト マウスは完全に麻酔から回復した後は、その元のケージに動物を返します。動物施設で動物の背中に置きます、フォロー アップの実験を行った。フォロー アップの準備ができるまで、毎日ホスト マウスを監視 – 例: 3 または 14 日後 MIME で。次の MIME、動物によって監視される研究者同様の獣医のスタッフによって – これは主に動物が明るく、アラート応答の場合の評価を含む動物の痛みの明白な徴候を示しているまたは移動、餌、飲むと手入れをすることの難しさを抱えている場合を評価して
。

6。組織コレクション

1. 収穫ホスト筋
   1. 安楽死させる頚部転位と医療用酸素 (によって駆動される卓上イソフルラン気化器によって管理される全身麻酔下開胸によるホスト マウス吸入イソフルラン;効果 2-5%). 捜査官 IACUC 承認前に安楽死。 全身麻酔下で収穫 TA 筋肉しています
   2. ホスト TA の筋肉にアクセスするには、脚の前方の表面の皮膚を開く外科はさみのペアを使用。前脚の脛骨筋を見つける、遠位の腱を切って、筋肉を反映、近位筋の添付ファイル (セクション 2.1 を参照) をカットします
   。
   3. (実験中) 左と右 (コントロール) TA の両方を収集筋肉
   。
2. 凍結収穫された筋肉をスナップ
   1. を置くことによって収穫された筋肉の重さで紙の重さし、計量スケール
   。
   2. は簡単に鉱物油に対する凍害保護作用で筋肉を浸しなさい。余分な油をしみ
   。 アルミ箔とスナップの
   3. 場所の筋肉は急速に液体窒素をデュワーでいっぱいでそれらを浸すことによって筋肉を凍結します。ラベル付きクリオバイアルにサンプルを転送し、その後の研究の-80 ° C のフリーザーでのサンプルを格納します
   。

7。組織学的研究

1. セクショニング筋肉組織の連続断面を収集
   1. -80 ° C のフリーザーからサンプルを含む液体窒素デュワーにそれらを置くことによってクライオスタットに転送します
   。
   2. 、クリオスタットで同時に 1 つのサンプルを処理します。冷たいかみそりの刃 (刃クライオスタットに格納されている)、約 1-2 mm の厚さは、筋肉のセグメントを生成する脛骨筋の半ば腹を 2 回サンプルをカットします。クライオスタット切片を作るためこのセグメントを維持し、筋肉の残りの部分に戻るそのクリオバイアル
   。
   3. 凍結コンパウンドの最適切削温度 (OCT)、クライオスタット試料ディスク上に組織の厚いセグメントをセキュリティで保護します。試料ホルダーに試料ディスクを配置します
   。
   4. 粗面 20 μ m セクションの切断によってサンプル。クライオスタット切片をスライド ガラスにいくつかの 20 μ m セクションを収集します
   。
   5. 場合、20 μ m の品質は満足、切削厚み 5 μ m に変更し、品質を評価するためにいくつかのセクションを収集します。5 μ m のセクションが品質に満足なら、連続切片を収集します。スライドごとの 2-3 節、3 スライドの十分なセクションを収集します
   。
   6. 実験 (左) とそれぞれの動物のコントロール (右) TA 筋肉の両方からのセクションを収集します
   。
2. 勉強 GFP 発現
   注: 筋線維における GFP 発現を研究する準備されたスライド (セクション 7.1) の 1 つのセットを指定します。
   1. は、セクションで耐フェード媒体の 〜 50 μ L を適用し、ガラス基板を適用します。クリアのマニキュアと coverslip エッジをシールします
   。
   2. 光と蛍光顕微鏡を用いた (表の材料 を参照)、研究目的と GFP を可視化するための適切なフィルター X 10 のセクション。 TA 筋の全体の横断面をカバーするための視野の重複の
      1. 収集のデジタル画像の (~ 15)。各 visual フィールド蛍光から顕微鏡の位相コントラスト モードへの切り替えによって位相コントラスト画像を収集します
      。
   3. ; 単一コンポジット画像を生成する個々 の画像を並べて表示できます適切な画像処理ソフトウェアで画像を開く例えば 使用、" photomerge " イメージング ソフトウェアの [ファイル] メニューの [オプションに掲げる 材料表
   。
   4. は、適切なイメージ解析ソフトウェア (例えば ImageJ) GFP 蛍光画像を開きます。円個々 の筋線維を使用して、" ROI ツール " し、各繊維の平均蛍光強度を記録。
      1. GFP 発現を示し、正常形態 10 の繊維の平均蛍光強度の平均を取ることによって最大 GFP (蛍光) 強度計算。最大の GFP 強度によって各繊維の平均蛍光強度を分割し、100 を掛けることによって各繊維 %gfp の最大強度を計算します。 図 3 e で示すように、各 TA 筋の GFP 解析の結果を集計します
      。
3. デスミンと 4 の蛍光ラベル化による筋線維の整合性と伴なう場所を勉強 '、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) それぞれ
   。 注: は、上記のように、筋線維のデスミン ラベリングを勉強する準備されたスライドの 1 つのセットを指定します。
   1. 修正プログラム セクション PBS で 10 分 2% パラホルムアルデヒドで洗って 3 回 PBS のセクション
      。 注意: 適切な個人用保護具 (PPE) を着用は、パラホルムアルデヒドを処理するときを処理するときです
   。
   2. 0.01% を含む PBS で希釈した 3% ウシ血清アルブミンを持つブロック セクション 30 分トリトン X100。このブロッキング液として来世に呼びますプライマリ希釈します
   。
   3. 一次希釈液 (レバレッジ) にウサギ抗デスミン免疫グロブリン G (IgG) を希釈します
   。
   4. ブロックが完了したら、セクションで希釈した一次抗体を適用し、incubate 一晩 ~ 4 ° c. の洗浄で冷蔵庫で一度 (5 分) のセクション 0.1% を含む PBS トリトン X-100。このソリューションは、最初の洗浄バッファーとして来世呼ばれます
   。
   5. 洗うセクション PBS で 3 回 (洗浄あたり 5 分) です
   。
   6. アンチ山羊を希釈することによって二次抗体ウサギ IgG は 0.01% を含む PBS で (赤の蛍光色素を標識) 準備トリトン X-100
   。
   7. セクションに希釈した二次抗体を適用し室温 (~ 23 ° C) 60 分インキュベート
   8. は、最初の洗浄バッファーで一度 (5 分) のセクションを洗ってください。3 回 (洗浄あたり 5 分) PBS のセクションを洗浄します
   。 3 分
   9. 適用 DAPI は、PBS で 3 回 (洗浄あたり 1 分) セクションを洗ってください。適用 〜 セクションの媒体が耐フェードを 50 μ l 添加し、ガラス基板を適用。クリアのマニキュアと coverslip エッジをシールします
   。
   10. 光と蛍光顕微鏡を用いた研究 (材料の表 を参照)、シリアルのセクション目的と可視化のための適切なフィルター × 10 で赤い蛍光染料
   。
   11. は、脛骨筋の全体の横断面をカバーするため重複する視野のデジタル画像 (~ 15) を収集します。Visual フィールドごとに適切なフィルター設定への切り替えによって分類する DAPI の蛍光画像を収集します
   。
   12. オープン 7.2.4 7.2.3 - の手順で説明するように適切なイメージング ソフトウェアを使用して画像を分析と
       。 注: 研究の筋線維は損傷 (デスミン負)、識別するため、画像が筋線維が中心核 (デスミン陽性線維末梢ではなく、内部である DAPI ラベル核を持つ)、あり、セクションの領域炎症や線維化 (クラスター化、DAPI ラベル核の多くがあるが、筋線維を欠いている部分) がある
   。

結果

3 日後 MIME でドナー MIME の注入は、EDL はホスト TA 筋肉コンパートメント (図 2 a-C) 含まれています。予想通り、ドナー マウスから TA 筋肉の断面積に師事蛍光光学系、GFP (図 2 D) 表現しないので緑の蛍光性を示さない。対照的に、ドナー組織が注入されないホスト マウス脛骨筋の断面表示均一蛍光グリーン TA の筋線維で繊維エクスプレス GFP (図 2 e)。ドナー筋肉組織を持つ MIME による注入筋肉の断面積、ホスト筋線維 (GFP +) とドナー筋線維 (GFP-) 間の分界のラインがあります。図 2Eで図 2 D-Fに示すように視野の位相コントラストの画像が表示されます '-F' 、筋線維の領域の存在が実際にことを提案する GFP がないです。信号。

14 日後 MIME と BaCl₂注入、残っている TA 筋肉のセクション ラベルまたはデスミン (図 3)、抗体が付いていますシリアル クロスを研究することによって GFP 信号がすべての筋肉繊維によって表されることを学習、(実行可能な筋線維を検出する赤いデスミン ラベリング) MIME 処理の筋肉ではなくホスト マウスから未処理の筋肉。MIME と BaCl₂注射ホスト TA 筋、ドナー細胞由来筋 GFP の探索可能なシグナルを示さない多くの desmin(+) 筋線維の存在から明らかである (図 3-D 3 C' -D')。ホストとドナーの筋細胞の可能性の融合から生じるキメラの筋線維は、これらの繊維が出展した GFP 蛍光の中程度のレベルに低で検出できます。多数のキメラの繊維は、ドナー SCs が数百ミクロン ホスト筋の下腿内に移行することができることを示唆 TA 筋全体の直径に表示されます。図 3Eに GFP + 繊維の定量を示します。図 4は、MIME + BaCl₂扱われる TA の筋肉全体のシリアルの断面積の高倍率画像を示しています。

図 1.最小限侵襲筋埋め込み (MIME) 関連する手順。
MIME は、全身麻酔下で実行されます。それは、リンゲル液にドナー筋 (ドナー マウス EDL) ~ 10 mg を配置し、その端点(A)に導く縫合糸を結ぶことを含みます。18 ゲージ針はホスト筋(B)の長い軸を通して渡され、ドナー組織針トラック(C)が引かれます。ドナー組織ホスト筋(D)に埋め込まれた左、ガイディング ・縫合糸の切り取り、および針穴が組織接着剤で密封されて (E)。封印された針の傷は、 (F)の矢印で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.TA 筋の研究 MIME 後 3 日。
ホスト筋収集 MIME; 後 3 日ホスト TA (矢印; 注針A B)。さらにデータは、TA 筋肉コンパートメント (B ・ C) 以内に埋め込まれたドナー マウス EDL が落ち着いていることを確認します。TA 筋断面積を表示 3 日 NSG GFP TA 筋筋野生型脛骨筋(D)でない蛍光グリーン、NSG GFP TA 筋(E)、明るい蛍光グリーンとホストとドナー間の区別の蛍光画像後 MIME ((F))。D F で視野の位相コントラスト画像のとおり D'-f '、それぞれ。パネル F と F の赤い線 ' ホストとドナー組織間の分界のラインを示しています。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3.TA 筋の研究 MIME 後 14 日。
14 日後の MIME データを収集しました。赤い信号、デスミンの蛍光ラベリングから (デスミンの肯定的な信号は、筋線維が実行可能なを表します)、青の信号は DAPI (汚れの核) から、緑の信号 GFP から。ほぼすべての筋線維は、コントロール脛骨筋 (右後肢) どおりホスト マウスから収穫、デスミン、これらの筋線維が実存し得ることを示唆している (A; 赤い信号) の肯定的です。また、DAPI 染色に基づいて、それは明らかにそのほぼすべての筋線維の筋の核、末梢に位置する健全な筋肉 (A; 青い信号) で予想されます。シリアル制御脛骨筋部は、ほぼすべての筋線維が明るい緑色、GFP の肯定的なことを意味している、表示します。MIME + BaCl₂ -脛骨筋 (左後肢) を扱われるドナー細胞筋検出 GFP 蛍光を示さない多くの desmin(+) 筋線維の存在から明らかである (C D、C'-D')。中程度の GFP 蛍光 (キメラ筋線維) に低 Desmin(+) 筋線維が MIME TA 筋の下腿内移行が促進でき SCs ドナーを使用することを示唆している TA 筋肉全体の直径にわたって存在ドナー細胞由来筋。A'-D' A +の青色のボックス内の領域の高倍率画像GFP(+)、中心核の繊維の定量がEで表示されます。スケール バー 50 μ m、100 μ m (A ~ D) = (A'-D')。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 4.広範な被害と再生の証拠 MIME と BaCl₂注入後 14 日。
高倍率は、MIME + BaCl₂扱われる TA の筋肉全体のシリアルの断面が掲載されています。データ表示、多く適度である筋線維または強く GFP + が中心部にある核 (A B; 赤デスミンからの信号は、a 青い信号は DAPI、B の緑色の信号は GFP から)。これらのデータは、その変性を示唆していると再生後 BaCl₂注入は GFP 発現を影響しません。このコンテキストで MIME + BaCl₂扱われる脛骨筋、ほとんどは GFP 発現の中心核の筋線維の存在を示唆しているこれらの繊維が筋 (または再生) の可能性が高い結果であることから重要な貢献をGFP - 筋細胞。これらの観察は、選択したフィールド (C Fの高倍率画像でさらに確認できます。C、D、および E および F、シリアル クロス セクションから領域が重なってA のそれらの領域の場所を示す画像の境界線の色と B)。スケール バー = 100 μ m (A B) と (C F) 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、ホスト筋肉組織にドナー筋肉組織を移植する当研究室で開発された、MIME と呼ばれる実験手法の詳細なプロトコルを提案する.これは接木をホスト筋^9,10,17におけるドナー細胞の筋形成を促進する上で効果的であることが、すでに開いている筋肉の適応。

MIME の目標は m を刺激する条件の下でホスト筋における筋形成に貢献できる SCs ドナーのソースを提供するものが、筋肉にはホスト (現在はわかりませんこれが発生したかどうか)、ドナー筋組織自体の生着を有効にしません。uscle 再生。私たちの希望は、MIME を最適化し、基本的なおよび前臨床研究でテストされた後、それは筋の筋肉の損失を受けている骨格筋の筋再生を向上を目指す臨床治療をガイドする貴重な洞察力を提供できることです。

まだどのように MIME に変換できること臨床療法などについて答えられなければならない多くの質問がある: ドナー組織の品質を制御する方法ですか?我々 はドナー組織や細胞の免疫拒絶反応を制御する方法は?ドナー組織が筋の細胞を提供した後オフになってそれは線維性瘢痕を残すか。ドナーやホストの筋線維タイプはドナー細胞の筋に影響を与える?どの筋肉は実質的に MIME から寄与できるか。MIME は、安全かつ効果的な評価、ドナー由来の筋を強化でき、上記質問の多くに答える補助治療法を特定する研究を展開しています。

MIME とマウス-マウス同種移植のテストを完了すると、私たちの次のステップは、死体の筋肉組織の筋原性の可能性を評価する死体の人体組織と人間-マウス MIME を行うことです。これらの実験は基本的な橋渡し研究教育体遺贈プログラムなど臓器の命の贈り物プログラムへの取り組みに登録されているドナーから筋肉組織を含む新しい行につながることを期待して.

本稿で示した代表的なデータでは、MIME 後 14 日に GFP を欠いているか、GFP の低レベルを持っているいくつか実行可能な筋線維があることを示唆しています。これらのデータの解釈は GFP ドナー衛星細胞がホスト筋における筋形成に寄与しています。ひと死体組織のホストのマウスの筋肉への注入の準備のためにこの実験を行った。インプラントの表現 (例えばGFP と簡単に区別できる、蛍光レポーター ドナー組織に有用であろうドナー衛星細胞が次の MIME ホスト筋における筋形成に寄与することを明確に示すため、赤色蛍光タンパク質 GFP + ホスト筋に移植したドナー組織を表現する)。

この手法は、主にドナー組織内に存在の SCs の性質によって制限されます。ドナー組織で SCs テクニックはドナー細胞の筋を容易にする可能性、実行可能な場合は中に、すれば彼らは実行可能な筋が発生することはできません。しかし、以来、SCs は非常に弾力性のある、死後約 2 週間のために実行可能、それは実験目的のための収穫後、数分内に注入されたドナー組織はドナー細胞筋^{13 を容易に可能性が高い}.さらに、上記に触れたように、それは (SCs 成熟の筋線維、筋常駐型線維芽細胞を含む) 全体の筋組織からホスト筋に埋め込まれる、線維症が発生する可能性が可能です。しかし、この仮定は、実証的に検討する必要があります。有害収縮、cryoinjury、および実験的 myotoxins から生じる筋損傷文献は、(主に大食細胞) の免疫細胞が効果的に破損した繊維から細胞の破片をクリアし、改造することができることを示唆している、細胞外マトリックスの¹⁸。したがって、それは MIME と BaCl₂投与宿主免疫細胞変性のドナー筋線維へのアクセスを持っている限り可能性を消去する破片、SCs のドナーだけを残してします。最後に、ドナー由来筋形成の程度はホスト筋に埋め込まれているドナー筋肉組織の量に依存しています。ドナー細胞由来の筋線維が完全に再作成ホスト筋肉コンパートメントの順序でメソッドのような X- または γ 線照射ホスト筋 SCs をアブレーションし、また繰り返される MIME 手順が必要必要になります。

外科的ホスト筋を公開およびホスト筋にドナー組織の部分を縫合がドナー細胞筋^9,10,17を促進できることが実証されています。このオープンな外科的アプローチは、筋の進行を追跡し、筋疾患のマウスモデルを生成する、過去に使用されています。MIME 技術の革新的な側面は低侵襲手術公開ホスト筋を必要としないことです。これは医原性の感染症したがって、それはより必要な場合同じホスト筋に MIME を繰り返し実行可能になるホスト動物の不快感の程度のリスクを低減します。

MIME 手法を現在ホスト マウスにドナー筋肉組織をインプラントに続いてオープン外科的アプローチに適した洗練されたことを期待しています。ヒト化マウス モデルの生成を促進すると、ホスト マウス筋生検筋を埋め込むことによってこのことが。さらに、マウスのマウスの移植から私たちの予備的なデータに基づき、MIME がドナー SCs が実行可能な限り人間の死体ドナー組織から筋をドナー細胞性を達成するために効果的なことと見込んでください。最後で追加テストと検証、我々 は MIME 手法が筋疾患をもつ人間でドナー細胞の筋を容易にする新しい治療法の開発を助けることを願っています。

MIME 手法の成功はホスト筋筋膜コンパートメント (下腿) 内ドナー組織を正確に埋め込むに批判的に依存しています。ドナー組織ホスト筋肉コンパートメント内に配置すると場合にのみ、正確な方法でホスト筋に SCs を提供できるそれことが。ドナー組織ホスト筋の外側に配置された場合、その運命になるかが明確じゃないです。MIME の実験モデルで、それは顕著で、表面的に足の前外側の側面に置かれたのでにホスト筋として脛骨筋を使用します。サイズ、向き、および脛骨筋の解剖学的位置により簡単にドナー組織が配置されること正しくホスト TA 筋肉内で MIME を確認します。本稿では、実験的証拠を実施している再ドナー組織ホスト 3 日後 MIME で TA 筋肉内が埋め込まれた本管は 14 日後 MIME でホスト筋におけるドナー細胞の筋です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NSG-GFP mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock #021937	Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock #000664	Control donor mice
Tabletop isoflurane vaporizer	VetEquip (Livermore, CA)	Item #901801	Inhaled anesthesia system
Magic depilatory crea	Softsheen Carson (New York, NY)	N/A	Razorless hair removal cream
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures	Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)	SUT106631	Guiding sutures for donor tissue
VetBond veterinary tissue adhesive	3M (Maplewood, MN)	Catalog #1469Sb	Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure
Barium chloride	Ricca Chemical Company (Arlington, TX)	Product #R0854000-500A 854-16	Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration
Deltaphase isothermal gel heating pad	Braintree Scientific (Braintree, MA)	Item #39DP	Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
HM525NX cryostat	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog #HM525NX	Cryostat to make frozen sections of muscle
Vectashield Antifade Medium	Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)	Catalog Number: H-1000	Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples
Rabbit anti Desmin Antibody	Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)	RB9014P	Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog#: A-21069	Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Seracare (Milford, MA)	Catalog #5930-0006 or 71-03-01	Reagent for fluorescent labeling of nuclei
Axio Scope.A1 microscope	Carl Zeiss (Peabody, MA)	Product #Axio Scope.A1	Light and fluorescence microscope
Photoshop CS4	Adobe Systems (San Jose, CA)	Photoshop CS4	Imaging Software for perform image tiling
Image J	National Institutes of Health (Bethesda, MD)	Image J for Windows 64-bit Operating System	Imaging Software for quantitative fluorescence analysis