Минимально инвазивные мышц, встраивание (MIME) - роман Экспериментальная техника для содействия доноров Cell-Mediated ультраструктур

Резюме

Мы описываем Роман экспериментальный метод, который мы называем минимально инвазивные мышцы встраивания (MIME), который основывается на доказательствах, содержащий миогенных жизнеспособных клеток, которые могут облегчить доноров cell-mediated ультраструктур когда имплантируется в скелетной мышечной ткани хост мышцы.

Аннотация

Скелетная мышца обладает регенеративной способностью благодаря ткани резидентов, мышечные волокна приносящей (миогенных) Спутниковое клетки (СКС), которые могут образовывать новых мышечных волокон при правильных условиях. Хотя ГКС могут быть собраны из мышечной ткани и культивировали в vitro, результате клетки myoblast не очень эффективны в поощрении ультраструктур, когда пересаженные в принимающей мышц. Хирургическим путем разоблачения принимающей мышц и пересадка сегментов доноров мышечной ткани, или изолированных мышечных волокон с их СКС на хост мышц, способствует лучше ультраструктур, по сравнению с myoblast трансплантации. Мы разработали Роман технику, которую мы называем минимально инвазивные мышцы встраивания (MIME). MIME включает прохождения хирургической иглой через мышцу хост, используя кусок доноров мышечной ткани через иглу трек и затем оставив донорской ткани, встроенных в принимающей мышцы так, что он может выступать в качестве источника СКС для принимающей мышц. Здесь мы подробно описать шаги участвует в выполнении MIME в иммунодефицитных мыши модель, которая выражает Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) во всех ее ячеек. Иммунодефицита в мыши узел уменьшает риск иммунного отторжения тканей донора и экспрессия гена GFP позволяет легко идентифицировать принимающей мышечных волокон (GFP +) и доноров клеток, полученных мышечных волокон (GFP-). Наши экспериментальные данные показывают, что MIME может использоваться для имплантата (EDL) Лонг разгибатель пальцев от доноров мыши в tibialis мышцу передней (TA) узла мыши. Наши данные также показывают, что, когда myotoxin (бария хлорид,₂BaCl) вводят в принимающей мышц после MIME, есть свидетельства доноров клеток, полученных ультраструктур в принимающей мышц, с примерно 5%, 26%, 26% и 43% волокон в одном узле TA мышца показывая не взнос принимающей, минимальный хост вклад, вклад умеренной хост и максимального пребывания вклад, соответственно.

Введение

Здоровые скелетных мышц, хотя после митотическая, обладает отличным регенеративной способностью из-за наличия ткани резидентов миогенных клеток, известный как спутниковое клетки (SCs)^1,2; и обзор в^3,4. Однако в патологических условиях, вызванных мышечной дистрофии, травмы или ускоренного старения, регенерации мышц может не отставать от мышечного разрушения, и таким образом, происходит прогрессивного мышечного волокна потеря⁵. Хотя эффективные методы были разработаны для изоляции СКС из мышц и расширять их в культуре для создания большого числа сомитов (и впоследствии myotubes), попытки сформировать физиологически соответствующие количества мышечных волокон в принимающих мышцы имеют дали только минимальные успеха⁶. Как с много других типов клеток, когда сомитов вводят только в ткани макроорганизма, большинство клеток не привито^7,8. Мы показали, что нервно-мышечной электростимуляции (NMES) облегчает доноров клеток, полученных ультраструктур в мышцах мыши регенерации недостаточным хост, который был впрыснут с человека сомитов⁸. Другие показали, что хирургическим прививочных биопсию мышц или одном мышечных волокон с прилагаемой SCs, облегчения умеренный ультраструктур даже без NMES, предполагая, что имплантация весь мышечных волокон с СКС может быть более выгодным, чем имплантации миогенных клетки только^9,10. Так как донора или инженерных мышечной ткани, привитые в принимающей мышцы производит лучшие результаты, чем пересадка клетки только, вполне возможно, что ткани или ткани как структуры могут обеспечить решающее значение подсказки для приживления доноров клеток; концепция, которая становится все более очевидным в клеточной терапии исследований с участием различных клеток типы^10,,1112.

Последние данные показывают, что СКС, полученные от людей более чем 2 недели посмертное генерировать myotubes в культуре¹³. Поэтому мы намерены оценить если имплантации мышечной ткани собирают посмертные в живые принимающей будет вспять потери мышечного волокна. Мы разработали Роман технику, называемую MIME вживлять доноров мышечной ткани в скелетной мышечной ткани живые принимающей чтобы поощрять доноров клеток, полученных ультраструктур. MIME включает прохождение хирургической иглой через хост мышцы для создания иглы трек; Рисование небольшой сегмент доноров мышечной ткани через иглу трек; оставив тканей донора встроенный в принимающей мышц; и закрытие иглы отверстия ткани клеем. После того, как практикующих технику в Усыпленных мышей учился в других экспериментах, мы теперь выполнены MIME в живых мышей, которые иммунодефицитных и повсеместно выражают Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), и последующих мер на 3 и 14 дней после MIME. На 3 дня после MIME мы подтверждаем, что доноров мышь (GFP-) EDL мышцы имплантируется в принимающей мышь (GFP +) та мышц, останки, внедренного в узел мышцы. На 14 дней после MIME после BaCl₂ myotoxin травмы вызывают повреждения и ультраструктур, мы подтверждаем, что примерно 5%, 26%, 26% и 43% волокон в одном узле TA мышцы показать не взнос принимающей, вклад Минимальный хост, умеренные хост вклад и максимальной разместить вклад, соответственно. Центральный нуклеации (маркер дегенерация и последующей регенерации) рассматривается в приблизительно 95% TA мышечных волокон после инъекции MIME и myotoxin.

Мы изучаем TA мышцы через 14 дней после MIME + BaCl₂ , потому что этот момент захватывает промежуточной стадии регенерации, когда большинство регенерированных волокон централизованно тому. Мы изучаем GFP + мышь как хостов для MIME, так что когда мы в конечном итоге трансплантировать человека трупной мышц в принимающей мышей, мы сможем легко различать мышечных волокон происхождения, принимающих стран и доноров. Мы используем мышь EDL мышцы как экспериментальный донорской ткани, поскольку одного волокна от этой мышцы показали миогенных больший потенциал, чем та мышцы⁹. EDL мышц также синергетический TA мышцы и имеет аналогичный состав тип волокна. Наши предварительные данные показывают, что MIME способен содействия доноров клеток, полученных ультраструктур в принимающей мышцы.

протокол

все исследования, с участием живых животных утверждаются учреждение животное уход и использование Комитет (IACUC) в Уэйнском Государственном университете, Детройт, Мичиган, США и в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных ( 8-е издание, 2011, опубликована издательством национальных академий, 500 пятая улица, сейфа 285, NW, Вашингтон, DC 20055, США). В соответствии с утвержденным IACUC протоколов процедур с участием боль или страдания были выполнены под общим наркозом, который является индуцированных и поддерживается изофлюрановая ингаляции (1,5-5% к эффект). Анестезии была подтверждена отсутствие вывода до пят щепотка и отсутствие глазной или вибриссов ответы (процент изофлюрановая был увеличен при необходимости поддерживать эффект). Из-за минимально инвазивной природы протоколов " стерильный советы " техника последовал. В то время как животные были под наркозом, вазелин был применен к глаза для предотвращения сухости. Без специальных процедур требовалось; Однако гель диета была оказана животных за 24 ч, после процедур, предусматривающих общий наркоз. следователь одобрена IACUC удерживать анальгезию после MIME, поскольку процедура не хирургическим путем разоблачения принимающей мышца, потому что она ограничивается одной задних конечностей и не влияет на нормальную функцию, и потому, что многие общие болеутоляющие препараты, как известно, влияют на нормальной мышечной регенерации.

1. Животные модели

1. мышей хост для MIME
   1. использования ГЯП-GFP мышей (8-10 неделе, мужчина) как узлы для мышц графтов исследования.
      Примечание: Эти мыши являются идеальным хостов для аллогенной мышцы графтов, потому что они не хватает зрелых лимфоцитов T и B и функциональных естественных клеток-киллеров, являются несовершенными в цитокина сигнализации и были использованы другие для allografting или xenografting-мышечных клеток < sup класс = «внешней» > 14. Вездесущие экспрессия гена GFP позволяет легко идентифицировать хост (GFP +) и доноров клеток, полученных (GFP-) мышечных волокон.
2. Доноров мышей для MIME
   1. использования C57BL/6J мышей (12-16 неделя) как доноров мышей.
      Примечание: Эти мыши являются мышей подходящего донора, потому что они имеют полностью сопоставленных генома, не известно, чтобы иметь любой патологии скелетной мускулатуры, легко доступны и экономичным и не выразили ГПУП.

2. Подготовка доноров мышечной ткани

1. связывая руководящих швы и заготовка донорской EDL мышцы
   1. усыпить доноров мышей шейки матки вывихов и торакотомии, выполняется под общим наркозом, ведении настольные изофлюрановая испарителем, движимый медицинского кислорода (вдыхаемого изофлюрановая; 2-5% до эффекта).
   2. Для доступа к EDL мышц, использовать хирургические ножницы для открытия кожи на передней поверхности ноги. Найдите TA мышцы в переднюю ногу и удалить его для визуализации EDL мышца, которая находится позади TA мышцы. Сдвиньте кончик пару щипцами за EDL мышц и применить нежной тяги, чтобы увидеть, если пальцы продлить (это подтверждает, что мышцы EDL).                                                                                                                                                          
      Примечание: донорской ткани области должно быть хирургически, асептически prepped до урожая.
   3. Использование ~ 10 см сегментов 4-0 шелк, плетеные, не рассасывающиеся, стерильные шовный материал и сделать два двойной узлов применять руководящие швы в проксимальном и дистальном сухожилий мышц EDL. ( рис. 1A).
   4. Вырезать дистального сухожилия EDL, отражают EDL мышц и сократить проксимальной сухожилие.
   5. Место доноров EDL мышцы в чашке Петри заполнены раствором Рингера мыши.

3. Подготовка принимающей мышей для MIME

1. анестезия
   1. место пребывания мышь под общим наркозом (вдыхаемого изофлюрановая; 1,5-5% к эффект), ведении настольная изофлюрановая испарителем, движимый медицинского кислорода.
   2. Вызвать обезболивание в камеру всасывание и затем передать мыши в нос конус для поддержания анестезии во время выполнения других процедур на животное. Тепловые поддержки с изотермической гель, грелку, а животное находится под наркозом.
2. Подготовки кожи
   1. для удаления животное ' s мех, применять депиляционный крем над передней аспект левую заднюю ногу. Правая нога служит управления ноги для последующих процедур.
   2. Отпуск депиляционный крем на 2 мин чистого покинуть депиляционный крем вместе с отсоединенной мех с салфетки, пропитанные фосфат буфер солевой раствор (PBS). После удаления меха, вымыть кожу с трех чередующихся салфетки скруббера повидон йод раствор и 70% этанола.
3. Создание дорожки иглы в мышцу TA принимающей
   1. пройти 18-(1 в. Лонг) Хирургические иглы через центр принимающей TA мышцы вдоль мышц ' s длинной оси ( рис. 1B). Передайте иглу в цефало хвостового направлении, по длине TA мышцы и через центр мышцы живота ( рис. 1B).
      Примечание: Этот шаг предназначен для создания трека иглы, в который может быть внедрен кусок мышцы доноров. Встраивание донорской ткани в центре TA мышцы потенциально позволит SCs из донорской ткани для миграции и облегчения ультраструктур через весь узел TA мышцы.
4. Встраивание донорской ткани в иглу трек хоста TA мышц
   1. Хирургические иглы находится в пределах узла TA мышц, передать руководящие швы на одном конце донорской ткани через просвет Хирургические иглы в caudo акушерский направлении ( рис. 1 c).
   2. Привлечь доноров ткани через иглу трек как иглы снимается с принимающей TA мышцы в направлении caudo акушерский.
   3. Использовать руководящие швы в головной и хвостовой концах донорской ткани для настройки размещения донорской ткани. Убедитесь, что ткань доноров укрывшимся в засаде в узле TA мышцы ( рис. 1 d).
   4. После размещения тканей донора оптимизирован, отрезать руководящих швы, внести любые окончательные изменения в размещение тканей донора с острым концом щипцами.
   5. Уплотнение кожи иглой раны ( Рисунок 1E -F), аппроксимирующей края раны с щипцами и применяя клей ветеринарных ткани с кончика иглы хирургические, 27.

4. Myotoxin, внутримышечно побудить согласованные дегенерации мышц и регенерации

1. после MIME, вдохнуть 50-60 мкл 1,2% BaCl ₂ (myotoxin) в узел TA мышцы чтобы вызвать повреждение обширные мышечных волокон в принимающей мышц и тканей донора, внедренные в это ¹⁵.
   1. Придать BaCl ₂ на 3 сайтах по длине принимающей TA мышцы (проксимальный, средние и дистальные-треть мышц живота).
      Примечание: Впрыскивать myotoxins как BaCl ₂, кардиотоксинов и notexin в скелетных мышцах индуцирует повреждение согласованные мышечных волокон, следуют регенерации ¹⁶.

5. После процедуры животное уход

1. после MIME и BaCl ₂ инъекции, почистите мышь хост ' s левый лань нога с этанолом и применить тонким слоем для защиты кожи вазелином.
2. После ухода за кожей после процедуры, удалите узел мыши из носовой конус.
3. Поместите курсор мыши в клетке одиночных восстановления без постельных принадлежностей. Обеспечения тепловой поддержки восстановления животных через грелку изотермические гель помещается под половину клетки восстановления.
   Примечание: Одна половина не нагревается так что животное может при необходимости переместить от грелки.
4. После того, как узел мыши полностью оправился от наркоза, вернуть его оригинальные клетке животное. Поместите животных обратно в объекте животных до тех пор, пока последующие эксперименты. Мониторинг хост мыши ежедневно до тех пор, пока он готов для последующей – пример: в 3-14 дней после MIME. После MIME, животные контролируются сотрудниками лаборатории также ветеринарного персонала – это главным образом включает в себя оценку если животных яркие, оповещения и реагировать; а также оценки если животных явной признаки боли или возникли трудности, перемещение, питание, пить и ухаживание.

6. Ткани коллекции

1. заготовка узла мышцы
   1. усыпить принимающей мышей шейки матки вывихов и торакотомии, выполняется под общим наркозом, ведении настольная изофлюрановая испарителем, движимый медицинского кислорода ( ингаляционные изофлюрановая; 2-5% до эффекта). следователь также имеет IACUC утверждения для урожая та мышц под общим наркозом до эвтаназии.
   2. для доступа к принимающей TA мышцы, использовать хирургические ножницы для открытия кожи на передней поверхности ноги. Найдите TA мышцы в передней ногой, вырезать дистального сухожилия, отражают мышцы и вырезать проксимальной мышцы вложений (см. раздел 2.1).
   3. Собирать та права (контроль) и левой (экспериментальная) мышц.
2. Snap замораживания заготовленной мышцы
   1. весят заготовленной мышцы, поместив весят бумаги и весы.
   2. Кратко окунуть мышц в минеральное масло для криозащиты. Помарки избыток масла.
   3. Место мышц на алюминиевой фольги, привязки и заморозить мышцы, быстро, погружая их в жидком азоте заполнить Дьюара. Передавать образцы помечены криопробирки и хранить образцы в морозильной камере-80 ° C для более поздних исследований.

7. Гистологические исследования

1. Cryosectioning мышечной ткани для сбора последовательных поперечных сечений
   1. передачи образцов из морозильной камеры-80 ° C для криостата, помещая их в Дьюара с жидким азотом.
   2. В криостат, обрабатывать один образец одновременно. С холодной лезвием (лезвие, хранящиеся в криостата) разрезать образец дважды в середине живота TA мышц производить сегмент мышцы, которая составляет около 1-2 мм толщиной. Держите этот сегмент для создания секций криостат и вернуть его cryovial все остальные части мышцы.
   3. С оптимальной температуры вырезывания (OCT) Замораживание смеси, безопасного сегмента толстые ткани на диск образец криостата. Поместите диск образца на держатель образца.
   4. Грубой лицо образец резки 20 мкм секциями. Собрать несколько разделов 20 мкм на стеклянных вставках для криостата секций.
   5. Если качество 20 мкм разделов является удовлетворительным, изменить толщину резки до 5 мкм и собирать несколько разделов для оценки качества. Если секции 5 мкм удовлетворительного качества, соберите последовательные секции. Сбор 2-3 секции на слайд и собирать достаточно разделы для 3 горки.
   6. Собирать секции от экспериментальных (слева) и управления (справа) та мышцы каждого животного.
2. Экспрессия гена GFP в изучении
   Примечание: назначить один набор подготовленных слайдов (раздел 7.1) для изучения экспрессия гена GFP в мышечных волокон.
   1. Применить ~ 50 мкл анти затухания среды на участках и применить coverslip стекла. Уплотнение coverslip края с четкой лак.
   2. С помощью света и флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалы), изучить разделы с 10 X цель и соответствующий фильтр для визуализации GFP.
      1. Собрать цифровые изображения (~ 15) перекрывающихся поля зрения для покрытия всего сечения мышцы TA. Собирать фазы контрастность изображения для каждого из поля зрения путем переключения от флуоресценции в фазе контраст режим на микроскопе.
   3. Открыть изображения с подходящих изображений программное обеспечение, которое можно расположить отдельных изображений для создания единого составного изображения; например, использование " photomerge " опцию в меню файл в программе обработки изображений, перечисленные в Таблице материалов.
   4. Открыть изображения флуоресценции GFP с подходящий образ программного обеспечения для анализа (например, ImageJ). Круг отдельных мышечных волокон с использованием " ROI инструмент " и запись означает интенсивности флуоресценции для каждого волокна.
      1. Рассчитать интенсивность максимальная GFP (флуоресценции), принимая в среднем означают интенсивности флуоресценции 10 волокон, которые показывают высокая экспрессия гена GFP и нормальной морфологии. Вычислить % максимальной интенсивности GFP для каждого волокна путем деления интенсивность цветения означает для каждого волокна максимальной интенсивности GFP и умножения на 100. Табулирование результаты анализа GFP для каждой мышцы TA, как показано на рисунке 3E.
3. Изучение мышечных волокон целостности и myonuclear расположение Immunofluorescent маркировки десмин и 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), соответственно.
   Примечание: Назначьте один набор слайдов, подготовленный, как указано выше, для изучения маркировки десмин в мышечных волокон.
   1. Исправить разделы с 2% параформальдегида в PBS на 10 мин мыть секции три раза с PBS.
      Предупреждение: Носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при обработке при обработке параформальдегида.
   2. Блок-секций с 3% бычьего сывороточного альбумина разводят в PBS, содержащий 0,01% Тритон-X100 за 30 мин. Это блокирующие решение упоминается ниже как Основная разбавителя.
   3. Развести кролик анти десмин иммуноглобулина G (IgG) в первичных разбавителя (1: 200).
   4. После блокирования, применять разреженных первичных антител на секции и инкубировать на ночь в холодильник на ~ 4 ° C. мыть разделы раз (5 мин) с PBS, содержащие 0,1% тритон X-100. Это решение называется далее как первого буфера мытья.
   5. Мыть разделы 3 раза (5 мин на мыть) с PBS.
   6. Подготовка, вторичные антитела путем разбавления коза анти кролик IgG (спрягаются в красный Люминесцентную краску) в PBS, содержащий 0,01% Тритон X-100.
   7. Применить разбавленных вторичных антител на разделы и инкубации при комнатной температуре (~ 23 ° C) для 60 мин.
   8. Мыть раз разделы (5 мин) с первого буфера мытья. Вымойте разделы 3 раза (5 мин на мыть) с PBS.
   9. Применить DAPI на 3 мин мыть разделы 3 раза (1 мин на мыть) с PBS. Применить ~ 50 мкл анти затухания среды на участках и применить coverslip стекла. Уплотнение coverslip края с четкой лак.
   10. С помощью света и флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалы), исследование последовательных секций с 10 X цель и соответствующий фильтр для визуализации красный Люминесцентную краску.
   11. Сбора цифровых изображений (~ 15) перекрывающихся областей visual для покрытия всего сечения мышцы TA. Собирать изображения флуоресценции DAPI маркировки для каждой из поля зрения путем переключения на соответствующий фильтр параметр.
   12. Открытое и анализировать изображения с помощью подходящих изображений программное обеспечение, как описано в шагах 7.2.3 - 7.2.4.
       Примечание: Изучение изображений для определения, какие мышечных волокон, поврежденных (десмин отрицательные), который мышечных волокон имеют центральный нуклеации (десмин позитивные волокон, которые имеют DAPI-меченых ядер, расположенный внутри, а не периферически) и, какие области раздела воспаления или фиброза (районы, которые имеют много DAPI-меченых ядра сгруппированы вместе, но лишенной мышечных волокон).

Результаты

На 3 дня после MIME доноров EDL, который вживляется в MIME содержится внутри отсека мышцы TA хост (рисунок 2A–C). Как и ожидалось, сечений TA мышцы от доноров мышей, изучал под флуоресцентным Оптика, не показывать зеленой флуоресценцией, потому что они не выражают GFP (Рисунок 2D). Напротив сечений TA мышцы от принимающей мышей, которые не имплантируются с донорской ткани, показывают единый зеленый флуоресценции в TA мышечных волокон, как волокна Экспресс GFP (Рисунок 2E). В сечений мышц, насаждают MIME с донорами мышечной ткани есть линия демаркации между принимающей мышечных волокон (GFP +) и доноров мышечных волокон (GFP-). Фаза контрастность изображения visual поля, показанные на рисунке 2D–F представлены в рисунке 2E'–F' и предположить, что есть действительно мышечных волокон в регионах там, где нет GFP сигнал.

На 14 дней после MIME и BaCl₂ инъекции, изучая серийный крест секции TA мышцы, которые остались без маркировки или помечены с антителами к десмин (рис. 3), мы узнаем, что сигнал GFP выражается все мышечных волокон в неочищенные мышцы от принимающей мышей, но не в MIME-лечение мышц (красный десмин маркировки обнаруживает жизнеспособных мышечных волокон). В принимающей TA мышц, лечить с MIME и BaCl₂ инъекции, очевидна ультраструктур доноров клеток, полученных от присутствия многих desmin(+) мышечных волокон, которые показывают не обнаруженный сигнал GFP (рис. 3 c–D, 3 C' –D'). Химерных мышечных волокон, вытекающих из вероятно слияние принимающих стран и доноров миогенных клетки могут быть обнаружены на низких и умеренных уровней GFP флуоресценции выставлены эти волокна. Многочисленные химерных волокна появляются через весь диаметр TA мышц, предполагая, что донор СКС способны перенос нескольких сотен микрон в пределах epimysium принимающей мышцы. Количественный GFP + волокон показан на рисунке 3E. Рисунок 4 показывает высокое увеличение изображения последовательных поперечных сечений всего MIME + BaCl₂ лечение TA мышцы.

Рисунок 1 . Этапы в минимально инвазивной мышцы встраивания (MIME).
MIME проводится под общим наркозом. Она включает в себя размещение ~ 10 мг доноров мышцы (мышь EDL доноров) в растворе Рингера и связывая руководящих швы для своих целей (A). 18-иглы проходит через длинной оси принимающей мышцы (B) и ткани доноров обращается через иглу трек (C). Тканей донора слева встроен в принимающей мышц (D), руководящих швы нарезаются и отверстия иглой загерметизированы клеем ткани (E). Запечатанный иглы раны обозначаются стрелками (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Исследования TA мышцы через 3 дня после MIME.
Хост мышцы собраны через 3 дня после MIME; Примечание иглы марки на узле TA (стрелки; A-B). Далее данные подтверждают, что мыши внедренный доноров EDL укрывшимся в засаде в отсеке мышцы TA (B-C). Флуоресценции изображения TA мышц сечений показать не зеленый флуоресценции в мышцах TA одичал типа (D), яркий зеленый флуоресценции в ГЯП-GFP TA мышц (E)и различие между принимающей и доноров мышцы в ГЯП-GFP TA мышц на 3 дня После MIME (F). Фаза контрастность изображения поля зрения в D-F указаны в D'-F', соответственно. Красная линия в панели F и F' показывает линия демаркации между принимающей и донорских тканей. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 . Исследования TA мышцы через 14 дней после MIME.
Данные, собранные после MIME представлены 14 дней. Красный сигнал — от immunofluorescent маркировки десмин (позитивный сигнал для десмин обозначает, что myofibers являются жизнеспособными), синий сигнал от DAPI (пятна ядер), и зеленый сигнал от GFP. В TA управления мышц (правый задних конечностей) собирают от принимающей мыши, как ожидается почти все myofibers являются позитивными за десмин, предполагая, что эти myofibers являются жизнеспособными (A; красный сигнал). Кроме того, основываясь на DAPI окрашивание, очевидно, что myonuclei почти все myofibers периферически расположены, как и следовало ожидать в здоровые мышцы (A; синий сигнал). Серийный Секции управления TA мышцы показывают что, почти все мышечные волокна ярко-зеленый, подразумевая, что они являются позитивными для GFP. В MIME + BaCl₂ -лечение TA мышц (левый задних конечностей), доноров cell-mediated ультраструктур очевидно присутствие многих desmin(+) мышечных волокон, которые показывают не обнаружено флуоресценции GFP (C-D, C'-D'). Desmin(+) мышечных волокон с низкой до умеренной GFP флуоресцирования (химерных мышечных волокон) присутствуют через диаметр всего TA мышцы, предполагая, что MIME обеспечивает доноров SCs, которые могут мигрировать в пределах epimysium та мышцы и содействовать доноров клеток, полученных ультраструктур. A'-D' высокого увеличения изображения регионов в синие в A-D. В Eприведены количественный GFP(+) волокон и централизованно ядерных белков. Масштаб баров = 100 мкм (A-D) и 50 мкм (A'-D'). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

RC="/Files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg» / >
Рисунок 4 . Доказательств широкомасштабного ущерба и регенерации 14 дней после инъекции₂ MIME и BaCl.
Высокое увеличение, представлены последовательных поперечных сечений всего MIME + BaCl₂ лечение TA мышцы. Данные показывают, что многие мышечных волокон, которые являются умеренно или сильно GFP + централизованно расположена ядер (A-B; красный сигнал в A — от десмин, синий сигнал в A от DAPI, и зеленый сигнал в B от GFP). Эти данные позволяют предположить, что дегенерация и регенерации после BaCl₂ инъекции не влияет на экспрессия гена GFP. В этом контексте наличие централизованно ядерных мышечных волокон в MIME + BaCl₂ лечение TA мышц, с практически нет экспрессия гена GFP, предполагает, что эти волокна являются скорее всего результатом ультраструктур (или регенерации) с значительный вклад GFP - миогенных клетки. Эти наблюдения может быть проверен в высокое увеличение изображения выбранных полей (C-F; C и D и E и F, соответственно, перекрывающихся регионов от последовательных поперечных сечений; цветовое кодирование изображения границы обозначают местоположение этих регионов в A и B). Масштаб баров = 100 мкм (A-B) и 50 мкм (C-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы представляем подробный протокол для Роман экспериментальный метод, известный как MIME, разработанных в нашей лаборатории, чтобы имплантировать доноров мышечной ткани в принимающей мышечной ткани. Это адаптация открытым мышцы, прививка технику, которая уже доказала свою эффективность в содействии доноров cell-mediated ультраструктур в принимающей мышцы^9,10,17.

Цель MIME состоит не в том, чтобы включить приживления доноров мышечной ткани, сам в принимающей мышц (мы в настоящее время не знаю, если это происходит), а скорее представляют собой источник доноров SCs, которые могут способствовать ультраструктур в принимающей мышц в условиях, которые стимулируют м uscle регенерации. Мы надеемся, что после того, как MIME оптимизированы и испытаны в базовых и доклинических исследований, она может предоставить ценную информацию для руководства клинической терапии, направленной на увеличение регенерации мышц в скелетных мышц, которые подверглись потери миогенных мышцы.

Есть многочисленные вопросы, которые еще не ответили относительно как MIME могут быть переведены на клинической терапии, например: как бы мы контролируем качество ткани доноров? Как бы мы контролировать иммунной неприятие донорских тканей и клеток? Ли он оставить позади фиброзных рубцов или донорской ткани удаляется после предоставления ячейки для ультраструктур? Влияет ли тип волокна мышцы доноров и/или принимающих доноров cell-mediated ультраструктур? Какие мышцы можно практически выгоду от MIME? В настоящее время мы расширяем наши исследования, чтобы оценить, если MIME является безопасным и эффективным, определить добавочной лечения, которые могут дополнить доноров производные ультраструктур и ответить на многие из вопросов, перечисленных выше.

После завершения наших испытаний аллогенной трансплантации мышь с MIME, наш следующий шаг является для человека к мышь MIME с трупной человеческих тканей для оценки миогенных потенциал трупной мышечной ткани. Мы ожидаем, что эти эксперименты приведет к новой линии основных и трансляционного исследования, которое включает мышечную ткань от доноров, которые зарегистрированы в таких инициатив, как программа завещанию тело для образования и дар жизни программа донорства .

Репрезентативных данных, представленных в этой рукописи показывают, что на 14 дней после MIME, существует несколько жизнеспособной myofibers, которые либо не хватает GFP или имеют низкий уровень GFP. Наша интерпретация этих данных является, что клетки Спутниковое GFP-доноров способствовали ультраструктур в принимающей мышцы. Мы провели этот эксперимент в рамках подготовки к имплантации трупной тканей человека в принимающих мыши мышцы. Недвусмысленно продемонстрировать, что клетки Спутниковое доноров способствовать ультраструктур в принимающей мышц после MIME, было бы полезно для имплантата донорской ткани, которая выражает флуоресцентный репортер, который можно легко отличить от GFP (например, красный флуоресцирующий белок выражая донорской ткани имплантируется в GFP + хост мышц).

Этот метод ограничен главным образом характер СКС в донорской ткани. Если СКС в донорской ткани являются жизнеспособными, техника, вероятно облегчить доноров cell-mediated ультраструктур, хотя, если они не являются жизнеспособными, ультраструктур не может произойти. Однако поскольку СКС очень устойчивы и жизнеспособной для около 2 недель после смерти, это весьма вероятно, что в экспериментальных целях, донорской ткани, который вживляется в течение нескольких минут после сбора урожая будет способствовать доноров cell-mediated ультраструктур¹³ . Кроме того как упоминалось выше, вполне возможно, что после всей мышечной ткани (содержащий SCs, Зрелые мышечных волокон, а также мышц резидентов фибробластов) встроен в принимающей мышц, фиброз может произойти. Однако это предположение необходимо эпирически рассмотреть. Литература на повреждения мышц, вытекающих из вредные схватки, cryoinjury и экспериментальных myotoxins, свидетельствует о том, что клетки иммунной системы (главным образом, макрофаги) способны эффективно сотовой очищаемых от поврежденных волокон и Ремоделирование внеклеточная матрица¹⁸. Таким образом вполне возможно, что после инъекции₂ MIME и BaCl, до тех пор, как принимающей иммунные клетки имеют доступ к вырождающихся доноров мышечных волокон, они могут ясно мусора, оставив только доноров СКС. Наконец степень доноров производные ультраструктур зависит количество доноров мышечной ткани, внедренного в узел мышцы. Чтобы отсеке мышцы принимающей быть полностью заселён доноров клеток, полученных myofibers это потребует метод как X - или гамма облучения удалять принимающей мышцы СКС и также требуют повторных процедур MIME.

Было продемонстрировано, что хирургическим путем разоблачения принимающей мышц и ушивание кусок ткани доноров на хост мышц может облегчить доноров cell-mediated ультраструктур^9,10,17. Этот открытый хирургический подход использовала в прошлом для отслеживания прогрессирования ультраструктур и для создания модели мыши человеческих мышечных заболеваний. Новаторский аспект техника MIME является минимально инвазивной и не связаны с хирургическим путем разоблачения принимающей мышцы. Это уменьшает риск ятрогенные инфекции и степень дискомфорта в хост животных, таким образом делая его более целесообразно выполнять на мышц же принимающей неоднократно MIME, если необходимо.

Мы ожидаем, что метод MIME может быть подходящим уточнение открытых хирургических подхода, который в настоящее время следует имплантировать доноров мышечной ткани в принимающей мыши. Это может ускорить поколения гуманизированные мыши модели, путем встраивания биопсию человека мышцы в принимающей мыши мышц. Кроме того основываясь на наших предварительных данных от прививки мышь, мы ожидаем, что MIME будет эффективной в достижении доноров cell-mediated ультраструктур от человека трупной донорской ткани, пока доноров СКС жизнеспособной. Наконец дополнительного тестирования и проверки, мы надеемся, что метод MIME будет способствовать разработке новых терапий для содействия доноров cell-mediated ультраструктур у людей с заболеваниями мышц.

Успех метода MIME критически зависит именно внедрение донорской ткани в отсеке фасциальных (epimysium), принимающей мышцы. Только если ткани доноров размещается в отсеке мышцы хост, он будет иметь предоставлять принимающей мышцы СКС в точно. Если ткани доноров размещается вне принимающей мышц, неясно, каким будет его судьбу. В нашей экспериментальной модели для MIME мы используем TA мышцы как принимающей мышцы, так как это видно и поверхностно расположенных в аспекте переднебоковой ноги. Размер, ориентацию и анатомическое положение TA мышцы, делает его легко для подтверждения донорской ткани правильно размещается в пределах узла TA мышц после MIME. В этой статье, мы предоставили экспериментальные доказательства что донорской ткани reрозетки, встроенные в принимающей TA мышц в MIME после 3 дней и что там находится доноров cell-mediated ультраструктур в принимающей мышц на 14 дней после MIME.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NSG-GFP mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock #021937	Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock #000664	Control donor mice
Tabletop isoflurane vaporizer	VetEquip (Livermore, CA)	Item #901801	Inhaled anesthesia system
Magic depilatory crea	Softsheen Carson (New York, NY)	N/A	Razorless hair removal cream
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures	Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)	SUT106631	Guiding sutures for donor tissue
VetBond veterinary tissue adhesive	3M (Maplewood, MN)	Catalog #1469Sb	Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure
Barium chloride	Ricca Chemical Company (Arlington, TX)	Product #R0854000-500A 854-16	Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration
Deltaphase isothermal gel heating pad	Braintree Scientific (Braintree, MA)	Item #39DP	Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
HM525NX cryostat	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog #HM525NX	Cryostat to make frozen sections of muscle
Vectashield Antifade Medium	Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)	Catalog Number: H-1000	Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples
Rabbit anti Desmin Antibody	Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)	RB9014P	Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog#: A-21069	Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Seracare (Milford, MA)	Catalog #5930-0006 or 71-03-01	Reagent for fluorescent labeling of nuclei
Axio Scope.A1 microscope	Carl Zeiss (Peabody, MA)	Product #Axio Scope.A1	Light and fluorescence microscope
Photoshop CS4	Adobe Systems (San Jose, CA)	Photoshop CS4	Imaging Software for perform image tiling
Image J	National Institutes of Health (Bethesda, MD)	Image J for Windows 64-bit Operating System	Imaging Software for quantitative fluorescence analysis